一種沙門氏菌血清型鑒定方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種沙門氏菌血清型鑒定方法，包括：1)提取待測樣品中的DNA；2)將步驟1)獲得的DNA作為模板，進行PCR檢測，其中，PCR檢測靶標為沙門氏菌CRISPR1和CRISPR2；3)將步驟2)中的PCR產物進行序列測定；4)借助在線免費軟件CRISPRfinder，尋找對應CRISPR的前三個間隔序列，并與各血清型標準間隔序列進行同源比對；5)比對結果的判斷，可同時鑒定23種沙門氏菌常見血清型。本發(fā)明還提供了一種沙門氏菌血清型的鑒定試劑盒，所述試劑盒包括用于擴增沙門氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物，并提供23種沙門氏菌常見血清型的標準間隔序列表。
【專利說明】一種沙門氏菌血清型鑒定方法及其試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全領域的核酸檢測。具體而言，本發(fā)明涉及沙門氏菌血清型的 鑒定方法及試劑盒。

【背景技術】
[0002] 沙門氏菌（Salmonella)為桿狀的革蘭氏陰性腸道菌，兼性耗氧，大多數(shù)菌株可在 沒有特殊生長因子的合成培養(yǎng)基上生長。沙門氏菌是極其重要的食源性致病菌，對人類和 動物都具有極大危害，而且能夠在人體與動物體間進行傳播。近幾十年來，由沙門氏菌引起 的食物中毒占世界食物中毒病例的第一或第二位。我國每年發(fā)生的細菌性食物中毒事件占 食物中毒事件總數(shù)的30%-90%，中毒人數(shù)占食物中毒總人數(shù)的60% -90%，而在細菌性食 物中毒的病原中，沙門氏菌約為40%。沙門氏菌血清型的種類繁多，目前已達兩千多種，有 些沙門氏菌血清型與其致病性息息相關，而有些血清型并不致病。常見的食物中毒主要由 一些特定的血清型感染引起，如腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、德爾比 沙門氏菌等，因此對于研究沙門氏菌的致病機理及流行病學監(jiān)測，血清型的鑒定是十分必 要的。
[0003] 當前，我國對于沙門氏菌的檢測主要是依靠國標（GBT4789. 4-2010)的方法，根據 沙門氏菌的生化反應，以及抗原抗體反應進行分型鑒定。但是此方法存在一些缺陷，抗原和 分型血清的制備比較復雜，另外，沙門氏菌的抗原與血清的凝集反應有時較為遲緩，反應較 弱，易造成錯誤的分型結果。有些分子分型方法如脈沖場凝膠電泳（PFGE)、多位點序列分型 (MLST)等，其分型結果也可以與不同血清型對應起來，但是PFGE法操作較為繁瑣，對于操 作者的技術水平要求很高，而MLST法需要同時擴增七個看家基因并進行測序和序列分析， 耗時較長，成本較
[0004] 建立一種行之有效的食源性沙門氏菌血清型的鑒定方法，以提高其血清型鑒定的 速度和準確度，使受污染的食品得到及時處理，在公共衛(wèi)生、食品安全和口岸檢疫中都有重 要意義。
[0005] 最近發(fā)現(xiàn)，在細菌和古菌中廣泛存在著成簇規(guī)律間隔短回文重復序列，即CRISPR。 沙門氏菌通常含有兩個CRISPR系統(tǒng)，S卩CRISPR1和CRISPR2,它可以使細菌對噬菌體或質粒 等外源DNA實現(xiàn)免疫，而CRISPR系統(tǒng)中的間隔序列在免疫過程中發(fā)揮著重要作用，是用來 識別外源DNA的標簽，不同的間隔序列與不同噬菌體或質粒上的序列存在高度同源性。同 時，在細菌進化過程中間隔序列存在插入和選擇性剔除的現(xiàn)象，使其具備多態(tài)性，進而在不 同菌株間存在特征性的差異。
[0006] 為此，本發(fā)明人經過長期研究，令人意外地研究出了一種基于沙門氏菌CRISPR1 和CRISPR2前三個間隔序列保守性的沙門氏菌血清型快速鑒定方法。
[0007] 這種沙門氏菌血清型快速鑒定方法針對沙門氏菌血清型CRISPR位點中間隔序列 特異性強，可有效區(qū)分沙門氏菌不同血清型，快速、靈敏，并可以應用于食源性沙門氏菌不 同血清型的鑒定。


【發(fā)明內容】

[0008] 有鑒于現(xiàn)有技術存在上述的問題，本發(fā)明的目的是提供一種快速、靈敏的沙門氏 菌血清型鑒定方法。為此，本發(fā)明的技術方案為：一種沙門氏菌血清型的鑒定方法，包括以 下步驟：
[0009] 1)提取待檢測樣品中的DNA ;
[0010] 2)將步驟1)獲得的DNA作為模板，進行PCR檢測；其中，PCR檢測的靶標為沙門氏 菌 CRISPR1 和 CRISPR2 ;
[0011] 3)將步驟2)中的PCR產物進行序列測定；
[0012] 4)借助在線免費軟件CRISPRfinder，尋找對應CRISPR位點的前三個間隔序列，并 與各血清型標準間隔序列進行同源比對；
[0013] 5)比對結果的判斷：樣品的CRISPR1和CRISPR2的間隔序列分別與某一標準血清 型的CRISPR1和CRISPR2間隔序列至少有兩個一致則判定為對應的血清型。
[0014] 其中蒙得維亞沙門氏菌和傷寒沙門氏菌由于CRISPR2基因的擴增產物拷貝數(shù)過 低或擴增產物片段太小，在測序時不能得出正確的序列信息，而通過多次分離株的驗證，發(fā) 現(xiàn)其CRISPR1基因的前三個間隔序列已經具有較強的血清型特異性，能夠作為血清型鑒別 的依據，故只需比對CRISPR1基因的前三個間隔序列即可。
[0015] 本發(fā)明之所以選CRISPR1和CRISPR2的前三個間隔序列作為檢測靶標是通過如下 方法篩選得到的：
[0016] 選取23種不同血清型，每種血清型各有幾種不同的標準菌株，利用CRISPR1和 CRISPR2 的對應的引物 CRISPR1-F，CRISPR1-R 和 CRISPR2-F，CRISPR2-R，進行 PCR 擴增， 可以得到不同大小的CRISPR1和CRISPR2片段，其中同一血清型的片段大小相近，不同血 清型的片段大小差異明顯，將PCR產物送商業(yè)測序公司測序，測得序列利用在線免費軟件 CRISPRfinder(http://crispr. u-psud. fr/Server/)分析，找出 CRISPR1 和 CRISPR2 各自的 重復序列和間隔序列，重復序列一般為5' -CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3'，然而間隔 序列的差異較大，其中差異主要分為兩個方面：第一個方面，在相同沙門氏菌血清型的菌株 中，間隔序列的數(shù)目有差別，如腸炎沙門氏菌的CRISPR2中普遍含有十個間隔序列，但是有 部分的菌株在菌株進化過程中缺失了或者增加了間隔序列，因此造成同一血清型沙門氏菌 菌株之間的差異，但是最為重要的一點是，相同沙門氏菌血清型的菌株之間開頭的間隔序 列的堿基序列是相同的，也是特異的。第二個方面，在不同沙門氏菌血清型的菌株之間，不 論在間隔序列的數(shù)目上以及在間隔序列的堿基序列上均有很大差異，尤其是間隔序列的堿 基序列，在不同血清型的菌株間沒有共有的。綜上，根據相同沙門氏菌血清型菌株間隔序 列的堿基序列的共性，不同沙門氏菌血清型菌株之間間隔序列的堿基序列的差異性，選取 CRISPR的前三個間隔序列作為鑒別沙門氏菌不同血清型的靶標序列。
[0017] 建立不同血清型沙門氏菌CRISPR1和CRISPR2前三個間隔序列的序列庫。待檢測 的菌株CRISPR1和CRISPR2前三個間隔序列與序列庫中前三個間隔序列比對，與某一標準 血清型的前三個間隔序列中至少兩個一致即判定為對應的血清型。
[0018] 這種新的沙門氏菌血清型鑒定方法的CRISPR1和CRISPR2的引物是通過公用 CRISPR數(shù)據庫檢索下載并海量搜集CRISPR1和CRISPR2的上下游側翼序列，BLAST比對 CRISPR1和CRISPR2的側翼序列，分別得到保守的上下游的堿基序列，利用primer5. 0設計 出引物 CRISPR1-F 和 CRISPR1-R，CRISPR2-F 和 CRISPR2-R。
[0019] 在本發(fā)明中，樣品是潛在含有沙門氏菌菌株的離體樣品，包括食品、血液、血液制 品、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。由于沙門氏菌是食源性致病菌，檢測來自于食品的樣品，屬食 品安全檢測領域。提取DNA以及PCR檢測中所用的試劑和儀器已經為本領域技術人員所掌 握，而且目前有大量商品化的試劑和儀器可供選用。例如，在本發(fā)明的【具體實施方式】中，可 以使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒來提取菌體基因組DNA，可以使用普通的PCR儀完成PCR 檢測。
[0020] 優(yōu)選在本發(fā)明中，CRISPR1和CRISPR2PCR檢測引物為CRISPR1-F (序列為 5' -ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3'）和 CRISPR1-R(序列為 5' -TTGATGAGTATGGTGGTTGTGGT-3'）， CRISPR2-F(序列為 5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3'）和 CRISPR2-R(序列為 5' -GTTGGTAGAATGTG GTGC-3'）。
[0021] PCR的反應過程是本領域技術人員所能掌握的，一般為五步法，預變性、變性、退 火、延伸、再延伸。根據本發(fā)明人研究，最優(yōu)選的CRISPR1和CRISPR2的PCR擴增條件如下：
[0022] CRISPR1 :95°C預變性 10min，95°C變性 lmin，60. 5°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，進 行35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin ;
[0023] CRISPR2 :95°C預變性 10min，95°C變性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，進行 35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種沙門氏菌血清型的檢測試劑盒，包括：
[0025] 1)用于擴增沙門氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物。優(yōu)選地，所述引物為引 物 CRISPR1-F(序列為 5' -ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3'）和 CRISPR1-R(序列為 5' -TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3，），CRISPR2-F(序列為 5，-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3，）和 CRISPR2-R(序列為 5' -GTTGGTAGAATGTG GTGC-3'）。
[0026] 2)沙門氏菌常見血清型的CRISPR1和CRISPR2前三個標準間隔序列表。
[0027] 3)檢測試劑盒還可以包括提取DNA和/或PCR檢測中所用的試劑。這些試劑都是 常用試劑，也可以通過市場渠道購買。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明可鑒定沙門氏菌的血清型為23種，分別為鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella Typhimurium)、腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis)、嬰兒沙門氏菌 (Salmonella Infantis)、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella Choleraesuis)、慕尼黑沙門氏 菌（Salmonella Muenchen)、山夫登堡沙門氏菌（Salmonella Senftenberg)、蒙得維亞沙 門氏菌（Salmonella Montevideo)、布倫登盧沙門氏菌（Salmonella Braenderup)、斯坦利 沙門氏菌（Salmonella Stanly)、湯卜遜沙門氏菌（Salmonella Thompson)、阿貢那沙門氏 菌（Salmonella Agona)、鴨沙門氏菌（Salmonella Anatum)、雞白痢沙門氏菌（Salmonella Pollorum)、德爾比沙門氏菌（Salmonella Derby)、圣保羅沙門氏菌（Salmonella Saintpaul)、印第安納沙門氏菌（Salmonella Indiana)、甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella Paratyphi A)、田納西沙門氏菌（Salmonella Tennessee)、火雞沙門氏菌（Salmonella Meleagridis)、科特布斯沙門氏菌（Salmonella Kottbus)、爪睡那沙門氏菌（Salmonella Javiana)、傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhi)和塞羅沙門氏菌（Salmonella Cerro)。
[0029] 本發(fā)明取得的有益效果在于：沙門氏菌血清型鑒定的CRISPR間隔序列的特異性 強，可有效區(qū)分不同沙門氏菌血清型，使得檢測結果更能滿足實際食品安全檢測的需求；檢 測方法快速、靈敏度高。
[0030] 為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特 別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。依據本說明書 的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是采用本發(fā)明實施例中PCR體系獲得的不同血清型沙門氏菌CRISPR1的擴增 電泳圖。
[0032] 圖2是采用本發(fā)明實施例中PCR體系獲得的不同血清型沙門氏菌CRISPR2的擴增 電泳圖。

【具體實施方式】
[0033] 以下將通過具體的實施例來描述本發(fā)明。如未特別指明之處，可根據本領域技術 人員所熟悉的《分子克隆實驗指南》（第三版）（科學出版社，北京，中國，2005年）等實驗 手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施。
[0034] 一.主要試劑和儀器
[0035] 以下描述中提到的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，購自美國Qiagen公司（Cat. No. 51304) ;ABI9700 普通 PCR 儀，購自 ABI 公司。
[0036] 二.菌株以及DNA的抽提
[0037] 菌株均可以購自于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（CMCC)、美國典型微生物保藏中心 (ATCC)、新西蘭環(huán)境科學研究所醫(yī)學部微生物保藏中心（NZRM)，菌株編號如表1所示。培養(yǎng) 方法可以按照上述菌株提供單位推薦的方法進行，參照廠商說明，用QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒來提取細菌基因組DNA。
[0038] 表1沙門氏菌不同血清型標準菌株以及用本發(fā)明的PCR方法檢測CRISPR的結果
[0039]

【權利要求】
1. 一種沙門氏菌血清型鑒定方法，其特征在于，包括步驟： 1) 提取待檢測樣品中的DNA ; 2) 將步驟1)獲得的DNA作為模板，進行PCR檢測；其中，PCR檢測的靶標為沙門氏菌 CRISPR1 和 CRISPR2 ; 3) 將步驟2)中的PCR產物進行序列測定； 4) 借助在線免費軟件CRISPRfinder，尋找對應CRISPR位點的前三個間隔序列，并與各 血清型標準間隔序列進行同源比對； 5) 比對結果的判斷：樣品的CRISPR1和CRISPR2的間隔序列分別與某一標準血清型的 CRISPR1和CRISPR2間隔序列至少有兩個一致則判定為對應的血清型； 其中，蒙得維亞沙門氏菌和傷寒沙門氏菌只需比對CRISPR1基因的前三個間隔序列即 可。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中檢測CRISPR1所 GAGTATGGTGGTTGTGGT-3' 。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中檢測CRISPR2所用的引物為： CRISPR2-F :5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3' 和 CRISPR2-R :5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中檢測CRISPR1所用PCR的擴 增條件為：95°C預變性10min，95°C變性lmin，60. 5°C退火lmin，72°C延伸lmin，進行35個 循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中檢測CRISPR2所用PCR的擴 增條件為：95°C預變性10min，95°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，進行35個循 環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述沙門氏菌為以下23種中的一種：鼠傷 寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium)、腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis)、嬰兒沙 門氏菌（Salmonella Infantis)、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella Choleraesuis)、慕尼黑沙 門氏菌（Salmonella Muenchen)、山夫登堡沙門氏菌（Salmonella Senftenberg)、蒙得維亞 沙門氏菌（Salmonella Montevideo)、布倫登盧沙門氏菌（SalmonellaBraenderup)、斯坦利 沙門氏菌（Salmonella Stanly)、湯卜遜沙門氏菌（Salmonella Thompson)、阿貢那沙門氏 菌（Salmonella Agona)、鴨沙門氏菌（Salmonella Anatum)、雞白痢沙門氏菌（Salmonella Pollorum)、德爾比沙門氏菌（Salmonella Derby)、圣保羅沙門氏菌（Salmonella Saintpaul)、印第安納沙門氏菌（Salmonella Indiana)、甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella Paratyphi A)、田納西沙門氏菌（Salmonella Tennessee)、火雞沙門氏菌（Salmonella Meleagridis)、科特布斯沙門氏菌（Salmonella Kottbus)、爪睡那沙門氏菌（Salmonella Javiana)、傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhi)和塞羅沙門氏菌（Salmonella Cerro)。
7. -種沙門氏菌血清型檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于PCR擴增沙門 氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述引物為檢測CRISPR1 5'-TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3'，檢測 CRISPR2 所用的 PCR 引物 CRISPR2-F : 5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3' 和 CRISPR2-R :5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。
9. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括常見不同血清型沙門氏菌的 CRISPR1和CRISPR2前三個間隔序列的序列表。
10. 如權利要求7-9任一項所述的試劑盒，其特征在于，還包括提取DNA和/或PCR檢 測中所用的試劑。
【文檔編號】C12R1/42GK104059977SQ201410293102
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權日:2014年6月25日
【發(fā)明者】施春雷, 莊孝飛, 周秀娟, 史賢明, 崔妍 申請人:上海交通大學