一種利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法
【專利摘要】一種利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法。屬于生物表面活性劑生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法步驟為：（1）雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株的選育：將銅綠假單胞菌CICC10204經(jīng)活化及馴化培養(yǎng)后，篩選出雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株；（2）菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)：將優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)活化及擴(kuò)大培養(yǎng)后得到二級(jí)種子液；（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將二級(jí)種子液進(jìn)行雙碳源發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)；（4）分離提純：將發(fā)酵液通過(guò)離心法或膜過(guò)濾去除菌體及雜質(zhì)，再經(jīng)6K道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過(guò)蒸發(fā)濃縮去除水分，最終獲得鼠李糖脂工業(yè)化提純品。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了鼠李糖脂精制品的工業(yè)化生產(chǎn)，最終純化的鼠李糖脂經(jīng)濃縮可達(dá)90%以上。
【專利說(shuō)明】一種利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物表面活性劑生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠李糖脂是由微生物在特定的生長(zhǎng)條件下分泌的一種具有優(yōu)良表面活性的代謝產(chǎn)物，是一種對(duì)環(huán)境無(wú)害的天然表面活性劑。近年來(lái)，隨著鼠李糖脂在石油、農(nóng)業(yè)、污染環(huán)境治理以及要求更高的日化、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的成功實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，針對(duì)鼠李糖脂的研究也越來(lái)越廣泛和深入。從生產(chǎn)菌種的選育、培養(yǎng)基配方的優(yōu)化、發(fā)酵工藝及精制工藝的設(shè)計(jì)等，使鼠李糖脂在實(shí)驗(yàn)室水平的研究上日益成熟，提取的最高純度可達(dá)95%以上，這些研究為鼠李糖脂的品質(zhì)提高和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供了大量的科學(xué)依據(jù)。目前，鼠李糖脂發(fā)酵液的生產(chǎn)國(guó)內(nèi)已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但是純度更高可應(yīng)用于高端領(lǐng)域的鼠李糖脂精制品還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，主要原因是由于工業(yè)化產(chǎn)脂較高的發(fā)酵液主要是以植物油作為碳源，而利用植物油為碳源生產(chǎn)的發(fā)酵液往往殘油含量高，成品液體粘度大，乳化嚴(yán)重，常規(guī)方法難以破乳，要實(shí)現(xiàn)破乳就需要加入其他化學(xué)藥劑，新加入成分又會(huì)給后續(xù)分離提純帶來(lái)極大困難，所以一直以來(lái)，以植物油為碳源的工業(yè)化生產(chǎn)的后續(xù)分離提純問(wèn)題仍沒(méi)有解決，常用的可用于發(fā)酵液的分離提取方法也因?yàn)樗檬罄钐侵章蕵O低，精制成本過(guò)高而未能在工業(yè)上獲得應(yīng)用。
[0003]針對(duì)殘油含量高的問(wèn)題，亦有通過(guò)改變碳源的方式來(lái)優(yōu)化最終發(fā)酵液狀態(tài)的研究，相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道了其他碳源如葡萄糖、甘油、乙醇等進(jìn)行生產(chǎn)的實(shí)例，雖然這些研究從發(fā)酵液狀態(tài)的角度解決 了殘油高的問(wèn)題，但是由于鼠李糖脂產(chǎn)生菌為銅綠假單胞菌，油性碳源更利于誘導(dǎo)表面活性物質(zhì)的生成，而利用上述碳源生產(chǎn)的發(fā)酵液鼠李糖脂有效含量不高，產(chǎn)率低使得生產(chǎn)成本提高，這也是利用上述碳源其難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的原因。鼠李糖脂尤其是精制品的工業(yè)化生產(chǎn)空白，嚴(yán)重制約了鼠李糖脂這一綠色環(huán)保的活性劑在更廣泛領(lǐng)域的應(yīng)用，所以亟需一種鼠李糖脂生產(chǎn)方法，一方面解決產(chǎn)脂含量低的問(wèn)題，一方面解決后續(xù)分離提純的問(wèn)題。
[0004]此外，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂泡沫控制問(wèn)題也是工業(yè)化難點(diǎn)，由于發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生大量的泡沫，泡沫的溢出直接影響發(fā)酵過(guò)程的完整性，往往由于泡沫量過(guò)大無(wú)法控制而導(dǎo)致發(fā)酵液溢出，一方面料液損失同時(shí)增加染菌機(jī)會(huì)，另一方面由于泡沫影響氧傳遞也使得發(fā)酵過(guò)程微生物處于異常代謝狀態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)量下降或菌體自溶，所以鼠李糖脂工業(yè)化發(fā)酵泡沫控制問(wèn)題也是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定工業(yè)化發(fā)酵的關(guān)鍵，目前比較常用和有效的消泡方式是添加消泡劑或是利用機(jī)械攪拌槳消泡，消泡劑尤其是以發(fā)酵碳源作為消泡劑的消泡方式是比較有效的方式，如利用植物油作為消泡劑或是利用乙醇作為消泡劑，這里利用碳源作為消泡劑有一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)就是用量的問(wèn)題，如在大量泡沫產(chǎn)生的情況下，會(huì)導(dǎo)致消泡劑用量增加，對(duì)于植物油消泡就會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液殘油量增加，影響發(fā)酵液狀態(tài)增加分離純化難度；而以乙醇為消泡劑的消泡方式如想在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程完全控制泡沫，又容易出現(xiàn)乙醇加量過(guò)大的情況，導(dǎo)致菌體代謝異?；蚴蔷w死亡，影響發(fā)酵正常進(jìn)行，所以，對(duì)于工業(yè)發(fā)酵泡沫控制，如何實(shí)現(xiàn)減少泡沫的同時(shí)保證發(fā)酵過(guò)程穩(wěn)定以及獲取的初成品不會(huì)影響后續(xù)精制是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決【背景技術(shù)】中存在的問(wèn)題、實(shí)現(xiàn)鼠李糖脂精制品的工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明提供一種利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
[0006]該利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法的具體步驟如下:
(1)雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株的選育:將銅綠假單胞菌iPsGudomormsaeruginosa)CICC10204活化培養(yǎng)，將活化的菌株轉(zhuǎn)接至1#馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-60小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速150-200r/min，將培養(yǎng)后的菌液作為移接種子液以3%~5%的接種量接種至已滅菌的2#馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~60小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速15(T200r/min，再將經(jīng)2#馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液作為種子液以3%~5%的接種量接種至新配制并滅菌的1#馴化培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)48小時(shí)，1#馴化培養(yǎng)基和2#馴化培養(yǎng)基在菌株整個(gè)馴化過(guò)程是每隔48小時(shí)進(jìn)行交替使用(培養(yǎng)條件相同)，并按照上述方法共轉(zhuǎn)接6~10次，馴化培養(yǎng)結(jié)束；將馴化后得到的菌液稀釋分離，挑出若干支單菌落，進(jìn)行編號(hào)劃線培養(yǎng)，并逐一進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出2支產(chǎn)鼠李糖脂性能好、代謝油脂能力和乙醇耐受能力強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定的菌株轉(zhuǎn)接至保藏斜面(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)，作為雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株，4°C保存待用； (2)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(1)中得到的雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株斜面活化培養(yǎng)24-48小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，然后接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-36小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速15(T200r/min，得到一級(jí)種子液；按3~5%的接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到新配制的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~36小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速15(T200r/min，得到二級(jí)種子液；培養(yǎng)過(guò)程中的通風(fēng)量(m3/ m3.min)為 1: (0.6—1.0)；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中得到的二級(jí)種子液以3~5%接種量接入發(fā)酵罐內(nèi)已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度32~37°C，通風(fēng)量(m3/ m3.min)為1: (0.6~1.0)，攪拌轉(zhuǎn)速15(T220r/min，發(fā)酵過(guò)程pH值控制在6.3~7.2，培養(yǎng)120~148小時(shí)；其中0~30小時(shí)植物油用量2%~5%，濃度為20%~50%乙醇用量0.3~0.8% ;30小時(shí)后，開始流加濃度為20~50%的乙醇，每隔20-24小時(shí)流加一次，每次流加量為0.2~1%，直至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束；發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫的控制方法采用噴淋和瞬時(shí)壓差協(xié)同作用法:將發(fā)酵罐中的泡沫導(dǎo)入到消泡罐頂部，并通過(guò)孔徑為f2mm的泡沫噴淋頭噴淋到消泡罐內(nèi)，同時(shí)將高于消泡罐內(nèi)氣壓0.1-0.25MPa的無(wú)菌空氣瞬間釋放到消泡罐內(nèi)，待泡沫消除后停止釋放，將泡沫液化后的發(fā)酵液用蠕動(dòng)泵導(dǎo)回發(fā)酵罐；
(4)分離提純:將步驟(3)得到的發(fā)酵液通過(guò)離心法或膜過(guò)濾去除菌體及雜質(zhì)，再經(jīng)6K道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過(guò)蒸發(fā)濃縮去除水分，最終獲得鼠李糖脂工業(yè)化提純品。
[0007]所述步驟(1)中的1#馴化培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油3飛％，濃度為20~50%的乙醇0.1-1,葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.3~0.6%,牛肉膏0.1-0.4%, MgSO40.02~0.08%, KH2PO4 0.1-0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η20 0.00001 ~0.00003%，微量元素混合液0.3^0.8%，余量為水，培養(yǎng)基pH值7.0-7.2 ；2#馴化培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油1~3.5%，濃度為20~50%的乙醇1.5~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏 0.1~0.4%, MgSO4 0.02~0.08%, ΚΗ2Ρ04 0.1~0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η200.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量為水，培養(yǎng)基pH值7.0~7.2。
[0008]所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油2飛％，濃度為20%~50%的乙醇0.5~1%，葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.3~0.6%,牛肉膏0.1~0.4%, MgSO40.02~0.08%，ΚΗ2Ρ04 0.1~0.4%, NaCl 0.03~0.08%，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.00001 ~0.00003 %，微量元素混合液0.3^0.8%，余量為水，培養(yǎng)基pH值7.0-7.2。
[0009]所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油2飛％，濃度為20%~50%的乙醇0.3~0.8%,葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.2~0.5%,牛肉膏0.05~0.2%,MgSO4 0.02~0.06%, KH2PO4 0.06~0.2%, FeSO4.7H20 0.00001 ~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量為水，培養(yǎng)基ρΗ7.0~7.2。
[0010]所述的微量元素混合液的配方為(按質(zhì)量百分比)=MnSO4.H2O 0.01~0.02 %，CuSO4.5Η20 0.02~0.04%, CaCL2.6Η20 0.01~0.03 %，余量為水。
[0011]所述銅綠假單胞菌iPsGudomorms保藏在中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，可通過(guò)保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買獲得。
[0012]本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明使用的發(fā)酵菌種為經(jīng)雙相碳源馴化法馴化后的菌種，原出發(fā)菌株為銅綠假單胞菌(Fseudomorms aeruginosa) CICC10204,該菌種雙相碳源馴化法的特點(diǎn)是馴化培養(yǎng)基中除添加植物油(大豆油、玉米油、米糠油或菜籽油等)作為碳源外，還加入了乙醇作為碳源，即以植物油和乙醇作為雙相碳源。同時(shí)，在馴化培養(yǎng)過(guò)程中，采用乙醇兩種濃度交替馴化培養(yǎng)，即乙醇含量低的第一馴化培養(yǎng)基中的植物油含量略高，乙醇含量高的第二馴化培養(yǎng)基中的植物油含量略低，進(jìn)而保證碳源提供量平衡。經(jīng)上述方法馴化后的菌種，能夠適應(yīng)并有效利用植物油和乙醇做為雙碳源進(jìn)行發(fā)酵。原出發(fā)菌株經(jīng)馴化后，挑出若干支單菌落，然后逐一發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)植物油代謝情況、乙醇代謝情況、鼠李糖脂含量、微生物增殖情況、溶液表面張力等相關(guān)參數(shù)，從中篩選出二支產(chǎn)鼠李糖脂性能好、代謝油脂能力和乙醇耐受能力強(qiáng)和遺傳性能穩(wěn)定的菌株，即可作為雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株。
[0013]本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程采用雙相碳源分段錯(cuò)時(shí)供應(yīng)法，雙相碳源是指以植物油和乙醇作為碳源。雙相碳源分段錯(cuò)時(shí)供應(yīng)法的特點(diǎn)是在發(fā)酵開始0-30小時(shí)的初期，提供少量植物油碳源，用于菌體前期生長(zhǎng)；當(dāng)植物油代謝減少至30-50%時(shí)，即發(fā)酵30小時(shí)后，每隔20-24小時(shí)流加一次乙醇，該方法能夠使微生物對(duì)新碳源有一定的適應(yīng)期，防止因突然改變碳源而增加微生物適應(yīng)延滯期，影響發(fā)酵產(chǎn)率。雙相碳源分段錯(cuò)時(shí)供應(yīng)法結(jié)合了油脂發(fā)酵的高產(chǎn)脂優(yōu)勢(shì)和乙醇發(fā)酵的發(fā)酵液液體狀態(tài)優(yōu)化優(yōu)勢(shì)，通過(guò)調(diào)整碳源結(jié)構(gòu)和雙相碳源的分段錯(cuò)時(shí)提供，使生產(chǎn)菌更好、更有效的利用碳源，使微生物代謝鼠李糖脂的產(chǎn)率提高并促進(jìn)其定向代謝產(chǎn)生滿足于后續(xù)純化要求的發(fā)酵液，減少后續(xù)加工處理難度，從而大幅度降低精制品的生產(chǎn)成本。雙相碳源分段錯(cuò)時(shí)供應(yīng)法解決了單一油脂發(fā)酵液乳化嚴(yán)重、后續(xù)純化困難以及單一乙醇發(fā)酵產(chǎn)脂含量低的問(wèn)題。使用該方法進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵(裝液量18t)粗制品的鼠李糖脂含量可達(dá)60g/L，發(fā)酵液狀態(tài)為澄清透明，直接進(jìn)行膜過(guò)濾收率可達(dá)70%以上，極大地提高了工業(yè)化產(chǎn)率及后續(xù)提純收率，同時(shí)可節(jié)省鼠李糖脂生產(chǎn)成本20%以上。
[0014]本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中采用獨(dú)特的的泡沫控制方法——噴淋和瞬時(shí)壓差協(xié)同作用法，是一種綜合性泡沫控制工藝。該方法通過(guò)泡沫噴淋和瞬時(shí)壓差方式協(xié)同消泡，能夠有效控制泡沫量，提高消泡速度。瞬時(shí)壓差主要是利用泡沫在瞬間內(nèi)外壓力變化來(lái)使泡沫破滅的方式實(shí)現(xiàn)，當(dāng)泡沫量非常多，泡沫噴淋頭無(wú)法完全將泡沫轉(zhuǎn)變成液體時(shí)，將儲(chǔ)氣罐中的壓縮無(wú)菌空氣，迅速釋放到泡沫收集罐中，儲(chǔ)氣罐壓力要比泡沫罐內(nèi)壓力大
0.1-0.25MPa，操作的同時(shí)關(guān)閉發(fā)酵罐與泡沫收集罐的所有連通管路，壓力消泡過(guò)程I分鐘內(nèi)可完成操作，消泡率可達(dá)到60-80%，整個(gè)操作過(guò)程可采取人工或自控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。由于泡沫能夠迅速被液化并返回發(fā)酵系統(tǒng)，因而整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的環(huán)境條件和發(fā)酵裝液量不會(huì)有較大改變，最大限度的保證了發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定進(jìn)行。由于該方法不需添加植物油消泡劑或乙醇消泡劑，因而有效避免了因發(fā)酵液殘油量高造成的分離純化難度高以及因乙醇加量過(guò)大導(dǎo)致菌體代謝異?；蚴蔷w死亡的問(wèn)題。本發(fā)明的發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾和純后，能夠得到純度為50-90%的鼠李糖脂工業(yè)化提純品。
[0015]本發(fā)明的利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法實(shí)現(xiàn)了鼠李糖脂精制品的工業(yè)化生產(chǎn)，通過(guò)本方法發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂發(fā)酵液，液體呈透明狀態(tài)，培養(yǎng)底物殘留低，徹底改變了原來(lái)鼠李糖脂發(fā)酵液乳化嚴(yán)重的狀態(tài)，通過(guò)常規(guī)的膜過(guò)濾除菌及雜質(zhì)和蒸發(fā)濃縮去除水分的方式即可實(shí)現(xiàn)分離及純化，工藝更加簡(jiǎn)單，并且無(wú)需添加其他化學(xué)物質(zhì)，最終純化的鼠李糖脂經(jīng)濃縮可達(dá)90%以上。此外本發(fā)明提供的泡沫控制方法，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程無(wú)泡沫溢出情況，泡沫可被液化并迅速返回發(fā)酵系統(tǒng)，最大限度減少因環(huán)境條件改變?cè)斐傻陌l(fā)酵異常情況，通過(guò)本發(fā)明技術(shù)的實(shí)施，為高純品鼠李糖脂的制備提供了完整的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明的利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法所用裝置示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合圖1對(duì)本發(fā)明進(jìn)做進(jìn)一步說(shuō)明:
該利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法的具體步驟如下:
(I)雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株的選育:
將銅綠假單胞菌iPsGudomorms aeruginosa ) CICC10204活化培養(yǎng)，將活化的菌株轉(zhuǎn)接至1#馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速200r/min，將培養(yǎng)后的菌液作為移接種子液以5%的接種量接種至已滅菌的2#馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速200r/min，再將經(jīng)2#馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液作為種子液以5%的接種量接種至新配制并滅菌的1#馴化培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)48小時(shí)，馴化培養(yǎng)過(guò)程溫度和轉(zhuǎn)速條件均相同，共進(jìn)行8次，其中1、3、5、7次使用1#馴化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，2、4、6、8次使用2#馴化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；獲得的最終培養(yǎng)菌液即為經(jīng)雙相碳源馴化后所得菌懸液。將獲得的馴化培養(yǎng)菌懸液進(jìn)行稀釋分離，涂布平板后培養(yǎng)(平板用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基)，挑出若干單菌落，進(jìn)行編號(hào)劃線培養(yǎng)，并分別進(jìn)行小試試驗(yàn)，平行試驗(yàn)三組，通過(guò)檢測(cè)鼠李糖脂含量和發(fā)酵液表面張力來(lái)選擇目標(biāo)優(yōu)勢(shì)菌，鼠李糖脂含量采用3，5- 二羥基甲苯硫酸比色法檢測(cè)，含量高的作為優(yōu)選；測(cè)定表面張力時(shí)溶液稀釋同等倍數(shù)，取表面張力數(shù)值低的作為優(yōu)選。篩選出的優(yōu)良菌株用牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基于4 °C冰箱中保存。
[0018]其中，活化培養(yǎng)基配方(為按質(zhì)量百分比):牛肉膏0.5%;蛋白胨l%;NaCl 0.5%;瓊脂2%，余量為水；培養(yǎng)基pH值7.0~7.2。
[0019]1#馴化培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油3~6%，濃度為20~50%的乙醇0.1-1%,葡萄糖 0.2~0.5%，蛋白胨 0.3~0.6%，牛肉膏 0.1-0.4%, MgSO4 0.02~0.08%, KH2PO4
0.1-0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η20 0.0OOOl~0.00003%，微量元素混合液 0.3~0.8%,余量為水；培養(yǎng)基PH值7.0-7.2。
[0020]2#馴化培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油1~3.5%，濃度為20~50%的乙醇
1.5 ~5%，葡萄糖 0.2~0.5%，蛋白胨 0.3~0.6%，牛肉膏 0.1-0.4%, MgSO4 0.02~0.08%, ΚΗ2Ρ040.1-0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η20 0.0001-0.00003 %，微量元素混合液 0.3~0.8%,余量為水；培養(yǎng)基PH值7.0-7.2。
[0021]保藏斜面培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比):牛肉膏0.5% ;蛋白胨1% ；NaCl 0.5% ;瓊月旨2%，余量為水；培養(yǎng)基pH值為7.0~7.2。
[0022]微量元素混合液的配方為(按質(zhì)量百分比)=MnSO4.H2O 0.01-0.02 %，CuSO4.5Η200.02~0.04%, CaCL2.6Η20 0.01-0.03 %，余量為水。
[0023]培養(yǎng)基及乙醇滅菌方法:培養(yǎng)基配制成溶液后采用高壓蒸汽滅菌的方式，121°C滅菌20分鐘。乙醇采用膜過(guò)濾除菌，膜采用0.1Mffl聚四氟乙烯薄膜。以下其它步驟中的培養(yǎng)基及乙醇滅菌方法均相同。
[0024](2)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng):
將步驟(1)中得到的雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株斜面活化培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)溫度35°C，然后接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速200r/min，得到一級(jí)種子液；按5%的接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到新配制的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速200r/min,得到二級(jí)種子液；培養(yǎng)過(guò)程中的通風(fēng)量(m3/ m3.min)為1:0.8。
[0025]其中，該步驟采用的活化培養(yǎng)基配方與步驟(1)中的活化培養(yǎng)基配方相同。
[0026]種子培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油2飛％，濃度為20%~50%的乙醇
0.5~1%，葡萄糖 0.2~0.5%，蛋白胨 0.3~0.6%，牛肉膏 0.1-0.4%, MgSO4 0.02~0.08%, ΚΗ2Ρ04
0.1-0.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η20 0.0001-0.00003 %，微量元素混合液 0.3~0.8%,余量為水，培養(yǎng)基PH值7.0-7.2。
[0027](3)發(fā)酵培養(yǎng):
將步驟(2)中得到的二級(jí)種子液以5%接種量接入到18t發(fā)酵罐內(nèi)已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度35°C，通風(fēng)量(m3/ m3*min)為1:0.8，攪拌轉(zhuǎn)速220r/min，發(fā)酵過(guò)程pH值控制在7.0,培養(yǎng)148小時(shí)；其中0-30小時(shí)植物油用量5%，濃度為40%乙醇用量0.6% ；30小時(shí)后，開始流加濃度為45%的乙醇，每隔24小時(shí)流加一次，每次流加量為0.8%,直至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束；發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫的控制方法采用噴淋和瞬時(shí)壓差協(xié)同作用法:將發(fā)酵罐中的泡沫導(dǎo)入到消泡罐頂部，并通過(guò)孔徑為f2mm的泡沫噴淋頭噴淋到消泡罐內(nèi)，同時(shí)將高于消泡罐內(nèi)氣壓0.1-0.25MPa的無(wú)菌空氣瞬間釋放到消泡罐內(nèi)，待泡沫消除后停止釋放，將泡沫液化后的發(fā)酵液用蠕動(dòng)泵導(dǎo)回發(fā)酵罐。發(fā)酵后測(cè)得發(fā)酵液鼠李糖脂含量為6.5%.(采用3.5-二羥基甲苯硫酸法)。
[0028]其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油2飛％，濃度為20%~50%的乙醇0.3~0.8%,葡萄糖 0.2~0.5%，蛋白胨 0.2~0.5%，牛肉膏 0.05~0.2%,MgSO4 0.02~0.06%, KH2PO4
0.06~0.2%, FeSO4.7H20 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%,余量為水，培養(yǎng)基ρΗ7.0~7.2。
[0029] 該步驟在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中采用獨(dú)特的的泡沫控制方法——噴淋和瞬時(shí)壓差協(xié)同作用法，是一種綜合性泡沫控制工藝。當(dāng)發(fā)酵罐中泡沫到達(dá)罐頂后通過(guò)管道經(jīng)過(guò)泡沫噴嘴以噴霧的形式噴淋至泡沫收集罐，實(shí)現(xiàn)初步的液化，此過(guò)程在發(fā)酵72小時(shí)內(nèi)可對(duì)泡沫實(shí)現(xiàn)有效控制，隨著發(fā)酵的繼續(xù)泡沫量會(huì)持續(xù)增加，當(dāng)泡沫高度到達(dá)收集罐三分之二高度時(shí)，由儲(chǔ)氣罐向泡沫罐內(nèi)通入無(wú)菌壓縮空氣，進(jìn)一步進(jìn)行消泡，液化的泡沫通過(guò)蠕動(dòng)泵重新回到發(fā)酵罐中。其中噴嘴根據(jù)罐壓進(jìn)行數(shù)量確定，以最終可噴成穩(wěn)定霧狀并可正常通風(fēng)為標(biāo)準(zhǔn)，噴頭孔徑選1.5mm。該方法通過(guò)泡沫噴淋和瞬時(shí)壓差方式協(xié)同消泡，能夠有效控制泡沫量，提高消泡速度。瞬時(shí)壓差主要是利用泡沫在瞬間內(nèi)外壓力變化來(lái)使泡沫破滅的方式實(shí)現(xiàn)，當(dāng)泡沫量非常多，泡沫噴淋頭無(wú)法完全將泡沫轉(zhuǎn)變成液體時(shí)，將儲(chǔ)氣罐中的壓縮無(wú)菌空氣，迅速釋放到泡沫收集罐中，儲(chǔ)氣罐壓力要比泡沫罐內(nèi)壓力大0.1-0.25MPa，操作的同時(shí)關(guān)閉發(fā)酵罐與泡沫收集罐的所有連通管路，壓力消泡過(guò)程I分鐘內(nèi)可完成操作，消泡率可達(dá)到60-80%，整個(gè)操作過(guò)程可采取人工或自控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。由于泡沫能夠迅速被液化并返回發(fā)酵系統(tǒng)，因而整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的環(huán)境條件和發(fā)酵裝液量不會(huì)有較大改變，最大限度的保證了發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定進(jìn)行。由于該方法不需添加植物油消泡劑或乙醇消泡劑，因而有效避免了因發(fā)酵液殘油量高造成的分離純化難度高以及因乙醇加量過(guò)大導(dǎo)致菌體代謝異常或是菌體死亡的問(wèn)題。
[0030]噴淋和瞬時(shí)壓差協(xié)同作用法所采用的裝置連接關(guān)系及工作流程如下:壓縮空氣通過(guò)預(yù)過(guò)濾器和精過(guò)濾器除菌后直接進(jìn)入儲(chǔ)氣罐，儲(chǔ)氣罐氣體在泡沫布滿消泡罐釋放到消泡罐中，同時(shí)儲(chǔ)氣罐中再補(bǔ)充氣體。儲(chǔ)氣罐氣體釋放到發(fā)酵罐中，直接靠壓力消泡，減少發(fā)酵罐中泡沫量，同時(shí)發(fā)酵罐中上部放氣閥手動(dòng)調(diào)節(jié)，防止因氣體進(jìn)入罐內(nèi)壓力過(guò)大，最終發(fā)酵罐內(nèi)壓力保持在0.05-0.1 MPa。發(fā)酵罐底部與消泡罐底部管線相連，通過(guò)閥門控制開合，主要用于泡沫在消泡罐液化后，液體輸送回發(fā)酵罐中繼續(xù)參與發(fā)酵。液體流向從消泡罐到發(fā)酵罐，為防止發(fā)酵罐內(nèi)液體流向消泡罐，蠕動(dòng)泵未啟動(dòng)時(shí)底部閥門應(yīng)處于關(guān)閉狀態(tài)。發(fā)酵罐頂部主管線分成兩條支路分別與消泡罐頂部和儲(chǔ)氣罐頂部相連，消泡罐頂部另有一條管線與儲(chǔ)氣罐頂部相連。與消泡罐相連的管線在進(jìn)入消泡罐前分成兩條支線，主要用于發(fā)酵罐頂部泡沫產(chǎn)生量大，溢出時(shí)的泡沫輸出，使其進(jìn)入消泡罐，泡沫量少時(shí)直接進(jìn)入消泡罐，再?gòu)牡撞客ㄟ^(guò)蠕動(dòng)泵輸送回發(fā)酵罐，當(dāng)泡沫量大，消泡罐內(nèi)布滿泡沫無(wú)法控制時(shí)，泡沫需要通過(guò)帶有噴淋頭的管路進(jìn)入到消泡罐中，以加速泡沫液化，同時(shí)關(guān)閉直接進(jìn)入消泡罐的管路，并將儲(chǔ)氣罐中的壓縮。
[0031](4)分離提純:
將步驟(3)得到的發(fā)酵液通過(guò)離心法或膜過(guò)濾去除菌體及雜質(zhì)，再經(jīng)6K道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖，其中微濾膜0.2Mm，過(guò)濾壓力0.1-0.15mpa，超濾膜0.6萬(wàn)道爾頓，過(guò)濾壓力0.12-0.15mpa。將收集到的濾液通過(guò)蒸發(fā)濃縮去除水分，最終獲得純度為90%的鼠李糖脂工業(yè)化提純品。
【權(quán)利要求】
1.一種利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于:該方法的具體步驟如下: (1)雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株的選育:將銅綠假單胞菌iPsGudomormsaeruginosa)CICC10204活化培養(yǎng)，將活化的菌株轉(zhuǎn)接至1#馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~60小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速150~200r/min，將培養(yǎng)后的菌液作為移接種子液以3%~5%的接種量接種至已滅菌的2#馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~60小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速150~200r/min，再將經(jīng)2#馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液作為種子液以3%~5%的接種量接種至新配制并滅菌的1#馴化培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)48小時(shí)，1#馴化培養(yǎng)基和2#馴化培養(yǎng)基在菌株整個(gè)馴化過(guò)程是每隔48小時(shí)進(jìn)行交替使用(培養(yǎng)條件相同)，并按照上述方法共轉(zhuǎn)接6~10次，馴化培養(yǎng)結(jié)束；將馴化后得到的菌液稀釋分離，挑出若干支單菌落，進(jìn)行編號(hào)劃線培養(yǎng)，并逐一進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出2支產(chǎn)鼠李糖脂性能好、代謝油脂能力和乙醇耐受能力強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定的菌株轉(zhuǎn)接至保藏斜面(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)，作為雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株，4°C保存待用； (2)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng):將步驟(1)中得到的雙相碳源優(yōu)勢(shì)菌株斜面活化培養(yǎng)24~48小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，然后接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~36小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速150~200r/min，得到一級(jí)種子液；按3~5%的接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接到新配制的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~36小時(shí)，培養(yǎng)溫度32~37°C，轉(zhuǎn)速150~200r/min，得到二級(jí)種子液；養(yǎng)過(guò)程中的通風(fēng)量(m3/ m3.min)為 1: (0.6—1.0)； (3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中得到的二級(jí)種子液以3~5%接種量接入發(fā)酵罐內(nèi)已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度32~37°C，通風(fēng)量(m3/ m3.min)為1: (0.6~1.0)，攪拌轉(zhuǎn)速150~220r/min，發(fā)酵過(guò)程pH值控制在6.3~7.2，培養(yǎng)120~148小時(shí)；其中0~30小時(shí)植物油用量2%~5%，濃度為20%~50%乙醇用量0.3~0.8% ;30小時(shí)后，開始流加濃度為20~50%的乙醇，每隔20-24小時(shí)流加一次，每次流加量為0.2~1%,直至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束；發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫的控制方法采用噴淋和瞬時(shí)壓差協(xié)同作用法:將發(fā)酵罐中的泡沫導(dǎo)入到消泡罐頂部，并通過(guò)孔徑為f2mm的泡沫噴淋頭噴淋到消泡罐內(nèi)，同時(shí)將高于消泡罐內(nèi)氣壓0.1~0.25MPa的無(wú)菌空氣瞬間釋放到消泡罐內(nèi)，待泡沫消除后停止釋放，將泡沫液化后的發(fā)酵液用蠕動(dòng)泵導(dǎo)回發(fā)酵罐； (4)分離提純:將步驟(3)得到的發(fā)酵液通過(guò)離心法或膜過(guò)濾去除菌體及雜質(zhì)，再經(jīng)6K道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過(guò)蒸發(fā)濃縮去除水分，最終獲得鼠李糖脂工業(yè)化提純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(1)中的1#馴化培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油3~6％，濃度為20~50%的乙醇0.1~1%,葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.3~0.6%,牛肉膏0.1~θ.4%, MgSO40.02~0.08%, KH2PO4 0.1~θ.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η20 0.00001 ~0.00003%，微量元素混合液0.3~0.8%，余量為水，培養(yǎng)基pH值7.0-7.2 ；2#馴化培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油1~3.5%，濃度為20~50%的乙醇1.5~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏 0.1~θ.4%, MgSO4 0.02~0.08%, ΚΗ2Ρ04 0.1~θ.4%, NaCl 0.03~0.08%, FeSO4.7Η200.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量為水，培養(yǎng)基pH值7.0~7.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油2~5％，濃度為20%~50%的乙醇0.5~1%，葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.3~0.6%,牛肉膏0.θ.4%, MgSO4`0.02~0.08%，ΚΗ2Ρ04 0.θ.4%, NaCl 0.03~0.08%，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.0OOOl~0.00003 %，微量元素混合液0.3^0.8%，余量為水，培養(yǎng)基pH值7.0-7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于:所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(按質(zhì)量百分比):植物油2飛％，濃度為20%~50%的乙醇0.3~0.8%,葡萄糖0.2~0.5%,蛋白胨0.2~0.5%,牛肉膏0.05~0.2%,MgSO4 0.02~0.06%, KH2PO4 0.06~0.2%, FeSO4.7H20 0.00001 ~0.00003 %，微量元素混合液`0.3~0.8%，余量為水，培養(yǎng)基ρΗ7.0~7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的利用雙相碳源發(fā)酵制備鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的微量元素混合液的配方為(按質(zhì)量百分比)=MnSO4.H2O 0.ΟΟ.02 %，CuSO4.5Η20 0.0 2~0.04%, CaCL2.6Η20 0.θθ.03 %，余量為水。
【文檔編號(hào)】C12P19/44GK103966282SQ201410211216
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】陳韶軍, 黃玉才, 于洋, 隋志強(qiáng), 張燁, 金艷方, 白麗莉, 王延兵 申請(qǐng)人:大慶沃太斯化工有限公司