用于提高農(nóng)作物抗逆特性的逆境調(diào)控基因HsCBL8及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于提高農(nóng)作物抗逆特性的逆境調(diào)控基因HsCBL8，具有序列表SEQ IDNo.1所示的序列。相應的，本發(fā)明公開了所述基因的克隆方法。本發(fā)明公開的逆境調(diào)控基因HsCBL8是多種農(nóng)作物的生物和非生物脅迫響應途徑的上游基因，能調(diào)控多種逆境的應激反應，顯著有益于作物的抗逆境育種研究。
【專利說明】用于提高農(nóng)作物抗逆特性的逆境調(diào)控基因HsCBL8及其克 隆方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠提高作物抗逆特性的調(diào)控基因，屬于生物育種與分子生物學 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 復雜多樣的自然環(huán)境，一直是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要外界因素，諸如干旱、 凍害、鹽漬、酸性土壤等是植物在自然界遭受的主要環(huán)境脅迫因子，嚴重影響作物的生長與 產(chǎn)量，尤其近些年頻發(fā)的災害天氣嚴重影響作物的產(chǎn)量。
[0003] 針對上述問題，主要的解決方案主要有兩種，一種是下大力度改善自然生長條件， 例如改善土壤品質(zhì)、提高森林密度防止極端天氣的發(fā)生等，但此種方法多緩不濟急，需要多 年長期投資才能實現(xiàn)，只具有宏觀意義，對于具體的農(nóng)作物種植收效不大；另一種方法是提 高農(nóng)作物自身的抗性，也就是通過自然雜交、人工雜交、突變篩選、基因工程等方法獲得具 有抗逆特性的植物品種。
[0004] 目前，作物的非生物逆境抗性/耐性育種主要集中在以下幾個方面：1.栽培作物 與近緣野生抗逆物種雜交獲得抗逆境特性；2.采用篩選突變體的方式（X-射線、化學和物 理致突機制）獲得抗逆境特性；3.把模式植物（如擬南芥和水稻等）中的已知有抗逆境 功能的基因?qū)胱魑铽@得抗逆境特性；4.從作物野生資源中克隆抗逆基因，而后把該基 因?qū)胱魑镏蝎@得抗逆境特性。其中，從野生資源中克隆抗逆途徑中的基因來進行作物 的抗逆境育種是最有效的育種途徑，已有的研究都是致力于研究逆境響應途徑的下游基 因，如甜菜堿合成酶（評8(1；^66 6七31.2005)、液泡逆向轉(zhuǎn)運體（似+/!1+3111：丨口〇1^61')(31116七 al.2000)和低親和 Na+轉(zhuǎn)運體 HKTl(Uozumi et al.2000;Rus et al.2001)等。
[0005] 已有的基因工程實踐證明，采用下游基因很難解決逆境抗性分子育種的難題 (Bhatnagar-Mathur et al. 2008)，即使經(jīng)過了基因改造，栽培水稻、小麥、玉米等作物在逆 境（干旱、水澇、鹽堿等）下減產(chǎn)、絕收等情況時有出現(xiàn)，這些在很大程度上影響了作物的產(chǎn) 量，甚至有些地區(qū)不能種植糧食作物。
[0006] 因此，本領(lǐng)域急切需要找到有效的技術(shù)方法，提高作物的抗/耐逆境特性，從而進 一步改良作物，實現(xiàn)作物在逆境條件下的產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，應對當前多變的氣候和環(huán)境 災害。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 申請人:仔細研究了多種已知植物對外界惡劣環(huán)境的脅迫響應，發(fā)現(xiàn)類鈣調(diào)磷酸酶 B蛋白（calcineurin B-like protein(CBL)是多種生物和非生物脅迫響應途徑的上游基 因，能調(diào)控多種逆境的應激反應，尤其是干旱、鹽、冷等脅迫。因此， 申請人:通過現(xiàn)代基因工 程的方法從在惡劣環(huán)境中生存的野生大麥中克隆了 HsCBL8基因，具有逆境抗性響應特性， 在高鹽、低溫和高酸脅迫具有功能，從而為作物的抗逆育種提供最有效的育種途徑。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 用于提高農(nóng)作物抗逆特性的逆境調(diào)控基因 HsCBL8,具有序列表SEQ ID No. 1所示 的編碼序列，其具有序列表SEQ ID No. 2所示的編碼區(qū)域，并表達序列表SEQ ID No. 3所示 的氨基酸序列。
[0010] 上述基因是以高鹽、酸性、低溫環(huán)境下生存的野大麥幼苗的生物基因組為基礎(chǔ)，并 通過已知的水稻、擬南芥、高粱、小麥等植物的同源性CBL基因序列設(shè)計的引物進行擴增 的，從而可確定其也具有顯著的抗逆特性。
[0011] 在上述基礎(chǔ)上， 申請人:對逆境下生長的野生小麥的CDNA進行了深入研究，從而得 到了其編碼區(qū)域兩端的非翻譯區(qū)（UTR)和相連接的啟動子區(qū)域，具有序列表SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5所示的3' UTR區(qū)、5' UTR區(qū)和啟動子區(qū)，該序列含有與逆境、激素等信號互作 的功能區(qū)域。
[0012] 相應的，本發(fā)明還公開了所述逆境調(diào)控基因 HsCBLS的克隆方法，是以在3種逆境 脅迫下生長的野生大麥為材料，通過簡并引物PCR、普通PCR和3'-RACE獲得該基因的部分 cDNA以及相應的在逆境脅迫中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用的編碼區(qū)基因組DNA ;并在此基礎(chǔ)上通 過反向巢式PCR獲得該基因的5'UTR區(qū)和啟動子區(qū)。所得到的HsCBL8在高鹽、低溫和高酸 脅迫下具有功能，是重要的逆境響應調(diào)控因子。
[0013] 本發(fā)明的基因不僅可以通過克隆方法得到，也可以通過基因組測序或通過cDNA 庫測序獲得該基因，本發(fā)明所提供的方法是 申請人:得到該基因序列的方法。
[0014] 具體的，逆境調(diào)控基因 HsCBLS的克隆方法包括下述步驟：
[0015] 1)從野生大麥中獲得全基因組RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA ;
[0016] 2)利用簡并引物HsCBLS、HsCBLA，采用PCR方法擴增步驟1)的cDNA ;
[0017] 3)利用引物HsCBL8S、HsCBL8A，采用PCR方法擴增步驟2)所得序列從而獲得逆境 調(diào)控基因 HsCBL8的編碼序列。
[0018] 在上述方法中，簡并引物PCR是根據(jù)與目標物種具有同源性的基因保守區(qū)域設(shè)計 引物，進行PCR擴增獲得目的片段。
[0019] 其中，所用的簡并引物序列為
[0020] HsCBLS :5' 一 GMGACWGYBTTSAGYGTDAGTGAA - 3'、
[0021] HsCBLA ：5' - GHTYYRYRTCWGCKTCCTCAAA - 3'；
[0022] 其中，M = A/C ;R = A/G ;W = A/T ;S = G/C ;Y = C/T ;K = G/T ;V = A/G/C ;H = A/C/T ;D = A/G/T ;B = G/C/T ;N = A/G/C/T。
[0023] 上述的含義是對應字母位置可以采用所給定的堿基中的一種，例如字母A位置的 堿基可以是A或C。
[0024] 步驟3)采用的是常規(guī)PCR方法，采用的PCR引物序列如下所示：
[0025] HsCBL8S :5' 一 ATCTAGA(Xba I)CTTTTCCCTCGTCATTACCATGT - 3'、
[0026] HsCBL8A :5' 一 TGGTACC(KpN I)ATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG - 3'。
[0027] 在上述基礎(chǔ)上，該克隆方法還包括下述步驟：
[0028] 通過3 ' -RACE獲得cDNA的3 ' UTR區(qū)，通過反向巢式PCR獲得cDNA的5 ' UTR區(qū)和 啟動子區(qū)域。
[0029] 在上述方法中，3' -RACE是用來實現(xiàn)CDNA3'端的快速克??；反向巢式PCR是用反 向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列，同時利用兩套PCR引物對（巢式引物）進行 兩輪PCR擴增反應，其中ICBL81S和ICBL81A為第一輪擴增用，ICBL82S和ICBL82A為第二 輪擴增用。
[0030] 具體的，所用引物組合如下所示：
[0031] 反向巢式PCR引物：
[0032] ICBL81S CCTATCTGCTGCTGCTGCCGCCA、
[0033] ICBL81A CCATCCGCTCCGTCCTTCTTCCT ；
[0034] ICBL82S CATCACGGATTTGGATTTCGCCCAA、
[0035] ICBL82A CTTCTTCGCCCTCACCGACTGCCT。
[0036] 3' -RACE 引物：
[0037] CBL83RACRS TGAGACAGACTGGCTTTATTGAG
[0038] CBL83RACRA GGCCACGCGTCGACTAGTAC
[0039] 在本發(fā)明中，各PCR過程所用的反應條件為本領(lǐng)域常規(guī)條件，無特別要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1、圖2分別為本發(fā)明的HSCBL8基因表達的氨基酸與FLbaf27i23的氨基酸對比 圖、本發(fā)明的HSCBL8基因堿基序列與栽培大麥FLbaf27i23的基因片段堿基序列對比圖。

【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體的克隆過程，對本發(fā)明的逆境調(diào)控基因 HsCBLS進行詳細闡述。
[0042] 首先是獲得cDNA :將青藏高原一年生野大麥種子通過細沙培養(yǎng)至3葉期，移植到 液體培養(yǎng)器皿中，采用高鹽（200mM)、低pH值（4. 0)和低溫（0-4°C )處理72小時，取幼苗 整株采用TaKaRa RNAiso Plus提取提取總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶（Takara，大連，D2680S) 合成cDNA第一鏈。
[0043] cDNA的合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍掌握的，具體到本發(fā)明，第一鏈的合成反應體 系如下：
[0044] Total RNA 1 μ 1
[0045] 5XM-MLV Buffer 2μ 1
[0046] Oligod(T)/接頭（ΙΟμΜ) 1 μ 1
[0047] dNTP Mixture (lOmM each) 1 μ 1
[0048] RNase Inhibitor 0.25 μ 1
[0049] Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200U/ul) 0.25 μ 1
[0050] RNase Free dH20 4. 5 μ 1
[0051] 反轉(zhuǎn)錄程序為：42°C 60min，70°C 15min。
[0052] 其中，接頭序列為：GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
[0053] 然后設(shè)計cDNA擴增用的兼并引物，設(shè)計方法為根據(jù)NCBI :http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 和大麥數(shù)據(jù)庫 http://www. shigen. nig. ac. jp/barley/ 中的水稻、擬南芥、高粱、 小麥等植物的CBL基因序列的同源性，在保守區(qū)設(shè)計簡并引物：
[0054] HsCBLS : 5'GMGACWGYBTTSAGYGTDAGTGAA3' ；
[0055] HsCBLA :5' GHTYYRYRTCWGCKTCCTCAAA3'。
[0056] 其中，μ = A/C、R = A/G、W = A/T、S = G/C、Y = C/T、K = G/T、V = A/G/C、Η = A/C/T、D = A/G/T、B = G/C/T、N = A/G/C/T。
[0057] 在得到上述簡并引物后，采用簡并引物PCR (Degenerate Primer)方法獲得 HsCBL8基因 cDNA的部分序列（494bp)，如SEQ IDNo. 6所示。
[0058] 簡并引物 PCR 反應程序為：94°C預變性 5min，（94°C 10s，65°C-60°C 20s，72°C lmin，10 個循環(huán)，每個循環(huán)溫度降低 0.5°C)(94°C 10s，60°C 20s，72°C lmin)25 個循環(huán)， 72。。 lOmin。
[0059] 將該部分片段通過 Barley DB(http://www. shigen. nig. ac. jp/barley/)數(shù)據(jù)庫 進行Blastn比對，發(fā)現(xiàn)該片段序列與栽培大麥FLbaf27i23 (AK249292)的部分連續(xù)片段完 全一致。
[0060] 在上述基礎(chǔ)上，利用Primer5. 0直接設(shè)計如下PCR引物：
[0061] HsCBL8S :5'ATCTAGA CTTTTCCCTCGTCATTACCATGT3'
[0062] HsCBL8A :5' TGGTACC ATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG3'，
[0063] 對上述cDNA片段進行擴增得到基因編碼區(qū)DNA，如SEQ IDNo. 1所示，該序列全長 2084bp，含有8個外顯子和七個內(nèi)含子，編碼區(qū)全長876bp。
[0064] PCR 反應程序為：94°C預變性 5min，（94°C 10s，55°C 20s，72°C 3min)30 個循環(huán)， 72。。 lOmin。
[0065] 上述PCR反應體系是本領(lǐng)域常用的，具體的如下所示：
[0066] 校板 d)\l 1 μ 1 ΙΟχΙ,Λ PCK Buffer δμ I TaKaRa Ι.Λ Taq(5l；/ul) 0. 25 P 1 游引物（1〇μΜ) IP 1 卜游引物（1〇U\〇 1 μ 1 clXTP Mixture (10mM each) 1 μ 1 _ 40. 75 μ 1
[0067] 通過上述克隆猴，全長DNA序列如下所示，其中下劃線區(qū)域為內(nèi)含子：
[0068] ATGTGCGCGCCCCCAAAAAAGACACGGCCCGCCGTCGACCACGCGGGCAAGTCGTGGCGGCAGCAGCAG CAGATAGGAGGGGGCGCCGCCATGGCCTCACGCTTCGGCTTCCGCATCTCCTCCGGCGACCTG GTAGGTGGCTCGC CCGGCTGCGGCCCTCGCCTTCCTTCCTTCCTTGGGCGAAATCCAAATCCGTGATGTTGACTCGCTTGGTTCTGGTGG CCGCGCGCAGAGGTCGGGGAGCTCGCTGACGGTGGGGGAGCGGCTCTGCGCGGTGGTCCTGCCCTGCGTCGCCATCG CCGAGTTCGTCTTCTTCGCCCTCACCGACTGCCTGGCCGGCATCTGCCCCGCTTCCTCCAACTCCTCCTCGCGCCTC CGCGGAGATCCATCCGCTCCGTCCTTCTTCCTCGCGGCCAAGAAGGGGAACCACCACCACCACCACCACCTCCTCCG CCGTCGCGTCGGGCCGGGCTGCACCTCCCTGACCTTCCGCGACCTCGCCCGCCTCGCCGACGAGTCCAGATGCTGTA AATTGAAAACCACCTCTCTTTTGCCCCTCGAGTTCGTTCTTCTTGCCCGGCGTTTCTTGCAATTGCAATGTCGTTTG ATACGAGTCTTCTTTTCCTTGGCAACCGAATCAAGTCTCGGTGAATGAGGTGGAGGCGCTGTTCGAGCTCTACAAGA AGATCAGCTGCTCCATCATCAACGACGGACTCATCCACAAGGTACCCACCCCACCCCCCTAAAGCAAAAGCGCCTCT GTTTCTTCTCTAATCTGAAACAAATTAGTGCATATTTGACAGAGGTACGTGCTGCATGACTGGTAATGTTTGGGCTT AGCGATTGAGAGCCGGGTTGCTTCATAGATCGATCTGAAAATGCTGCATCACATCACATGCCACAGATTCTTTCCCC GGGATATGGATCAAAGACACACTGTCATATGACCTGTATAGAGGGACTAGTATTAGATTTGGCTTCACACCCACAGA ATTATTGGCCTGTATTTTTTCCAGGACAGCACGTTGTGTGGCTTGGCTTCCATGTGAAGTTTCATCATACTATAGTG CCTGCCTCTCCGAATGTTGGGCGGTCACCTTCTTTCTTGTAAAGTTTTTCATTTTACTTAATTGCTGTGCAAGTCCC ATTCTGCGAAGGAATATTAATTAATTTTATAATGCACATATGAACAATCTGTTATGAGTGCACATATGACGTGCGGG GATCAAGGCGGGTACCTAGAAAAGTTTGAATGCCCTGTTCCATTCATATAGTACTATGATTGAACCAGCAAAGAAAA ACAAATTGACCTATCTGTCTTTTCTGTTGAATTATTATCTAGGAAGAGCTTCAGCTAGCATTATTCAAGACTCCTAG TGGCCAGAATCTTTTTCTTGATAGGGTAAGCGTTGACAACTTCAATTTGCTATTTTTAAATGCTTCAAGATCATTAT TTACAATGTCATAAAAAAATCTGAATTGCTCACATTGCATTTTGCTTTGTGAGGTAGCATCCTACTGAAATTGTCCT CTATGATCCAGGTCTTTGATTTGTTTGACGAGAAGAAAAATGGAGTAATAGAGTTTGAGGAGTTTATTCATGCTCTC AGTGTCTTCCATCCATTGGCGCCTGTGGAAGACAAGATCAACTGTAAGTACAATTCTTGCAGAAACTCGGTGCTCCA CATGAACATGTTGAAATGTACTTACGGTTAGGACTCTCCTTCTGAGTTGTTTCAGTTGCATTTAGGCTCTATGATTT GAGACAGACTGGCTTTATTGAGCGCGAGGAGGTTAGTTCAGATGGATGTTCTATTTCTATCTGTACCAGTAGTTCAT TTACCTCAGCAAGGTGATCTGTTGGTGCTCCTGTTTTCTTAGGTTATGCAAATGGTTATTGCCATTTTGAATGAATC TCATGTGCAATTACCGGATGACTTTCTTGAGGCCATCCTAGACAAGGTATGCAATCATTTCCTTGGTCTTCTTTACT TATTTATTTCCACTTTACATGGATGTAATTTTTGATTGGTTTCAGACATTTGAAGACGCTGATACCGATAGGGATGG GAAAATCTGCCTAG,
[0069] 其中的編碼區(qū)域全長876bp，堿基序列如SEQ IDNo. 2所示，該編碼區(qū)域編碼291個 氨基酸，序列如SEQ IDNo. 3所示。
[0070] 在上述基礎(chǔ)上，采用已知序列（序列：TGAGACAGACTGGCTTTATTGAG)和cDNA末端加 接頭（GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT)的方法進行 3' RACE 獲得 cDNA3' 末端 序列，序列如SEQ IDNo. 5所示。
[0071] 3' RACEPCR 反應程序為：94°C預變性 5min，（94°C 10s，60°C 20s，72°C lmin)30 個 循環(huán)，72°C lOmin。
[0072] 然后，采用下述引物組合（表1)進行反向巢式PCR獲得該基因 5'UTR和啟動子區(qū) 域。
[0073] 表1:引物
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 用于提高農(nóng)作物抗逆特性的逆境調(diào)控基因 HSCBL8,其特征在于具有序列表SEQ IDNo. 1所示的編碼序列，其具有序列表SEQ IDNo. 2所示的編碼區(qū)域，并表達序列表SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆境調(diào)控基因 HsCBL8,其特征在于具有序列表SEQ IDNo. 4、 SEQ IDNo. 5所示的3' UTR區(qū)、5' UTR區(qū)和啟動子區(qū)。
3. 權(quán)利要求1的逆境調(diào)控基因 HsCBLS的克隆方法，其特征在于包括下述步驟：1)從野 生大麥中獲得全植株RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA ;2)利用簡并引物HsCBLS、HsCBLA，采 用PCR方法擴增步驟1)的cDNA ;3)利用引物HsCBL8S、HsCBL8A，采用PCR方法擴增步驟2) 所得序列從而獲得逆境調(diào)控基因 HsCBLS的編碼序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的克隆方法，其特征在于還包括下述步驟：通過3' -RACE獲得cDNA 的3' UTR區(qū)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的克隆方法，其特征在于還包括下述步驟：通過反向巢式PCR獲得 cDNA的5' UTR區(qū)和啟動子區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3的克隆方法，其特征在于簡并引物為 HsCBLS :5' 一 GMGACWGYBTTSAGYGTDAGTGAA - 3'、 HsCBLA ：5' - GHTYYRYRTCWGCKTCCTCAAA - 3'； 其中，M = A/C ;R = A/G ;W = A/T ;S = G/C ;Y = C/T ;K = G/T ;V = A/G/C ;H = A/C/ T ;D = A/G/T ;B = G/C/T ;N = A/G/C/T。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3的克隆方法，其特征在于 HsCBL8S :5' 一 ATCTAGA CTTTTCCCTCGTCATTACCATGT - 3'、 HSCBL8A :5' 一 TGGTACC ATAGGGATGGGAAAATCTGCCTAG - 3'。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的克隆方法，其特征在于3' -RACE所用引物為： CBL83RACRS ：TGAGACAGACTGGCTTTATTGAG CBL83RACRA ：GGCCACGCGTCGACTAGTAC〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求5的克隆方法，其特征在于所用PCR引物為兩組，分別為 ICBL81S : CCTATCTGCTGCTGCTGCCGCCA、 ICBL81A ：CCATCCGCTCCGTCCTTCTTCCT ； ICBL8 2 S : CATCACGGATTTGGATTTCGCCCAA、 ICBL8 2A : CTTCTTCGCCCTCACCGACTGCCT。
【文檔編號】C12N15/10GK104232656SQ201410271552
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】郭萬里, 梁宗鎖, 楊東風, 陳紹寧, 金偉波, 吳芳麗, 徐濤, 呂洪飛, 祁哲晨 申請人:浙江理工大學