專利名稱：：一種由轉(zhuǎn)基因蔬菜作物獲得無外源基因蔬菜收獲品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及從轉(zhuǎn)基因植物中獲得不含外源基因的作物產(chǎn)品的方法，其主要步驟涉及相關(guān)基因和結(jié)構(gòu)元件的分離克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化和分子檢測(cè)、鑒定等步驟。本發(fā)明還涉及一種可遺傳操作的重組載體的構(gòu)建。該載體具有良好的通用性。
背景技術(shù)：
：植物轉(zhuǎn)基因過程中，由于外源DNA被植物細(xì)胞吸收和整合進(jìn)入植物基因組的頻率很低，為了有效的選擇、識(shí)別和鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植株，導(dǎo)入目的基因的同時(shí)，需要引入選擇標(biāo)記基因以賦予受體植物特定的抗性。目前，所用的標(biāo)記基因主要是編碼抗生素或抗除草劑的基因。隨著轉(zhuǎn)基因植物的獲得，標(biāo)記基因已不再具有利用價(jià)值，但它仍在植物中不斷指導(dǎo)酶的合成，消耗細(xì)胞資源，而且由于生物安全問題其對(duì)消費(fèi)心理也形成一定壓力。開發(fā)無標(biāo)記基因或剔除標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，創(chuàng)造無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物具有重要意義。同時(shí)隨著轉(zhuǎn)基因植物的商品化種植，人們?cè)絹碓疥P(guān)注外源基因的生物安全性，而不僅僅局限于標(biāo)記基因的生物安全性，因?yàn)槿藗冊(cè)诓捎没蚬こ踢M(jìn)行作物遺傳改良的時(shí)所用到的外源基因大量來自于微生物、動(dòng)物或異源植物。人們同樣擔(dān)心這種來自異源生物的抗病、抗蟲、抗病毒等基因是否具有食品和環(huán)境安全性。作為一種外源基因，無論是標(biāo)記基因或目的基因，在轉(zhuǎn)基因植物獲得后并行使其相應(yīng)功能后，將其從植物體內(nèi)特別是在食用植物產(chǎn)品中徹底清除勢(shì)在必行。目前，對(duì)外源目的基因的安全性研究卻剛剛起步，國(guó)內(nèi)外獲得無標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因植物的方法，可歸納為以下4種，即無標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化法、生理代謝基因選擇法、目的基因載體與標(biāo)記基因載體共轉(zhuǎn)化法和標(biāo)記基因切除法。第一種方法需借助PCR擴(kuò)增直接對(duì)獲得的非選擇再生苗進(jìn)行檢測(cè)鑒定，后期選擇工作量大、費(fèi)用高，目前還沒有現(xiàn)成的技術(shù)體系。第二種方法局限性大，轉(zhuǎn)入的生理代謝相關(guān)基因影響植物個(gè)體發(fā)育，不宜采用。較為實(shí)用的是后兩種方法，即雙載體共轉(zhuǎn)化法和標(biāo)記基因切除法，后者又分為轉(zhuǎn)座子法、位點(diǎn)特異重組法等。所謂共轉(zhuǎn)化法，是將標(biāo)記基因和目的基因分別放在兩個(gè)不同的T-DNA內(nèi)，構(gòu)建在同一Ti質(zhì)粒或不同的Ti質(zhì)粒上，同時(shí)轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)化后兩個(gè)T-DNA片段分別整合到植物基因組不同位置。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過自交，標(biāo)記基因和外源基因由于減數(shù)分裂將被分離開來，從而在后代群體中可以選擇到無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植株。有三種共轉(zhuǎn)化途徑將目的基因和標(biāo)記基因分離(1)二質(zhì)粒二菌株法；(2)二質(zhì)粒一菌株法；(3)一質(zhì)粒一菌株法(即雙T-DNA法)不過，兩基因共轉(zhuǎn)化到同一細(xì)胞的頻率較低，且要求整合的兩基因容易通過染色體交換分離，因此，需要進(jìn)行大量的篩選工作。另外，該方法要求植物能進(jìn)行有性繁殖，不適合于無性繁殖的植物。轉(zhuǎn)座子法主要是借助玉米Ac/Ds或Spm/dSpm兩個(gè)研究最深入的轉(zhuǎn)座子家族，轉(zhuǎn)座子可攜帶轉(zhuǎn)座標(biāo)簽之間的序列在基因組內(nèi)跳躍，它們被轉(zhuǎn)入其它作物后仍具有轉(zhuǎn)座能力。標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)座酶基因位于轉(zhuǎn)座標(biāo)簽序列之間，通過轉(zhuǎn)座酶的作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)座序列轉(zhuǎn)移，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的剔除。然而，該方法完全寄希望于轉(zhuǎn)座失誤，即轉(zhuǎn)座因子切除后不再重新插入新位置而消失，或重新插入到一個(gè)姊妹染色體中失活，或轉(zhuǎn)座后通過隨后的體細(xì)胞分離中丟失，因此成功率很低。同時(shí)，轉(zhuǎn)座作用還導(dǎo)致原來與之相鄰的DNA序列的改變，即轉(zhuǎn)座的次級(jí)效應(yīng)。位點(diǎn)特異重組法是將標(biāo)記基因置于特定重組位點(diǎn)之間，通過相應(yīng)的特異識(shí)別該位點(diǎn)的重組酶催化，產(chǎn)生特異重組或特異切除，利用此特性可將標(biāo)記基因剔除。在轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因的剔除過程中，利用重組位點(diǎn)和重組酶的特點(diǎn)構(gòu)建特異植物轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)。即將標(biāo)記基因置于T-DNA片段上的兩個(gè)特異重組位點(diǎn)間；同時(shí)，將相應(yīng)的重組酶基因構(gòu)建到另一個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體上，以得到的兩種轉(zhuǎn)化植株雜交即可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的切除。目前，主要發(fā)現(xiàn)了主要是存在于微生物中的五類位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)，即細(xì)菌噬菌體P1的Cre-loxP系統(tǒng)、酵母質(zhì)粒FLP-FRT系統(tǒng)、Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系統(tǒng)、Mu噬菌體的Gin-gix重組酶系統(tǒng)以及λ噬菌體attB-P系統(tǒng)。Cre-loxP系統(tǒng)的lox位點(diǎn)由34bp特異序列構(gòu)成，其中有8bp是核心序列，Cre重組酶是一個(gè)38.5KD的蛋白質(zhì)，專一性的識(shí)別和催化兩loxP位點(diǎn)之間序列的重組。利用了Cre-loxP特異位點(diǎn)重組系統(tǒng)切除轉(zhuǎn)基因植物中的標(biāo)記基因已在煙草、擬南芥等植物上獲得成功(Gleave，etal，Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofcrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantMolBiol，1999，40223～235；ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。有報(bào)道指出，在Cre-loxP系統(tǒng)中引入瞬時(shí)表達(dá)Cre重組酶的切除并不徹底、效率很低，還需要再一輪的組培再生過程，因此其可行性較差(Gleave，etal，Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofcrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantMolBio1，1999，40223～235)。植物上利用酵母質(zhì)粒單鏈重組酶的FLP-FRT系統(tǒng)也隨之發(fā)展起來(Kilbyetal.，F(xiàn)LPrecombinaseintransgenicplantsconstitutiveactivityinstablytransformedtobaccoandgenerationofmarkedcellclonesinArabidopsis.PlantJ，1995，8637-652；Lyzniketal.，F(xiàn)LP-mediatedrecombinationofFRTsitesinthemaizegenome.NucleicAcidsRes.1996，243784-3789.)。FRT位點(diǎn)也是由34bp特異序列構(gòu)成，其中8bp是核心序列，F(xiàn)LP是48KD的其專一重組酶蛋白。Lloyd等(1994)將酵母的FLP-FRT位點(diǎn)重組系統(tǒng)應(yīng)用于煙草，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LP重組酶在植物組織中具有表達(dá)活性，可切除GUS標(biāo)記基因，但重組酶表達(dá)效率較低，(LloydAM，DavisRW.FunctionalexpressionoftheyeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.MolGenGenet，1994，242653～657)。而Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系統(tǒng)和Mu噬菌體的Gin-gix重組酶系統(tǒng)，則與Cre-loxP和FLP-FRT系統(tǒng)相似，但在植物中還未見應(yīng)用的報(bào)道。以上方法不僅效率低，而且均需要通過重組酶切除與后代的分離選擇過程，周期較長(zhǎng)，工作量大。利用λ噬菌體attB-P系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的自我剔除，而且周期短，便于人為控制，還可以應(yīng)用于無性繁殖植物。有利用att特異位點(diǎn)進(jìn)行載體構(gòu)建和基因克隆的專利申請(qǐng)(一種位點(diǎn)重組反向克隆基因的方法及其利用，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?1130855.9)，與本發(fā)明不同。也有利用att特異位點(diǎn)自主重組實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的剔除的文獻(xiàn)，但其效率很低(Zubkoetal.IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatureBiotech，2000，18442～445)，且沒有專利報(bào)道。attB位點(diǎn)的序列段較短(21bp)，核心序列7bp，attP位點(diǎn)由352bp特異序列構(gòu)成，同attB位點(diǎn)一樣，核心序列也為7bp。λ-att重組酶(INT)基因，可特異識(shí)別attB和att-P位點(diǎn)并進(jìn)行位點(diǎn)間序列的特異切除。引入INT重組酶，并由組織特異性啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，識(shí)別att位點(diǎn)切除外源基因的研究尚無專利報(bào)道。本申請(qǐng)人的前期工作分別申請(qǐng)了三項(xiàng)相關(guān)發(fā)明專利，其中發(fā)明專利申請(qǐng)“一種位點(diǎn)重組反向克隆基因的方法及其應(yīng)用”(中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?1130855.9)僅僅引入att位點(diǎn)進(jìn)行基因克隆而未涉及INT重組酶；發(fā)明專利申請(qǐng)“一種剔除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的方法”(中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00310111414.3)和發(fā)明專利申請(qǐng)“一種能夠使轉(zhuǎn)基因植物自主剔除標(biāo)記基因的方法”(中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00310111415.8)雖然利用INT重組酶識(shí)別att位點(diǎn)切除標(biāo)記基因，但重組酶是分別由組成型啟動(dòng)子和地塞米松誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，同時(shí)該專利也沒有對(duì)目標(biāo)基因的生物安全性加以考慮，僅涉及標(biāo)記基因的生物安全性策略。同樣誘導(dǎo)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究只剔除了標(biāo)記基因，外源基因仍然存在植物體內(nèi)(ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提出一種由轉(zhuǎn)基因蔬菜作物獲得無外源基因蔬菜收獲品的方法，該方法的核心是構(gòu)建一種通用性良好的重組表達(dá)載體，該載體及其遺傳轉(zhuǎn)化方法特別適合從帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因小白菜等蔬菜作物中剔除其外源基因，從而生產(chǎn)無外源基因的蔬菜作物的收獲品。本發(fā)明利用λ噬菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)，化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶INT表達(dá)，構(gòu)建特殊的植物轉(zhuǎn)化載體，在特定發(fā)育階段和組織器官剔除轉(zhuǎn)基因植物中的所有外源基因包括標(biāo)記基因，目標(biāo)基因和重組酶基因，獲得不攜帶外源基因的植物產(chǎn)品，從而提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的生物安全性。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種適用于從轉(zhuǎn)基因植物中剔除外源基因的重組載體pEGF，保藏在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC-M205109。2、一種適用于從茄科或十字花科蔬菜轉(zhuǎn)基因作物中獲得無外源基因的收獲品的方法，它包括以下步驟構(gòu)建一種可遺傳操作的重組載體pEGF，該載體保藏在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC-M205109；1)目標(biāo)基因裝載于步驟1)所述的載體上，得到植物轉(zhuǎn)化載體；2)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因植物；3)純化和純合所述的轉(zhuǎn)基因植物；4)將所述轉(zhuǎn)基因植物與化學(xué)誘導(dǎo)劑接觸或不接觸；5)通過分子檢測(cè)鑒定得到所述的無外源基因植物或植物收獲品其中步驟2)所述的目標(biāo)基因是ACO，將其構(gòu)建于重組載體pEGF中，得到轉(zhuǎn)化載體pEGF-ACO；其中步驟2)所述的目標(biāo)基因是Mi，將其構(gòu)建于重組載體pEGF中，得到轉(zhuǎn)化載體pEGF-Mi；其中步驟2)所述的目標(biāo)基因是Bt，將其構(gòu)建于重組載體pEGF中，得到轉(zhuǎn)化載體pEGF-Bt；其中步驟5)所述的誘導(dǎo)物為β-雌二醇水溶液，施用濃度為2μM/L，其施用方法是將所述的β-雌二醇溶液與所述的轉(zhuǎn)基因植物的葉面或根部接觸。。其中步驟5)所述的經(jīng)過與β-雌二醇溶液接觸的植物是轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲小白菜。其中步驟5)所述的不與β-雌二醇溶液接觸的植物是轉(zhuǎn)基因抗線蟲番茄。本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵是構(gòu)建一種適用于從轉(zhuǎn)基因植物中剔除外源基因的通用的重組載體pEGF，將需要剔除目標(biāo)基因(例如本發(fā)明所涉及的BT、Mi基因)裝載于所述的重組載體上，得到轉(zhuǎn)化載體；將該轉(zhuǎn)化載體通過電激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；純化和純合所述的轉(zhuǎn)基因植物通過使用組織特異型啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)重組剔除反應(yīng)最終獲得無外源基因的植物收獲品。本發(fā)明的具體步驟如下所示，其中本發(fā)明的總體技術(shù)路線如圖1所示。1、λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)所需元件的克隆根據(jù)λ噬菌體基因組序列(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，基因注冊(cè)號(hào)NC_001416)設(shè)計(jì)引物，分別獲得重組酶基因(INT)及其識(shí)別序列(attP)。擴(kuò)增INT基因的正反引物分別是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′，INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′，擴(kuò)增attP位點(diǎn)的正反引物分別是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′，attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′。在20μL反應(yīng)體系中，分別加入13.65mLddH2O，1.5mM/LMgCl2，0.2mM/LdNTPs，0.5μM/L正向和反向引物，0.25μLλ噬菌體裂解物，0.5UTaqDNA聚合酶。擴(kuò)增INT基因的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，然后94℃1min，62℃1min，72℃1min30s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增attP反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃40s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。INT基因和attP的PCR特異片段經(jīng)切膠回收。前者片段回收產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自日本TaKaRa公司)連接，而后者回收產(chǎn)物和pGEM_-TEasy(美國(guó)Promega公司)載體連接，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切后電泳分析鑒定。重組克隆分別命名為pMDTINT和pGTP。進(jìn)一步序列分析證明，重組克隆中插入片段分別為INT基因和attP位點(diǎn)。其序列長(zhǎng)度分別為INT基因(1071bp)，attP序列(353bp)。INT基因序列(全長(zhǎng)1071bp，已公開的序列)attP序列為(353bp，已公開的序列)GATTGCGAGGCTTTGTGCTTCTCTGGAGTGCGACAGGTTTGATGACAAAAAATTAGCGCAAGAAGACAAAAATCACCTTGCGCTAATGCTCTGTTACAGGTCACTAATACCATCTAAGTAGTTGATTCATAGTGACTGCATATGTTGTGTTTTACAGTATTATGTAGTCTGTTTTTTATGCAAAATCTAATTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGATTTCAATTTTGTCCCACTCCCTGCC。2.重組載體構(gòu)建利用λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶表達(dá)或化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶表達(dá)，從而將外源基因包括目的基因和標(biāo)記基因在特定階段或特定組織剔除，獲得不攜帶外源基因的植物產(chǎn)品。構(gòu)建重組載體pEGF過程如下以SalI和SacI對(duì)pMDTINT(INT基因裝載至pMD18-T載體后的重組質(zhì)粒)進(jìn)行酶切，回收INT基因片段與XhoI，SacI酶切的pMV(由pBI121改造)的大片段連接，從而將INT基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，定名為pBINT。以pMV質(zhì)粒(由pBI121改造)為基本載體，對(duì)其以PmeI酶切并CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補(bǔ)平。兩者回收產(chǎn)物連接從而將片段attP插入pBI121(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，基因注冊(cè)號(hào)AF485783)的PmeI位點(diǎn)，定名為pPBIP。以HindIII對(duì)pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端補(bǔ)平并用CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補(bǔ)平。兩者回收產(chǎn)物連接從將attP插入pPBIP的HindIII位點(diǎn)，從而構(gòu)建成中間載體pMF。以pBINT的XhoI/EcoRI片段取代pMF相應(yīng)片段，從而構(gòu)建成重組載體pEGF(攜有該重組載體pEGF的大腸桿菌(Escherichiacoli)保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)CCTC-M205109)。該重組載體pEGF的T-DNA區(qū)內(nèi)含有λ噬菌體重組酶基因(INT)，其上游有SalI和XbaI多克隆位點(diǎn)，可置換包括組織特異性啟動(dòng)子和化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在內(nèi)的啟動(dòng)子，其物理圖譜見圖2所示。3.植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建將外源基因通過XhoI和SpeI雙酶切回收產(chǎn)物連接到pEGF中相同酶切位點(diǎn)中。同時(shí)根據(jù)具體研究要求可以對(duì)其啟動(dòng)子以SalI、XbaI雙酶切，置換所需要的目的啟動(dòng)子。本發(fā)明實(shí)施例中采用的是化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)XVE(參見文獻(xiàn)ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)和果實(shí)特異啟動(dòng)子E8(周曉紅等。番茄果實(shí)特異性E8啟動(dòng)子的基因克隆與序列分析，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003；23(1)25-29)，從而構(gòu)建成植物轉(zhuǎn)化載體。4.植物的遺傳轉(zhuǎn)化通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法把上述轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入植物基因組，獲得抗性愈傷或再生芽；進(jìn)而將所述的抗性愈傷或再生芽誘導(dǎo)成小植株；對(duì)所述的轉(zhuǎn)基因小植株噴施抗生素(例如卡那霉素)，通過篩選和自交選擇純化，獲得純合的轉(zhuǎn)基因單株或株系。本發(fā)明采用兩類啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)INT基因的表達(dá)，一是利用化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即利用化學(xué)誘導(dǎo)劑(如β-雌二醇)噴施轉(zhuǎn)基因植物的葉面或根，誘導(dǎo)植物體內(nèi)INT基因表達(dá)，從而將所述的外源基因從轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品中清除；二是采用組織特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)INT表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植株特定組織中表達(dá)INT，產(chǎn)生同樣的剔除外源基因效果，獲得無外源基因的植物收獲品。詳細(xì)制備方法如實(shí)施例1-3所示。5.外源基因的剔除外源基因整合進(jìn)植物基因組中，可采用以下兩種方法將外源基因剔除。①當(dāng)轉(zhuǎn)化載體中INT是由化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)化植株通過抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)基因純合株系，以特定的化學(xué)誘導(dǎo)物以誘導(dǎo)種子或植株中INT基因表達(dá)，識(shí)別attP位點(diǎn)并對(duì)兩位點(diǎn)間進(jìn)行特異切除，剔除外源基因，獲得無外源基因的植物產(chǎn)品(例如在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例轉(zhuǎn)基因番茄中，采用抗生素為100mg/L卡那霉素，利用抗生素篩選純化。由于INT是由受雌激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，所以采用β-雌二醇誘導(dǎo)之后，INT重組酶啟動(dòng)表達(dá)，識(shí)別attP靶序列)。當(dāng)轉(zhuǎn)化載體中INT是由組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，在所獲得轉(zhuǎn)基因植株通過同樣的方法獲得純合株系，在特定組織表達(dá)INT，識(shí)別attP位點(diǎn)并對(duì)兩位點(diǎn)間進(jìn)行特異切除，剔除外源基因，獲得在特定組織中無外源基因的植物產(chǎn)品(如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例轉(zhuǎn)基因番茄中，采用抗生素為100mg/L卡那霉素，利用抗生素篩選純化。由于INT受果實(shí)特異表達(dá)驅(qū)動(dòng)子E8(周曉紅等。番茄果實(shí)特異性E8啟動(dòng)子的基因克隆與序列分析?！兜谝卉娽t(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》2003；23(1)25-29)驅(qū)動(dòng)，在果實(shí)發(fā)育成熟后期E8驅(qū)動(dòng)INT表達(dá)，識(shí)別attP靶序列)。其技術(shù)流程見圖6(具體步驟見實(shí)施例1-3所示)。6.分子檢測(cè)、鑒定提取待鑒定的純合轉(zhuǎn)化植株材料DNA，分別以目標(biāo)基因、標(biāo)記基因NPTII和重組酶基因INT的特異引物(如實(shí)施例1-3所示)，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定；或以上述三種外源基因序列為探針進(jìn)行SouthernBlot分子鑒定(具體步驟參見實(shí)施例1)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明利用特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶表達(dá)，在特定發(fā)育階段和發(fā)育器官發(fā)生重組剔除，可以更容易人為控制，具有很強(qiáng)的可操作性。2.本發(fā)明對(duì)外源基因包括目標(biāo)基因，標(biāo)記基因和重組酶基因等安全性加以考慮，徹底緩解轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源基因的生物安全性。3.可以充分對(duì)目標(biāo)基因行使功能之后從植物基因組剔除，既緩解了生物安全性，又改良了植物的性狀。本發(fā)明的有益效果如表1和表2所示表1本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例中外源基因的剔除效率注三種蔬菜作物均本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因作物，其中番茄1是轉(zhuǎn)抗根結(jié)線蟲基因的轉(zhuǎn)基因作物；番茄是耐貯藏轉(zhuǎn)基因番茄作物；小白菜是轉(zhuǎn)BT基因的作物。每個(gè)物種每批處理20株，共三批。表2本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)主要技術(shù)指標(biāo)比較圖1.是本發(fā)明的流程圖。INT基因的啟動(dòng)子可替換為組織特異啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間的多克隆位點(diǎn)可裝載目標(biāo)基因。圖2.是本發(fā)明中可剔除轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的植物轉(zhuǎn)化載體pEGF，INT基因的啟動(dòng)子可替換為組織特異啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間的多克隆位點(diǎn)可裝載目標(biāo)基因。圖3.本發(fā)明的可剔除標(biāo)記基因NPTII和重組酶基因INT的植物轉(zhuǎn)化載體pEGF-ACO，目的基因?yàn)锳CO基因；由于反義ACO基因來自番茄基因組，可以不作外源基因考慮；圖4.本發(fā)明的可剔除標(biāo)記基因NPTII和重組酶基因INT和目標(biāo)基因的植物轉(zhuǎn)化載體pEGF-Mi，目的基因?yàn)榛騇i。圖5.本發(fā)明的可剔除標(biāo)記基因NPTII和重組酶基因INT和目標(biāo)基因的植物轉(zhuǎn)化載體pEGF-Bt，目的基因?yàn)榛駼t。圖6.是本發(fā)明中剔除轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的技術(shù)過程，INT基因的啟動(dòng)子可替換為組織特異啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。圖7.本發(fā)明剔除標(biāo)記基因NPTII和重組酶基因INT，獲得反義ACO植物轉(zhuǎn)化植株的技術(shù)過程。目的基因?yàn)锳CO基因，由于反義ACO基因來自番茄基因組，可以不作外源基因考慮。圖8.本發(fā)明從轉(zhuǎn)基因小白菜基因組剔除標(biāo)記基因NPTII和重組酶基因INT和目標(biāo)基因BT等外源基因，獲得不攜帶外源基因的蔬菜產(chǎn)品的技術(shù)過程。圖9.本發(fā)明中番茄果實(shí)特異表達(dá)重組酶剔除外源基因(包括重組酶基因，標(biāo)記基因和Mi基因)，由抗線蟲轉(zhuǎn)基因番茄獲得不攜帶外源基因的番茄果實(shí)的技術(shù)過程。圖10.本發(fā)明實(shí)施例1分子鑒定結(jié)果，以NPTII探針進(jìn)行Southern雜交，圖中1，3，5--未剔除標(biāo)記基因的純合植株，2，4--剔除標(biāo)記基因植株。圖11.本發(fā)明實(shí)施例2分子鑒定結(jié)果，以NPTII探針進(jìn)行Southern雜交，圖中1，2，3，5，6--未剔除標(biāo)記基因的純合植株，1，4--剔除標(biāo)記基因植株。圖12.本發(fā)明實(shí)施例3分子鑒定結(jié)果，以BT為探針進(jìn)行Southern雜交，圖中1，2，4，6--未剔除標(biāo)記基因的純合植株，3，5--剔除標(biāo)記基因植株。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從轉(zhuǎn)反義ACO基因番茄中剔除標(biāo)記基因和重組酶基因獲得無外源基因的耐貯藏番茄乙烯(ethylene)在植物整個(gè)生命周期中起著至關(guān)重要的作用。植物體內(nèi)乙烯的生成量主要是由ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)活性調(diào)節(jié)。利用基因工程反義表達(dá)ACS和ACO調(diào)控乙烯合成進(jìn)而調(diào)控依稀對(duì)植物的生理效應(yīng)，是當(dāng)前乙烯研究的主要路徑。利用我們構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體和方法，可從轉(zhuǎn)反義ACO基因番茄中剔除標(biāo)記基因，獲得不含標(biāo)記基因和重組酶基因的耐貯藏番茄，需要以下步驟1.載體構(gòu)建在本實(shí)施例中，利用反義抑制技術(shù)利用反義ACO基因(封碧紅等，轉(zhuǎn)ipt和反義ACO基因番茄葉片衰老相關(guān)特性，植物生理與分子生物學(xué)報(bào)，2003，29535-541)抑制番茄果實(shí)乙烯表達(dá)，以延長(zhǎng)番茄果實(shí)貯藏期，提高其耐貯性。由于ACO基因來源于番茄本身基因組，因此ACO不作為外源基因，其生物安全性可以忽略。同時(shí)在番茄果實(shí)中必須持久表達(dá)其反義RNA以達(dá)到反義抑制延長(zhǎng)貯藏期的目的，所以僅僅考慮標(biāo)記基因，剔除標(biāo)記基因即可。以pEGF載體為基本載體，通過酶切連接的方法，把ACO基因?qū)胼d體pEGF，同時(shí)將化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子XVE系統(tǒng)(見ZuoJ等，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.2001，19157-161)裝載入SalI和XbaI之間，形成新的植物轉(zhuǎn)化載體，將該轉(zhuǎn)化載體命名為pEGF-ACO。該載體中，重組酶INT由化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，重組酶基因，標(biāo)記基因目介于兩個(gè)attP位點(diǎn)之間，反義ACO基因位于重組盒之外。其結(jié)構(gòu)圖如圖3。2.番茄遺傳轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)剔除利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，把載體pEGF-ACO轉(zhuǎn)入性狀優(yōu)良的番茄品種“中蔬五號(hào)”(購買自商業(yè)品種)，獲得卡那霉素抗性番茄幼苗。在載體pEGF-ACO中，由于INT是由化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，β-雌二醇誘導(dǎo)之后，INT重組酶啟動(dòng)表達(dá)，識(shí)別attP位點(diǎn)，特異性的切除該兩位點(diǎn)間的所有外源基因，包括標(biāo)記基因NPTII以及重組酶基因INT。后期再生培養(yǎng)基中不加卡那霉素，添加2uM/Lβ-雌二醇誘導(dǎo)INT表達(dá)促進(jìn)重組反應(yīng)。轉(zhuǎn)化過程中通過PCR或Southern雜交等方法，對(duì)獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因植株，以及標(biāo)記基因剔除情況。其技術(shù)流程見圖7。其中番茄的遺傳遺傳轉(zhuǎn)化如下利用電激法(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)，將pEGF-ACO導(dǎo)入到農(nóng)桿菌LBA4404中。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下1)、無菌苗和煙草細(xì)胞培養(yǎng)無菌苗培養(yǎng)番茄“中蔬五號(hào)”種子用70％酒精消毒1min，而后在20％的次氯酸鈉(有效氯6％)中消毒15min，滅菌蒸餾水沖洗3次，將種子接種到1/2MS基本培養(yǎng)基(參見MurashigeT.andF.Skoog.Physiol.Plant，1962，15473-497)中，于25±2℃暗處直至種子發(fā)芽，然后于光照強(qiáng)度18001x，16h光/8h暗的光周期條件下培養(yǎng)。煙草細(xì)胞培養(yǎng)煙草細(xì)胞NT1在KCMS-L中懸浮培養(yǎng)每周按2∶48稀釋繼代。2)、外植體準(zhǔn)備和農(nóng)桿菌培養(yǎng)在分離外植體前一天準(zhǔn)備煙草看護(hù)培養(yǎng)基KCMS-S(看護(hù)培養(yǎng)基)，將生長(zhǎng)了7天的煙草懸浮細(xì)胞吸取1.5ml轉(zhuǎn)移到KCMS-S上，覆蓋一張直徑7cm的滅菌濾紙，25℃黑暗中過夜培養(yǎng)備用。外植體準(zhǔn)備番茄種子發(fā)芽后6天，將無菌苗的子葉剪下或用刀片切下，子葉帶有一小段葉柄接種于KCMS-S中預(yù)培養(yǎng)1天。農(nóng)桿菌培養(yǎng)在含有卡那霉素的LB平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于10ml含有50μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于28℃，150r/m過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期O.D1.03)轉(zhuǎn)化再生將3～4皿的子葉外植體轉(zhuǎn)移到50ml滅菌三角瓶中，經(jīng)以MS0.2稀釋至O.D＝0.2～0.3的農(nóng)桿菌液接種感染5min，并輕輕搖動(dòng)三角瓶，用吸管吸去農(nóng)桿菌液，將外植體轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上，吸干殘留的菌液，回接到KCMS-S上，于22℃進(jìn)行1～2天的共培養(yǎng)；培養(yǎng)后將外植體小心轉(zhuǎn)入MRS1上，2～3周后轉(zhuǎn)入MRS2中。培養(yǎng)選擇培養(yǎng)過程中及時(shí)清除掉農(nóng)桿菌污染的材料。4)、再生芽生根移栽待再生芽長(zhǎng)至1cm左右時(shí)，將芽切下放入RS中生根，2周后對(duì)生根良好，長(zhǎng)至5cm左右的轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行煉苗移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至大田中。表3番茄遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基配方(包括耐貯藏番茄和抗根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)基因番茄操作)注以上培養(yǎng)基除名稱為KCMS培養(yǎng)基的pH為5.5外，其他培養(yǎng)基的pH均為5.8。3分子鑒定對(duì)于以pEGF-ACO轉(zhuǎn)化的植株，收獲第一代種子即T1代。由于T1代進(jìn)行了分離，利用ACO基因上游CaMV35S啟動(dòng)子特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)。有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的植株為含有反義基因的純合與雜合植株，從T1代抗性植株上按單株收獲種子，即T2代。繼續(xù)利用PCR方法選擇T2代植株，在T2代不再分離的株系，證明其對(duì)應(yīng)的T1代植株為純合單株，該株系為純合株系?；蚪M提取及分子雜交方案如下利用CTAB法(Fultonetal.，1995.MicroprepprotocolforextractionofDNAfromtomatoandotherherbaceousplants.PlantMoleculorBiologyReporter，13，207-209)提取待鑒定轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片DNA。取0.5-1g幼嫩葉片于1.5mlEppendorf管中，迅速搗爛，加入700μl提取緩沖液(100mmol/lTris-HCl，pH＝8.0，1.4mol/lNaCl，20mmol/IEDTA，2％CTAB，0.1-2％巰基乙醇)65℃水浴30min，12000r/m離心5min，取上清液，用氯仿異戊醇(按體積比24∶1)抽提1次，加入冰冷的等體積異丙醇，搖勻，靜置，12000r/m離心6min，沉淀用75％酒精洗滌、干燥、TE溶解、RNase處理后保存?zhèn)溆?。以NPTII或INT基因片段的特異探針進(jìn)行SouthernBlot(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)分子鑒定。PCR擴(kuò)增pEGF-ACO載體上的INT(或)NPTII片段為模板，采用隨機(jī)引物法((參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)(α-32p)dCTP標(biāo)記探針。取20μg植物DNABamHI酶切過夜，1％瓊脂糖膠電泳12h。轉(zhuǎn)移到尼龍膜，預(yù)雜交，雜交，于-70℃放射自顯影7天，洗X光片，照相記錄結(jié)果。番茄轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)，基因組DNA通過分子鑒定沒有特異擴(kuò)增產(chǎn)物或雜交信號(hào)的，則證明標(biāo)記基因和重組酶基因從轉(zhuǎn)基因番茄中清除，獲得無標(biāo)記基因的耐貯藏番茄。NPTII引物為正向引物5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；反向引物5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′。分子鑒定結(jié)果如圖10。INT引物見
發(fā)明內(nèi)容。實(shí)施例2從抗根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)基因番茄中獲得無外源基因的番茄果實(shí)產(chǎn)品植物根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是嚴(yán)重制約世界農(nóng)作物產(chǎn)量的重要病原線蟲之一。在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生線蟲的危害超過細(xì)菌和病毒，僅次于真菌病害。番茄根結(jié)線蟲病(Meloidogyneincognita)嚴(yán)重危害番茄種植生產(chǎn)。將抗根結(jié)線蟲基因Mi導(dǎo)入番茄的抗蟲基因工程具有重要的育種實(shí)際意義。與其同時(shí)導(dǎo)入番茄基因組的有抗性標(biāo)記基因NPTII。利用我們構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體和方法，可從抗線蟲轉(zhuǎn)基因番茄中獲得無外源基因的番茄果實(shí)，需要以下步驟1.載體構(gòu)建以pEGF載體為基本載體，通過酶切連接的方法，以番茄果實(shí)特異啟動(dòng)子E8(見周曉紅等，番茄果實(shí)特異性E8啟動(dòng)子的基因克隆與序列分析，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(1)25-29)插入pEGF的SalI和XbaI位點(diǎn)之間，并把Mi基因(彭德良等，番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因研究進(jìn)展，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32(3)220-223)作為目的基因?qū)胼d體pEGF，形成新的植物轉(zhuǎn)化載體，將該載體命名為pEGF-Mi。該載體中標(biāo)記基因，重組酶基因和Mi基因位于兩個(gè)attP位點(diǎn)之間，INT由果實(shí)特異性啟動(dòng)子(E8)驅(qū)動(dòng)表達(dá)。其物理圖譜見圖4。2.植物遺傳轉(zhuǎn)化通過通用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法把pEGF-MI轉(zhuǎn)入番茄(品種為“中蔬五號(hào)”，購自商業(yè)品種)基因組，獲得抗性愈傷和再生芽，通過篩選鑒定(番茄遺傳轉(zhuǎn)化詳見實(shí)施例1)。轉(zhuǎn)化過程中通過PCR或Southern雜交等方法(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)，對(duì)獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因植株。其技術(shù)流程見圖9。3.外源基因的純化對(duì)于以pEGF-Mi轉(zhuǎn)化的番茄植株，收獲T0代果實(shí)，通過PCR和Southern雜交檢測(cè)外源基因的剔除情況，并采收第一代種子即T1代。由于T1代進(jìn)行了分離，葉面噴施100mg/L卡那霉素水溶液對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄植株的T1代植株進(jìn)行篩選。將具顯示有卡那霉素抗性的植株確定為轉(zhuǎn)基因純合或雜合植株，從T1代抗性植株上按單株收獲種子，即為T2代。按同樣的濃度和方法繼續(xù)葉面噴施、選擇T2代轉(zhuǎn)基因番茄植株，選擇T2代不再分離的株系即為純合株系。4.外源基因的消除栽植以上得到的純合株系，并采收其成熟果實(shí)，初步得到無外源基因的轉(zhuǎn)基因番茄5.分子鑒定提取待鑒定番茄成熟果肉DNA，分別以Mi基因(Mi引物正向引物5′-GGTTCTCTAGCTAAACTTCA-3′；反向引物5′-TATTTATCATATCAATATCAC-3′)、標(biāo)記基因NPTII(NPTII引物正向引物5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；反向引物5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′)和重組酶基因INT(INT引物序列見本
發(fā)明內(nèi)容)的特異引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，或以上述三種外源基因序列為探針進(jìn)行SouthernBlot分子鑒定(分子鑒定詳細(xì)方案見實(shí)施例1)。由純化的抗線蟲轉(zhuǎn)基因番茄材料采收的成熟果實(shí)，經(jīng)分子鑒定沒有特異擴(kuò)增產(chǎn)物或雜交信號(hào)的，則證明外源基因已從果實(shí)組織中剔除，獲得無外源基因的番茄果實(shí)。其分子鑒定結(jié)果如圖11所示。實(shí)施例3由轉(zhuǎn)BT基因抗蟲小白菜獲得無標(biāo)記基因的蔬菜產(chǎn)品BT基因來自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國(guó)家工程技術(shù)中心，該基因來自于蘇云金芽胞桿菌(簡(jiǎn)稱BT)基因工程菌WG001的殺蟲晶體蛋白基因“cryIAc”(中國(guó)發(fā)明專利號(hào)ZL01128475.7)，其表達(dá)蛋白能特異毒殺鱗翅目害蟲如小菜蛾等昆蟲。將該基因?qū)胄“撞藢?duì)進(jìn)行蔬菜抗蟲育種具有重要意義。利用本發(fā)明構(gòu)建的植物重組載體pEGF，可從轉(zhuǎn)cryIAc基因抗蟲小白菜中獲得無外源基因的蔬菜產(chǎn)品，具體步驟如下1.載體構(gòu)建以pEGF載體為基本載體，利用XhoI和SpeI對(duì)pEGF進(jìn)行雙酶切，將cryIAc基因?qū)胼d體pEGF，同時(shí)將化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子XVE系統(tǒng)(見ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)裝載入SalI和XbaI之間，形成新的植物轉(zhuǎn)化載體，命名為pEGF-BT。其結(jié)構(gòu)圖如圖5。2.植物遺傳轉(zhuǎn)化利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，把載體pEGF-BT轉(zhuǎn)入小白菜(品種為“矮腳黃”，購自商業(yè)種)，獲得轉(zhuǎn)基因的小白菜植株。轉(zhuǎn)化過程中通過PCR或Southern雜交方法(參見J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)，對(duì)獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因植株(分子鑒定方法見實(shí)施例1)。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和誘導(dǎo)將農(nóng)桿菌LBA4404接種于50mg/L卡那霉素(Km)和50mg/L利福平(Rif)的LB液體培養(yǎng)基，在150r/m，28℃條件下振蕩培養(yǎng)16h，離心收集菌體，重新懸浮于含0.25mol/LCaCl2和100mg/L乙酰丁香酮(AS)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃，150r/m振蕩培養(yǎng)2～4h。小白菜遺傳轉(zhuǎn)化從小白菜無菌苗上切取帶有1～2mm葉柄的子葉，插入MS基本培養(yǎng)基附加2.0mg/L6-BA、1.0mg/L萘乙酸、0.5mg/L脫落酸、7.4g/L瓊脂和30g/L蔗糖(pH5.8)上預(yù)培養(yǎng)2～3天。誘導(dǎo)培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌用無激素的液體MS培養(yǎng)基按1∶10稀釋，將子葉取出浸入稀釋后的農(nóng)桿菌懸浮液中，10min后將子葉取出，并用無菌的吸水紙將材料上多余菌液吸掉，然后將子葉轉(zhuǎn)移到MS-1培養(yǎng)基上，在25℃和漫射光下共培養(yǎng)2～4天。然后將子葉轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基附加300mg/L羧芐青霉素、6mg/LAgNO3、7.4g/L瓊脂和30g/L蔗糖(pH5.8)上培養(yǎng)5～7天，再將子葉移到MS基本培養(yǎng)基附加5mg/L卡那霉素、7.4g/L瓊脂和30g/L蔗糖(pH5.8))進(jìn)行選擇培養(yǎng)，隔2周換一次培養(yǎng)基。30天后切取2厘米長(zhǎng)抗性芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基附加1.0mg/L吲哚-3-乙酸、7.4g/L瓊脂和30g/L蔗糖(pH5.8))。2-3周后獲得轉(zhuǎn)BT基因的小白菜植株。3.植株的純化將以上獲得的以轉(zhuǎn)BT基因化小白菜植株，于收獲第一代種子(即T1代)播種幼苗，用100mg/L卡那霉素水溶液噴施轉(zhuǎn)基因小白菜T1代植株進(jìn)行篩選，選擇具有卡那霉素抗性的植株得到含有BT基因的純合或雜合植株；從T1代抗性小白菜植株上按單株收獲種子，即為T2代。繼續(xù)100mg/L用卡那霉素噴施法選擇T2代植株，在T2代不再分離的株系，證明其對(duì)應(yīng)的T1代植株為純合單株，該株系為純合株系。4.外源基因的剔除對(duì)上述獲得的純合小白菜株系，將其種子播種于田間之后，于該小白菜植株收獲以前，于葉面噴施國(guó)際單位為2μM/Lβ-雌二醇水劑，間隔一天再用通濃度的β-雌二醇水劑噴施葉面一次，該過程稱為化學(xué)誘導(dǎo)劑的應(yīng)用(即接觸)。初步得到不攜帶外源基因的小白菜。其技術(shù)流程見圖8。5.分子鑒定提取待鑒定小白菜葉片或葉柄組織DNA，分別以目標(biāo)基因BT(Bt引物正向引物5′-GTGGAGAACGCATTGAAACC-3′，反向引物5′-TCATTCAGCCTCGAGTGTTGCAGTA-3′)，標(biāo)記基因NPTII(NPTII引物正向引物5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；反向引物5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′)以及重組酶基因INT(INT基因引物序列見本
發(fā)明內(nèi)容)的特異引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，并以上述三種外源基因序列為探針進(jìn)行SouthernBlot分子鑒定(分子鑒定方案詳見實(shí)施例1)。分子鑒定結(jié)果如圖12，圖12表明，沒有雜交信號(hào)的，則證明外源基因已從轉(zhuǎn)基因小白菜中剔除。權(quán)利要求1.一種適用于從轉(zhuǎn)基因植物中剔除外源基因的重組載體pEGF，保藏在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC-M205109。2.一種適用于從茄科或十字花科蔬菜轉(zhuǎn)基因植物中獲得無外源基因植物和植物收獲品的方法，它包括以下步驟1)構(gòu)建一種可遺傳操作的重組載體pEGF，該載體保藏在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC-M205109；2)將目標(biāo)基因裝載于步驟1)所述的載體上，得到植物轉(zhuǎn)化載體；3)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因植物；4)純化和純合步驟3)所述的轉(zhuǎn)基因植物；5)將所述轉(zhuǎn)基因植物與化學(xué)誘導(dǎo)劑接觸或不接觸；6)通過分子檢測(cè)、鑒定得到所述的無外源基因植物或植物收獲品。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟2)所述的目標(biāo)基因是ACO，將其構(gòu)建于重組載體pEGF中，得到轉(zhuǎn)化載體pEGF-ACO。4.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟2)所述的目標(biāo)基因是Mi，將其構(gòu)建于重組載體pEGF中，得到轉(zhuǎn)化載體pEGF-Mi。5.利要求2所述的方法，其中步驟2)所述的目標(biāo)基因是Bt，將其構(gòu)建于重組載體pEGF中，得到轉(zhuǎn)化載體pEGF-Bt。6.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟5)所述的化學(xué)誘導(dǎo)劑為β-雌二醇水溶液，施用濃度為2μM/L。7.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟5)所述的經(jīng)過與β-雌二醇溶液接觸的植物是轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲小白菜。8.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟5)所述的不與β-雌二醇溶液接觸的植物是轉(zhuǎn)基因抗線蟲番茄。9.權(quán)利要求2或7所述的方法，其施用方法是將所述的β-雌二醇溶液與所述的轉(zhuǎn)基因植物的葉面或根部接觸。10.權(quán)利要求1所述的重組載體在剔除轉(zhuǎn)基因番茄或轉(zhuǎn)基因小白菜外源基因中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明利用生物的位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)，結(jié)合組織特異性啟動(dòng)子和化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子設(shè)計(jì)并構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，將目的基因、標(biāo)記基因和位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建于重組酶識(shí)別序列之間，在所獲得的轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)，組織特異性啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶的表達(dá)促使重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)將外源基因從轉(zhuǎn)基因植物的基因組剔除。本發(fā)明還涉及一種通用很好的遺傳重組載體，其保藏號(hào)為CCTCC－M205109，將一些目標(biāo)基因裝于所述的重組載體之上，得到適合遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體，進(jìn)而培育成無外源基因的轉(zhuǎn)基因番茄和小白菜。文檔編號(hào)C12Q1/02GK1952125SQ200510019620公開日2007年4月25日申請(qǐng)日期2005年10月18日優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日發(fā)明者葉志彪,張余洋,李漢霞,歐陽波,盧永恩,張俊紅申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)