專利名稱：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法，尤其是采用低密度基因芯片用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的環(huán)境安全與食用安全引起了各國政府和公眾的普遍關(guān)注(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analytical methods for detection anddetermination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products.Eur.Food Res.Technol.，2002，214，3-26)為了保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，保障人們的餐桌安全，確保農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易的健康發(fā)展，世界各國都加大了在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)和安全評(píng)價(jià)方面的研究投入，我國從2002年3月20日起要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)并標(biāo)識(shí)(中華人民共和國國務(wù)院.《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》.2001年5月23日)。與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的迅猛發(fā)展相比，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法的發(fā)展相對(duì)滯后，有關(guān)的國際標(biāo)準(zhǔn)仍未出臺(tái)，目前常用的檢測(cè)方法主要有以下幾種(Markus L，Peter B，Klaus P，et al.IUPAC collaborative trialstudy of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder.Journal of AOAC International，1999，82923～928)1.免疫學(xué)方法以表達(dá)蛋白為目標(biāo)的免疫學(xué)方法是根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)，針對(duì)某一特定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品而設(shè)計(jì)的，其中包括免疫印跡法(western blot)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和試紙條法(lateral flow strip)。目前已報(bào)道一些穩(wěn)定可靠的免疫學(xué)方法可檢測(cè)少數(shù)幾種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，如ELISA法檢測(cè)RoundupReadyTM大豆的表達(dá)蛋白cp4epsps、Flavor SavrTM番茄的表達(dá)蛋白nptII等(Stave J W，Magin K，Schimmel H，et al.AACC collaborative study of a protein method for detection ofgenetically modified corn.Cereal Foods World，2000，45497～501)。
評(píng)價(jià)免疫學(xué)方法具有特異性好、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、對(duì)儀器和人員要求不高的特點(diǎn)，適用于原料和半成品分析。但是該類方法僅針對(duì)一種特異蛋白，覆蓋率低；對(duì)于加工食品，受到目標(biāo)蛋白的構(gòu)象和含量的限制，尤其是深加工食品中目標(biāo)蛋白的變性，影響抗原抗體的特異性識(shí)別，而使檢測(cè)的不確定性增加；有些基因在新宿主內(nèi)進(jìn)行修飾，只在某些部位表達(dá)或根本不表達(dá)，也就難以用該類方法進(jìn)行檢測(cè)(Anklam E、Gadani F、Heinze P、et al，Analyticalmethods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops andplant-derived food products.Eur.Food Res.Technol，2002，214，3-26)。
2.定性PCR方法以外源DNA為目標(biāo)的檢測(cè)方法包括DNA雜交法(southern blot)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(polymerase chain reaction，PCR)。DNA雜交法準(zhǔn)確可靠，但存在靈敏度低、操作繁瑣等缺點(diǎn)(Anklam E，Gadani F，Heinze P，et al，Analytical methods for detectionand determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived foodproducts.Eur.Food Res.Technol，2002，214，3-26)。PCR法是指模擬體內(nèi)DNA復(fù)制方式在體外選擇性擴(kuò)增DNA某個(gè)特殊區(qū)域的技術(shù)，通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源DNA序列，然后用瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，是目前最常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法。
評(píng)價(jià)對(duì)設(shè)備試劑要求不高，成本低，快速簡(jiǎn)便，可用作篩選試驗(yàn)。但存在電泳分析粗略、易污染、檢測(cè)結(jié)果需驗(yàn)證、難以定量、不適合大規(guī)模分析等不足(Wenjin Su，Siyang Song，Minnan Long，and Guangming Liu，Multiplex polymerase chain reaction/membrane hybridization assayfor detection of genetically modified organisms.Journal of Biotechnology，2003，105227-233)。
3.競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR方法(competitive quantitative PCR)以待測(cè)的外源DNA與競(jìng)爭(zhēng)DNA(以缺失或插入幾十bp的外源DNA序列構(gòu)建的質(zhì)粒)作為相互競(jìng)爭(zhēng)底物，在同一PCR反應(yīng)體系中競(jìng)爭(zhēng)引物和酶等，其相差幾十bp的PCR產(chǎn)物可以通過凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行區(qū)分和定量，以系列轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品DNA制作“靶DNA濃度—靶DNA產(chǎn)物量/競(jìng)爭(zhēng)DNA產(chǎn)物量”的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可依據(jù)“待測(cè)DNA產(chǎn)物量/競(jìng)爭(zhēng)DNA產(chǎn)物量”求得樣品中的轉(zhuǎn)基因成分含量(Hardegger M，Brodmann P，Herrmann A.Quantitative detection of the 35S promoter andthe NOS terminator using quantitative competitive PCR.Eur Food Res Technol，1999，20983-87)。
評(píng)價(jià)競(jìng)爭(zhēng)性PCR法在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板，消除了實(shí)驗(yàn)中各種可變參數(shù)的干擾，獲得了較為準(zhǔn)確的結(jié)果，可定量分析，成本較低。但存在操作繁瑣、技術(shù)復(fù)雜(需構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)性DNA)、要求電泳分析、易污染等不足(Ke LD，Chen Z，Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCRexogenous vs endogenousstandards.Mol.Cell Probes，2000，14127-135)。
4.熒光定量PCR(fluorophore quantitative PCR，F(xiàn)QPCR)法在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性。數(shù)據(jù)的采集和分析可自動(dòng)完成，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程，減少了污染和假陽性的機(jī)會(huì)(Becker K.，D.Pan and C.B.Whitely.Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer.Hum.GeneTher，1999，102559-2566)。
評(píng)價(jià)熒光定量PCR方法靈敏度比上述各法高，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，且可定量測(cè)定(Whitcombe D，Browie J，Gillard H L，et al.A homogeneous fluorescence assay for PCRampliconsits application to real-time，single-tube genotyping.Clin Chem，1998，44918～923)。但目前常用的熒光定量PCR技術(shù)成本高，不便普及應(yīng)用(Li Q，Luan G，Guo Q，et al.A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacementhybridization.Nucleic Acids Res.，2002，30(2)E5-5)。
5.多基因PCR(multiplex PCR，MPCR)法隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)正由單基因PCR向多基因PCR方向發(fā)展。單基因PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，但它只能檢測(cè)某一特定的基因成分，若待檢樣品中轉(zhuǎn)基因成分不明或含有多種轉(zhuǎn)基因成分，就需要采用不同的PCR對(duì)可能存在的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行多次擴(kuò)增，此時(shí)PCR技術(shù)就變得繁瑣費(fèi)時(shí)，而且可能出現(xiàn)漏檢引起的假陰性結(jié)果。
評(píng)價(jià)MPCR是一種特殊的PCR技術(shù)，比單基因PCR反應(yīng)更快捷、更經(jīng)濟(jì)，可在一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)多種可能的轉(zhuǎn)基因成分，彌補(bǔ)了單基因PCR的一些不足(Minunni M，Tombelli S，Mariotti E，et al.Biosensors as new analytical tool for DNA detection.Fresenius J Anal Chem，2001，369589-593)。目前，多基因PCR產(chǎn)物的檢測(cè)仍然沿用傳統(tǒng)的凝膠電泳分析方法，該方法簡(jiǎn)便易行，但缺乏特異性和靈敏性，同時(shí)容易對(duì)人和環(huán)境產(chǎn)生危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種高通量、快速高效、自動(dòng)化程度與靈敏度較高和成本低的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種可同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中常用的啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記基因、抗除草劑基因、抗蟲基因等9個(gè)外源DNA序列進(jìn)行檢測(cè)分析的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種可對(duì)多種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)的方法。
本發(fā)明的步驟為1、選擇引物與探針；2、處理芯片載體選擇芯片載體，經(jīng)清洗、干燥，再硅烷化，將硅烷化的芯片載體用1，4-苯二異硫氰酸鹽(POC)溶液中浸泡，晾干；3、制備芯片將探針溶于超純水，加入點(diǎn)樣液，將探針固定在已處理的芯片載體上，點(diǎn)樣，放置，清洗，晾干，干燥，備用；4、MPCR(多基因PCR)擴(kuò)增加入DMSO(二甲基亞砜)將Cy3(單功能熒光染料)干粉重懸，將重新懸浮的染料分裝到小管中，以DNA濃縮系統(tǒng)將其抽干，干燥，進(jìn)行多基因PCR反應(yīng)；
5、MPCR產(chǎn)物標(biāo)記取多基因PCR產(chǎn)物變性，進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，向反應(yīng)管中加入緩沖液，變性PCR產(chǎn)物，每管加入無水乙醇沉淀核酸，離心，洗滌，用NaHCO3溶解，將NaHCO3溶解的多基因PCR產(chǎn)物加入到分裝的Cy3染料小管中，將染料干粉重懸，放置，孵育，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，純化、凍干濃縮至所需體積；6、MPCR產(chǎn)物的芯片雜交試驗(yàn)每個(gè)反應(yīng)管加入EDTA(乙二胺四乙酸)溶液，再加入純化的標(biāo)記PCR產(chǎn)物，變性，取出放置于冰上，加入雜交液，制成雜交混合液，將制備的芯片滴加雜交混合液，置雜交爐中雜交過夜，雜交后的芯片經(jīng)洗滌，離心，晾干；7、掃描分析和數(shù)據(jù)處理將雜交反應(yīng)后的芯片插入掃描儀的檢測(cè)孔內(nèi)，進(jìn)行結(jié)果掃描和分析處理。
所說的芯片載體選自玻片，尼龍膜或纖維素膜等。
基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來，隨著人類及其它生物基因數(shù)據(jù)庫急劇擴(kuò)大而誕生的一種大規(guī)模、自動(dòng)化、高可靠性的基因檢測(cè)技術(shù)，已應(yīng)用于各種病原體檢測(cè)、遺傳病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。目前芯片技術(shù)的點(diǎn)樣密度已達(dá)到數(shù)萬個(gè)探針/cm2，為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具；由于采用了現(xiàn)代的電子和光機(jī)電技術(shù)，基因芯片從制備到結(jié)果分析都是自動(dòng)化控制；在芯片技術(shù)中設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)和各種對(duì)照十分容易，數(shù)據(jù)的采集和分析由電腦完成，檢測(cè)結(jié)果客觀可靠；因此，高通量、快速、靈敏的基因芯片技術(shù)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)發(fā)展的必然方向。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法(LD-CHIP)將目前通用的特異寡核苷酸片段固定于玻片上制成檢測(cè)芯片，從待檢樣品中提取DNA進(jìn)行多基因同時(shí)擴(kuò)增、標(biāo)記后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)由掃描儀及計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析判定。
本發(fā)明首先確立了國產(chǎn)玻片的氨基硅烷化及POC處理程序，使玻片上的氨基轉(zhuǎn)化為具有反應(yīng)活性的異硫氰酸基，后者與寡核苷酸探針上標(biāo)記的氨基共價(jià)結(jié)合，從而使探針牢固地結(jié)合于玻片表面?？紤]到探針在玻片上的結(jié)合有一定損失，在芯片制備試驗(yàn)中采用了較高濃度(2μg/μL)的寡核苷酸探針，明顯高于文獻(xiàn)(Takahashi Y，Ishii Y，Nagata T，et al.Clinicalapplication of oligonucleotide probe array for full-length gene sequencing of TP53 in coloncancer.Oncology，2003，6454-60)推薦的濃度標(biāo)準(zhǔn)(500ng/μL)，這樣保證了在點(diǎn)樣、漂洗和雜交過程中，探針仍能夠維持一定的濃度。
本發(fā)明確定了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)寡核苷酸芯片制備的最佳條件采用氨基修飾并加上polyT(多聚胸苷酸)臂的寡核苷酸探針，以異硫氰酸基修飾玻片作為介質(zhì)，點(diǎn)樣后芯片室溫放置，以1％的氨水、0.2％的SDS(十二烷基硫酸鈉)和純水清洗，室溫晾干。
本發(fā)明選擇合適的雜交條件能使多基因PCR產(chǎn)物與芯片上的探針之間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少DNA分子之間的錯(cuò)配率。影響異源雜交雙鏈形成的因素包括靶標(biāo)濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度及溫度等。本發(fā)明確定了LD-CHIP檢測(cè)的雜交溫度與雜交時(shí)間。
本發(fā)明通過檢測(cè)啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等通用基因位點(diǎn)來判定是不是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，通過檢測(cè)抗除草劑、抗蟲等各物種特定的目的基因來判定是哪一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品、是不是我國已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，該方法可應(yīng)用于包括大豆、玉米和馬鈴薯等多種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，從模板提取、靶序列擴(kuò)增、雜交到結(jié)果掃描可以在兩天時(shí)間內(nèi)完成。
DNA芯片在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中具有高通量、自動(dòng)化等特點(diǎn)，顯示出特有的優(yōu)越性和極大的潛在用途。
基因芯片是一種高通量平行分析技術(shù)，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列的矩陣，能同時(shí)檢測(cè)成百上千種轉(zhuǎn)基因成分，很好地解決了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的效率問題。首先，按一定次序?qū)⒐押塑账崽结橖c(diǎn)樣在芯片上，然后用標(biāo)記的樣品DNA多基因PCR產(chǎn)物與該芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交信號(hào)進(jìn)行掃描分析。基因芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，具有快速高效，自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。本發(fā)明建立的低密度基因芯片(LD-CHIP)可同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中常用的啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記基因、抗除草劑基因、抗蟲基因等9個(gè)外源DNA序列進(jìn)行檢測(cè)分析。


圖1為用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的低密度基因芯片的點(diǎn)樣陣列。
圖2為LD-CHIP雜交檢測(cè)GM(轉(zhuǎn)基因)大豆標(biāo)準(zhǔn)品(A)和GM玉米標(biāo)準(zhǔn)品(B)的掃描結(jié)果。
圖3為樣品LD-CHIP雜交檢測(cè)掃描結(jié)果。在圖3中，A(0.3％轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品和B(S1)18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，lectin和cp4epsps-1/-2結(jié)果陽性；C(0.15％轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品)和D(M1)18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII，invertase和cryIAb-1/-2 arepositive；E(S-P8)和F(P3)18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII，and cryIIIA結(jié)果陽性。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1選擇合適的引物與探針是成功進(jìn)行DNA分析檢測(cè)的關(guān)鍵。針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中最常用的9個(gè)外源DNA以及對(duì)照基因(如18S核糖體RNA、大豆lectin內(nèi)源基因和玉米invertase內(nèi)源基因)的序列，通過反復(fù)多次地組合調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)，經(jīng)軟件Primer ExpressTM和OLIGO 4.0搜索分析，并進(jìn)行各寡核苷酸的比較，從中選出符合要求的引物和探針。選用的引物及相關(guān)信息見表1，所用的探針及相關(guān)信息見表2。
表1

表2

備注探針5’端加上十個(gè)T并標(biāo)記NH4。
選擇顯微鏡用載玻片(國產(chǎn)帆船牌)為芯片載體，用脫脂棉擦拭清洗，用重鉻酸洗液浸泡，以去除表面有機(jī)物等雜質(zhì)，然后用雙蒸水(ddH2O)清洗；再于25％的氨水中浸泡14h，超純水清洗。用2mol/L的NaOH-70％乙醇浸泡2h，超純水清洗、烘干，干燥器中冷卻至室溫。玻片浸入含1％的氨丙基-三甲氧基硅烷(APS)的95％乙醇(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5)中20min，95％乙醇超聲清洗5min，純水超聲清洗5min，烘干。將硅烷化的玻片用2g/L的1，4-苯二異硫氰酸鹽(POC)溶液中浸泡2h；甲醇浸泡7min，丙酮浸泡5min，室溫晾干。合成的寡核苷酸探針(5OD)先溶于40μL超純水，再加入40μL 2×點(diǎn)樣液，DNA濃度為2μg/μL。利用自動(dòng)點(diǎn)樣儀將探針固定在已處理的玻片上，依據(jù)AxSys軟件設(shè)計(jì)的陣列模式(16×4)點(diǎn)樣，每個(gè)探針重復(fù)4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)樣體積為10nl，直徑為0.25μm，點(diǎn)間距為0.5mm×0.5mm。點(diǎn)樣完畢的芯片室溫放置，1％的氨水清洗5min；0.2％的SDS(十二烷基硫酸鈉)清洗5min；純水清洗5min，室溫晾干，干燥器中4℃保存?zhèn)溆谩?br> 加入12μL DMSO將Amersham的Cy3染料干粉重懸，將重新懸浮的染料以2μL/管的量分裝到小管中，室溫條件下以DNA濃縮系統(tǒng)將其抽干；干燥后的分裝染料置于不透光的盒子中，干燥器中4℃保存?zhèn)溆?。多基因PCR反應(yīng)按反應(yīng)體系[10×PCR緩沖液5μL，10mmol/Ld ATP(脫氧腺苷三磷酸)，dGTP(脫氧烏苷三磷酸)，dCTP(脫氧胞苷三磷酸)各0.5μL，20mmol/L dUTP(脫氧尿苷三磷酸)0.5μL，1U/μL AmpEraseUNG酶(DNA糖基化酶)1.0μL，25mmol/L MgCl25μL，10μmol/L primer(引物)2×n μL，DMSO 2μL，50ng/μL DNA模板1×nμL，5U/μL AmpliTaqTMGold DNA聚合酶1μL，加入ddH2O至50μL]和反應(yīng)程序(94℃/5min；94℃/30s，55℃/30s，40個(gè)循環(huán)；72℃/5min)進(jìn)行。
取多基因PCR產(chǎn)物于99℃變性3min；依照Ready-To-GoTMDNA labeling Beads操作說明書進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，向新的反應(yīng)管中加入1μL aa-dUTP，4μL TE(三氨基甲烷/乙二胺四乙酸)緩沖液，45μL變性PCR產(chǎn)物，37℃溫育1h。每管加入2.5倍體積無水乙醇125μL沉淀核酸，14000r離心5min；用500μL 70％乙醇洗滌2次，用10μL 0.1mol/L NaHCO3溶解。將NaHCO3溶解的多基因PCR產(chǎn)物加入到分裝的Cy3染料小管中，反復(fù)吹打，將染料干粉充分重懸；室溫下放置暗處，孵育60min。使用PCR純化試劑盒，純化，凍干濃縮至所需體積。
每個(gè)反應(yīng)管加入4μL 10mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液，再加入1.33μL純化的標(biāo)記PCR產(chǎn)物，95℃變性10min，立即取出放置于冰上2min，加入13.3μL雜交液，制成雜交混合液。將制備的芯片平放，滴加13μL雜交混合液(含檢測(cè)模板)，小心加上蓋玻片，置專用雜交爐中于55℃恒溫避光雜交過夜。雜交后的芯片經(jīng)過嚴(yán)格條件下的洗滌，依次用1×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液)、0.2×SSC、0.1×SSC洗滌，每次3min，以除去未雜交殘留物，500r/m離心玻片5min，室溫晾干。
將雜交反應(yīng)后的芯片插入Scan ArrayTMlite掃描儀的檢測(cè)孔內(nèi)，利用ScanArrayExpress軟件進(jìn)行結(jié)果掃描(掃描強(qiáng)度50％～60％，修正值取-5，分辨率為10μm)和分析處理。
實(shí)施例2利用PixSysTM5500型全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，設(shè)計(jì)成16×4陣列，包含14條檢測(cè)目標(biāo)探針，2條陰性對(duì)照，每種探針重復(fù)4個(gè)點(diǎn)(參見圖1)。芯片上設(shè)置一段與檢測(cè)探針幾乎沒有同源性的人類基因作為陰性對(duì)照，以排除雜交過程中非特異雜交的干擾。
實(shí)施例3芯片雜交是指熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng)并產(chǎn)生一系列信息的過程。影響芯片雜交雙鏈形成的因素包括靶標(biāo)濃度、雜交液成分及雜交溫度等，選擇合適的條件能使雜交反應(yīng)中的大多數(shù)處于最佳狀況中，也就是說使盡可能多的正確配對(duì)物不遺漏，有錯(cuò)配的雜交降至最低。所列出的雜交程序(包括探針修飾、靶標(biāo)濃度、雜交溫度、雜交時(shí)間和玻片洗滌等反應(yīng)條件)均已進(jìn)行優(yōu)化，例如探針5’端進(jìn)行氨基化修飾，并連接10個(gè)胸腺嘧啶核苷(T)組成的連接臂后，可以明顯提高探針在玻片上的固定效率，并改進(jìn)雜交效果；雜交溫度選擇55℃(低于探針Tm值)和雜交時(shí)間選擇過夜(＞13h)可以獲得理想的雜交信號(hào)；雜交后的芯片經(jīng)過嚴(yán)格條件下的3次洗滌(依次用1×SSC、0.2×SSC、0.1×SSC)，可以除去未雜交的絕大多數(shù)殘留物。依據(jù)優(yōu)化后的試驗(yàn)條件，應(yīng)用已知陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了LD-CHIP檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果顯示，LD-CHIP方法可檢出0.1％的GM大豆DNA和0.1％的GM玉米DNA的MPCR產(chǎn)物(參見圖2)。
應(yīng)用建立的LD-CHIP方法對(duì)6份已知標(biāo)準(zhǔn)樣(0％和0.3％的大豆粉，0％和0.15％的玉米粉，以及馬鈴薯S-P7和S-P8)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，0％的大豆粉、0％的玉米粉和馬鈴薯S-P7只出現(xiàn)了相應(yīng)的內(nèi)參照基因雜交檢測(cè)信號(hào)(如18S rRNA、lectin或invertase)；而0.3％的大豆粉，0.15％的玉米粉，以及馬鈴薯S-P8不僅獲得了內(nèi)參照基因的雜交檢測(cè)信號(hào)，同時(shí)得到了特異的外源基因雜交檢測(cè)信號(hào)，即大豆粉檢出CaMV 35S、Tnos和cp4epsps基因，玉米粉檢出CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIAb基因，馬鈴薯檢出CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIIIA基因。
應(yīng)用建立的LD-CHIP方法分別對(duì)6份馬鈴薯類樣品(編號(hào)為P1～P6)，9份大豆類樣品(編號(hào)為S1～S9)，6份玉米類樣品(編號(hào)為M1～M6)等未知實(shí)物樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，5份大豆類樣品(編號(hào)為S1、S2、S6、S7、S9)檢出18S rRNA、lectin、CaMV35S、Tnos和cp4epsps基因，3份玉米類樣品(編號(hào)為M1、M3、M6)檢出18S rRNA、invertase、CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIAb基因，2份馬鈴薯類樣品(編號(hào)為P3、P5)檢出18S rRNA、CaMV 35S、Tnos、nptII和cryIIIA基因(參見圖3)；其余11份樣品只有相應(yīng)的內(nèi)參照基因雜交檢測(cè)信號(hào)。在圖3中，A(0.3％轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品)；B(S1)18SrRNA，CaMV 35S，Tnos，lectin和cp4epsps-1/-2結(jié)果陽性；C(0.15％轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品)；D(M1)18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII，invertase和cryIAb-1/-2結(jié)果陽性；E(S-P8)和F(P3)18S rRNA，CaMV 35S，Tnos，nptII和cryIIIA結(jié)果陽極。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法，其特征在于其步驟為1)選擇引物與探針；2)處理芯片載體選擇芯片載體，經(jīng)清洗、干燥，再硅烷化，將硅烷化的芯片載體用1，4-苯二異硫氰酸鹽溶液中浸泡，晾干；3)制備芯片將探針溶于超純水，加入點(diǎn)樣液，將探針固定在已處理的芯片載體上，點(diǎn)樣，放置，清洗，晾干，干燥，備用；4)多基因PCR擴(kuò)增加入二甲基亞砜將單功能熒光染料Cy3干粉重懸，將重新懸浮的染料分裝到小管中，以DNA濃縮系統(tǒng)將其抽干，干燥，進(jìn)行多基因PCR反應(yīng)；5)MPCR產(chǎn)物標(biāo)記取多基因PCR產(chǎn)物變性，進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，向反應(yīng)管中加入緩沖液，變性PCR產(chǎn)物，每管加入無水乙醇沉淀核酸，離心，洗滌，用NaHCO3溶解，將NaHCO3溶解的多基因PCR產(chǎn)物加入到分裝的Cy3染料小管中，將染料干粉重懸，放置，孵育，使用PCR純化試劑盒，純化、凍干濃縮至所需體積；6)MPCR產(chǎn)物的芯片雜交試驗(yàn)每個(gè)反應(yīng)管加入乙二胺四乙酸溶液，再加入純化的標(biāo)記PCR產(chǎn)物，變性，取出放置于冰上，加入雜交液，制成雜交混合液，將制備的芯片滴加雜交混合液，置雜交爐中雜交過夜，雜交后的芯片經(jīng)洗滌，離心，晾干；7)掃描分析和數(shù)據(jù)處理將雜交反應(yīng)后的芯片插入掃描儀的檢測(cè)孔內(nèi)，進(jìn)行結(jié)果掃描和分析處理。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法，其特征在于所說的引物選用引物序列(5’-3’)TAA TAG AGC AAT GAA CAG TCG GCTT TCA ACA ACG GAT CTC TTG GGTG CTA CTG ACC AGC AAG GCA AAC TCA GCGGAG GGT TTT GGG GTG CCG TTT TCG TCA ACGGC CGG ATC GTC ATG CTC TAC ATTG GCG TCC GAC TTG ACC CAC TGAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT GTAG AGG AAG GGT CTT GCG AAG GAGT CCA AAG CCT CAA CAA GGT CCAT TAG TGA GTG GTC TGT CAG GGAA TCC TGT TGC CGG TCT TGCGA ATT CCC GAT CTA GTA ACTTT CTC GGC AGG AGC AAG GACT GGG CAC AAC AGA CAA TCACA AGC ACG GTC AAC TTC CACT CGG CCG TCC AGT CGT ATGT GCT GTA GCC ACT GAT GCTGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC GCGA ATA TCC GAT TCT CGC TGT CCGC CCT CAT CGC AAT CCA CCGT CTT GAA GGT CGT GGT AGCA ACA GCG AGA ATT GGA TATCG ACA TCA GCC TGA GCC TGTGG TTG ATC AGC TGC TCG ATCAGG CTG CCA ACC TGC ACT TTCA AAG CCC CAC CGT TGTTCT GGA TAC GAG GTT CTAAAA GAC GCT CAA ATT TAT GG
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法，其特征在于所說的探針選用探針序列(5’-3’)TTC AGA CCT CCA CCC TTG AATCTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CACCGA GCA GAC CGC CGT GTA CTT CTA CCGGC CAT CGT TGA AGA TGC CTC TGC CTAA TCT TGT CAA CAT CGA GCAAAT GTA TAA TTG CGG GAC TCT AAT CACT TCG CCC AAT AGC AGC CAG TCC CTT CAGC GCT ATC CCT GGC TCG TTTC ATG TTC GGC GGT CTC GCGGTC TGG AAG AAC TCC GCG TCA AGG AAA GCTGG CTG ACT TGC GTG TTC GTT CTT CTA CTT TGATG TCC ACC AGG CCC AGC ACGTCG GTG CTC CGC GAT GTC TCCAAC ATA TGC ACA AGC TGC CAA
全文摘要
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的低密度基因芯片檢測(cè)方法，涉及一種采用低密度基因芯片用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法。其步驟為選擇引物與探針；處理芯片載體；制備芯片將探針溶于超純水，加入點(diǎn)樣液，將探針固定在已處理的芯片載體上，點(diǎn)樣；多基因PCR擴(kuò)增；MPCR產(chǎn)物標(biāo)記；MPCR產(chǎn)物的芯片雜交試驗(yàn)；掃描分析和數(shù)據(jù)處理將雜交反應(yīng)后的芯片插入掃描儀的檢測(cè)孔內(nèi)，進(jìn)行結(jié)果掃描和分析處理。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，具有快速高效，自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)?？赏瑫r(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中常用的啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記基因、抗除草劑基因、抗蟲基因等9個(gè)外源DNA序列進(jìn)行檢測(cè)分析。
文檔編號(hào)G01N35/00GK1580782SQ200410045458
公開日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2004年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者蘇文金, 劉光明, 宋思楊 申請(qǐng)人:廈門大學(xué), 中華人民共和國廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局