一種鯉皰疹病毒檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】一種鯉皰疹病毒檢測試劑盒及其檢測方法，屬于病毒基因組檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。該檢測試劑盒包括10×反應(yīng)緩沖液、1U/μL的Taq酶、各10μM的引物組P1F/P1R、各10μM的引物組P2F/P2R、純水和15μg/mL的陽性DNA。利用本發(fā)明的試劑盒能夠同時(shí)檢測鯉痘病毒、金魚造血組織壞死病毒和錦鯉皰疹病毒的基因組，并且該方法直觀優(yōu)越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時(shí)間久的標(biāo)本中鯉皰疹病毒基因組的效果良好，可用于鯉皰疹病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測和鯉皰疹病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查。
【專利說明】一種鯉皰疹病毒檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒基因組檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鯉皰疹病毒(Cyprinidherpesvieus, CYHV)檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皰疹病毒為線性雙鏈DNA病毒，可引起哺乳動物、禽類和水生動物多種致命性疾病，其中引起魚類嚴(yán)重疾病的皰疹病毒主要有鮰皰疹病毒、鯉痘病毒(carp poxherpesvirus)、金魚造血組織壞死病毒(haematopoietic necrosis herpesvirus ofgoldfish, HNHV)和錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus)，后三者都屬于鯉皰疹病毒，鯉痘病毒屬于鯉皰疫病毒I型(Cyprinid herpesvirus I, CYHV-1),金魚造血組織壞死病毒屬于鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CYHV-2)，錦鯉皰疹病毒屬于鯉皰疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3，CYHV-3)。CYHV-1可引起鯉痘瘡病，主要危害鯉魚、鯽魚及圓腹雅羅魚等，影響魚的生長，降低魚的商品價(jià)值，可造成較大經(jīng)濟(jì)損失。CYHV-2可引起金魚和鯽魚的造血組織壞死癥，該病于1992年在日本愛知縣金魚養(yǎng)殖場首次發(fā)現(xiàn)，之后在美國、中國臺灣、澳大利亞等國和地區(qū)暴發(fā)并流行，其造成死亡率最高可達(dá)100%。2008-2013年造成中國最大的鯽魚養(yǎng)殖基地江蘇鹽城地區(qū)養(yǎng)殖鯽魚暴發(fā)鯉脾腎壞死病，造成幾萬畝的養(yǎng)殖鯽魚死亡。而CYHV-3亦可引起鯉魚和錦鯉的皰疹病毒病，一旦發(fā)病，死亡率達(dá)80%以上。由于以上三種鯉皰疹病毒病還未有有效疫苗可以用來預(yù)防，因此研制出以上三種鯉皰疹病毒病的檢測試劑盒， 是當(dāng)前鯉科魚類養(yǎng)殖需要解決的主要問題。
[0003]由于以上三種鯉皰疹病毒都可感染大部分的鯉科魚類，又由于目前缺乏能同時(shí)檢測以上三種鯉皰疹病毒的檢測方法，這就給需要同時(shí)檢測以上三種病原造成麻煩。本發(fā)明研制的能同時(shí)檢測以上三種鯉皰疹病毒的PCR方法和套式PCR檢測方法，彌補(bǔ)了該【技術(shù)領(lǐng)域】的缺陷，為以上三種鯉皰疹病毒的同時(shí)監(jiān)測提供有力手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種鯉皰疹病毒檢測試劑盒及其檢測方法。該方法能同時(shí)檢測鯉痘病毒(carp pox herpesvirus)、金魚造血組織壞死病毒(haematopoietic necrosis herpesvirus of goldfish, HNHV)和錦趣抱疫病毒(Koiherpesvirus)的基因組。該方法直觀優(yōu)越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時(shí)間久的標(biāo)本中鯉皰疹病毒基因組的效果良好，可用于鯉皰疹病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測和鯉皰疹病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
A、設(shè)計(jì)兩對針對鯉皰疹病毒I型、II型和III型的通用引物
本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的兩對鯉皰疹病毒通用引物，從GenBank中獲得鯉皰疹病毒科全部三個屬代表株全基因組序列，Cyprinidherpesvirus I strain NG-J1, Cyprinid herpesvirus
2strain ST-Jl、Cyprinid herpesvirus 3 KHV-U共3株鯉皰疫病毒基因編碼氨基酸序列和基因組全序列。將所有氨基酸序列和基因組全序列進(jìn)行程序排列，尋找氨基酸序列及對應(yīng)基因組序列均保守的區(qū)域作為引物設(shè)計(jì)區(qū)(見表1)。國內(nèi)外尚未見能同時(shí)檢測鯉皰疹病毒全部三個型通用引物設(shè)計(jì)的研究報(bào)道。
[0006]表1鯉皰疹病毒引物設(shè)計(jì)
【權(quán)利要求】
1.一種鯉皰疹病毒檢測試劑盒，其特征在于該檢測試劑盒包括1X反應(yīng)緩沖液、IU/μ L的Taq酶、各10 μ M的引物組P1F/P1R、各10 μ M的引物組P2F/P2R、純水和15 μ g/mL的陽性DNA ； 所述的 1X 反應(yīng)緩沖液為:Tris-HCl 10mM, KCl 500mM、MgCl2 2OmM 和 dNTPs 2.5mM ； 所述的引物組P1F/P1R中:上游引物PlF序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物PlR序列如SEQ ID NO: 2所示； 所述的引物組P2F/P2R中:上游引物P2F序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物P2R序列如SEQ IDNO:4所示。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述的鯉皰疹病毒檢測試劑盒檢測鯉皰疹病毒的方法，其特征在于: 以檢測樣品的DNA為模板，以引物組P1F/P1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)樣品所含病毒DNA量過低而未見擴(kuò)增核酸條帶時(shí)，再以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用引物組P2F /P2R進(jìn)行第二輪PCR ;當(dāng)?shù)谝惠哖CR擴(kuò)增產(chǎn)物在1213bp處出現(xiàn)一條特異性核酸帶或是第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在952bp處出現(xiàn)一條特異性核酸帶時(shí)，判斷為樣品中含有鯉皰疹病毒DNA。
3.如權(quán)利要求 2所述的檢測方法，其特征在于所述的第一輪和第二輪PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s, 58°C復(fù)性30s，72。。延伸I min，循環(huán)33次，最后72°C延伸8min。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032037SQ201410282525
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】潘曉藝, 沈錦玉, 藺凌云, 袁雪梅, 郝貴杰, 徐洋, 姚嘉赟, 尹文林 申請人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所