用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的tua片段序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列，本發(fā)明通過多序列比對設(shè)計簡并引物、PCR擴(kuò)增、測序，獲得α-微管蛋白基因（TUA）片段序列，根據(jù)所設(shè)計熒光定量特異引物，經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，確認(rèn)TUA片段序列為可在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段不同組織穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。
【專利說明】用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)又名蝶蘭，花型優(yōu)美，花色鮮艷，花序排列整齊，花期長達(dá)3~5個月，被譽為“洋蘭皇后”，具有很高的觀賞價值，也是很多地區(qū)年宵花的第一王打廣品，在花齊廣業(yè)中占據(jù)越來越重要的地位，隨著生物技術(shù)在花齊育種中的廣泛應(yīng)用，蝴蝶蘭的發(fā)育調(diào)控分子機(jī)理成為研究的熱點，相關(guān)基因的表達(dá)分析是其分子調(diào)控機(jī)理研究的主要內(nèi)容，實時定量PCR是基因定量表達(dá)分析研究的重要手段，實施實時定量PCR的關(guān)鍵是要有穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因作為參考標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)參基因的作用是使未知樣本總RNA量標(biāo)準(zhǔn)化， 減少樣本之間的誤差，以獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)(Suzuki等,2000, Biotechniques, 2000,29(2):332-7),目前常用的內(nèi)參基因主要有18S核糖體脫氧核糖核酸(18S rRNA)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、肌動蛋白基因(ACTIN)和微管蛋白基因(TUA和TUB)等，但有研究表明，這些常用的內(nèi)參基因在不同的植物、不同的細(xì)胞類型或不同生理狀態(tài)下的表達(dá)并不是恒定不變的，在一定類型的細(xì)胞中或?qū)嶒炓蛩貤l件下可能是變化的(Andersen etal.,2004, Cancer Research, 64:5245 - 5250 ;張艷君等，2007，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，34:546-550)。實時定量PCR技術(shù)的靈敏度高，要求內(nèi)參基因更為穩(wěn)定的表達(dá)，以滿足試驗的嚴(yán)謹(jǐn)性，保證數(shù)據(jù)的可靠性，盲目地選用內(nèi)參基因，會因其自身表達(dá)的變化，導(dǎo)致實時定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性降低，甚至得到相反或錯誤的結(jié)論，在實時定量PCR中，選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是技術(shù)的核心。在運用實時定量PCR進(jìn)行蝴蝶蘭的基因定量分析研究中，僅有以肌動蛋白基因(ACTIN)作為內(nèi)參基因的報道，在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段及不同組織穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的研究更是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是獲得用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列，TUA片段序列見SEQN0.1。本發(fā)明通過多序列比對設(shè)計簡并引物，將利用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段連接到T載體上進(jìn)行測序，獲得α -微管蛋白基因(TUA)片段序列，根據(jù)TUA片段序列設(shè)計熒光定量特異引物，經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，確認(rèn)TUA片段序列為可在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段不同組織穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，其中簡并引物序列如下所示:
TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT ；
TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC ；
特異引物序列如下所示:
RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC ；
RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。
[0004]為實現(xiàn)本發(fā)明目的，首先根據(jù)已知的植物微管蛋白基因設(shè)計簡并引物，以蝴蝶蘭幼苗期葉片為植物材料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，然后對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析及實時定量表達(dá)穩(wěn)定性檢測，得到在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段及不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的TUA片段序列。其中，簡并引物如下所示:
TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT ；
TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC ；
TUA片段序列的分析是將序列及其編碼的氨基酸序列提交到蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索確認(rèn)；實時定量表達(dá)穩(wěn)定性檢測是根據(jù)獲得的TUA片段序列設(shè)計實時熒光定量PCR的特異引物，特異引物序列如下:
RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC ；
RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。
[0005]以蝴蝶蘭不同發(fā)育階段的根、葉片、莖、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱等16種組織材料進(jìn)行實時熒光定量PCR，依據(jù)溶解曲線及擴(kuò)增產(chǎn)物的測序來確定引物的特異性，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)確定數(shù)據(jù)的有效性，由實時熒光定量PCR的熒光閾值變化分析基因表達(dá)的穩(wěn)定性，16種組織中的循環(huán)閾值平均值為20.57~24.21 ;以凝膠電泳的形式顯示TUA基因的表達(dá)情況，凝膠電泳條帶亮度一致，確定TUA片段序列表達(dá)具有穩(wěn)定性；以此TUA片段序列作為內(nèi)參基因檢測蝴蝶蘭的MADS-box基因DtpsMADS2的表達(dá)特性，結(jié)果表明，DtpsMADS2在營養(yǎng)器官和生殖器官均有表達(dá)，表達(dá)量以盛花期花葶中最高，在花器官各輪結(jié)構(gòu)中只有少量表達(dá)，此測定結(jié)果與已有的研究報道結(jié)果一致。
[0006]本發(fā)明目的通過下列步驟實現(xiàn): 步驟1、簡并引物的設(shè)計。
[0007]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中微管蛋白的同源序列，利用DNAMAN軟件分別進(jìn)行多序列比對，再利用primerf.0軟件在多序列的保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物用于蝴蝶蘭TUA片段序列的克隆，簡并引物如下所示:
TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT ；
TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC。
[0008]步驟2、PCR擴(kuò)增及測序 TUA片段序列的擴(kuò)增
以常見蝴蝶蘭栽培品種‘聚寶紅玫瑰’的葉片為實驗材料，取0.8~1.2 g盛花期的葉片，在液氮中充分研磨，將粉末分別放入1.5mL離心管中,加入I~1.2mL Invitrogen公司的Trizol試劑，充分振蕩混勻，室溫放置5~10 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10~15m,吸取上清液于另一 1.5 mL離心管中，加入0.2~0.3mL氯仿,充分振蕩混勻30~60 s,室溫放置5~10 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m,吸取上清液于另一 1.5 mL離心管中，再次加入0.2~0.3 mL氯仿，充分振蕩30~60 S，室溫放置5~10 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10~15 m，吸取上清液于另一 1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇輕輕混勻，室溫放置10~15 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15~20 m，棄上清液，加入0.8~I mL75%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10-15 m，再棄上清液，再加入0.8~I mL 75%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10~15 m，棄上清液，加入0.8~lmL100%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心10~15 m，棄上清液后放于超凈工作臺放置10~15 m，根據(jù)管內(nèi)RNA沉淀多少加入20~50 μ L RNAaseFree水，在50~60°C水浴中5~10 m，使RNA充分溶解，取I μ L總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷總RNA的質(zhì)量，以28S: 18S約為2為合格，提取的葉片總RNA放于-80°C冰箱備用，采用TaKaRa公司的Reverse TranscriptaseM-MLV試劑將葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，放于_20°C冰箱備用。
[0009]以cDNA為模板，利用步驟I的簡并引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μ L，含 IOXbuffer 2 μ L, TaqDNA 聚合酶 1U，4 種 dNTP 各 150 ymol/L，每條引物 0.5ymol/L,cDNA 模板 1000 ~2000 ng，PCR 擴(kuò)增程序為:95°C變性 3 ~5 m ；95°C 40 s，56 ~60°C 40 s’72°C 40~60 s，35個循環(huán)；72°C延伸10 m，對擴(kuò)增片段進(jìn)行切膠回收純化。
[0010]測序
將回收的擴(kuò)增片段連接到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌株，篩選鑒定并由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行陽性克隆測序，獲得一個長度為773 bp的片段序列，該序列編碼257個氨基酸，將此257個氨基酸序列提交到蛋白數(shù)據(jù)庫中分析，該氨基酸序列屬于微管蛋白家族，顯示773 bp片段序列為TUA基因片段，其序列見SEQ N0.1。
[0011]步驟3、實時熒光定量特異引物的設(shè)計
以獲得的TUA片段序列為基礎(chǔ)，利用DNAMAN和primer5.0軟件，遵循實時熒光定量PCR引物設(shè)計的原則設(shè)計實時熒光定量PCR特異引物，其擴(kuò)增片段為100 bp，實時熒光定量PCR特異引物如下:
RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC;
RT-TUAR:GTGGTCAA GGATGAAATTATCTGAG。
[0012]步驟4、實時熒光定量PCR檢測
利用TUA實時熒光定量PCR特異引物，以幼苗期葉片的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠回收擴(kuò)增片段，連接于PMD19-T克隆載體上，并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中送上海英駿生物技術(shù)公司測序，結(jié)果表明目的片段為TM特異序列。
[0013]選取蝴蝶蘭營養(yǎng)生長階段的組織:包括幼苗期的根和葉片，成苗期的根、葉片和莖，蝴蝶蘭生殖生長階段的組織:包括盛花期的根、葉片、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房和蕊柱，花后期的根、葉片和花葶等16種組織作為實驗材料，以步驟2中的方法提取16種組織的總RNA, 16種組織的總RNA采用TaKaRa公司的PrimeScriptRT reagent Kit withgDNAEraser試劑反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，將cDNA稀釋3~5倍，置于_20°C冰箱備用。
[0014]以稀釋的16種組織的cDNA為模板，利用步驟3中設(shè)計的特異定量引物進(jìn)行實時熒光定量PCR，同時取等量的16種組織的cDNA混合均勻作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍和100000倍及未稀釋樣品6個梯度，以6個梯度的cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，由實時熒光定量PCR儀自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。實時熒光定量PCR的溶解曲線為單峰，顯示引物具有特異性。實時熒光定量PCR的擴(kuò)增效率為100%，相關(guān)系數(shù)為0.997，得到y(tǒng)=-3.23x+21.7的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在16種組織中的循環(huán)閾值平均值為20.57~24.21，顯示特異引物的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)可靠有效，適用于蝴蝶蘭不同發(fā)育時期不同組織基因的實時熒光定量PCR分析。
[0015]利用實時熒光定量特異引物，以16種組織的cDNA為模板，進(jìn)行PCR，20 μ L體系，反應(yīng)條件為:95 V 30 S，95 V 15 s、60°C 15 s、72°C 15 s, 28 個循環(huán)，72°C 5 m，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示，TUA作為內(nèi)參基因在16種組織中亮度基本一致，表明在16種組織中穩(wěn)定表達(dá)，適用于蝴蝶蘭不同發(fā)育時期不同組織基因的定量表達(dá)分析。[0016]以TUA片段序列為內(nèi)參基因，測定蝴蝶蘭發(fā)育相關(guān)基因姻基因DtpsMADS2在各個階段中不同組織中的表達(dá)特性，其步驟如下:
以蝴蝶蘭苗期的根和葉片，成苗期的根、葉片和莖，盛花期的根、葉片、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房和蕊柱，花后期的根、葉片和花葶等16種組織作為實驗材料，所有材料的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄方法如步驟2和步驟4，根據(jù)蝴蝶蘭的姻基因Dtps_S2的序列(NCBI 登錄號 JQ065098)設(shè)計熒光定量引物，qMADS-F: 5’ - GGA TTC TTG ACC GTT ATG AGCGHPqMADS-R: 5’- TTG CAT ATG TCC CCC TGT GAC T_3’，以 TUA為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，基因相對表達(dá)量Rel.Exp = ，其中ACt =Ct (DtpsMADS2基因)-Ct (TUA基因)，Λ Δ Λ=(各植物組織ACV -(幼苗期根Λ Λ)，結(jié)果表明，DtpsMADS2在營養(yǎng)器官和生殖器官均有表達(dá)，表達(dá)量以盛花期花葶中最高，在花器官各輪結(jié)構(gòu)中只有少量表達(dá)，表明DtpsMADS2的表達(dá)與開花進(jìn)程呈正相關(guān)，主要參與花期調(diào)控，此結(jié)果與已有的研究報道結(jié)果一致。
[0017]本發(fā)明確定了 TUA基因片段序列，其穩(wěn)定性經(jīng)由實時熒光定量PCR檢測和驗證，TUA基因片段序列不僅在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段能夠穩(wěn)定表達(dá)，在不同發(fā)育階段的不同組織中亦穩(wěn)定表達(dá)，以此作為內(nèi)參基因?qū)mMADS-box基因DtpsMADS2表達(dá)的特性進(jìn)行檢測，其結(jié)果與已有的研究報道結(jié)果一致，TUA基因片段序列穩(wěn)定表達(dá)的特性，為蝴蝶蘭不同發(fā)育階段及不同組織的相關(guān)基因定量表達(dá)研究提供了高可信度的內(nèi)參基因，為保證在蝴蝶蘭基因定量表達(dá)研究中使未知樣本總RNA量標(biāo)準(zhǔn)化、減少樣本之間的誤差、滿足試驗的嚴(yán)謹(jǐn)性、保證數(shù)據(jù)的可靠性、獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)提供了技術(shù)支撐，TUA基因片段序列是首次確定的在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段及不同組織中均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因序列，這一確定對蝴蝶蘭內(nèi)參基因的研究具有 引領(lǐng)作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1蝴蝶蘭TUA基因?qū)崟r熒光定量PCR的溶解曲線。
[0019]圖2蝴蝶蘭TUA基因?qū)崟r熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]圖3蝴蝶蘭TUA在不同發(fā)育階段不同組織中實時熒光定量PCR的熒光閾值。
[0021]圖4蝴蝶蘭TUA在不同發(fā)育階段不同組織中的表達(dá)情況。
[0022]圖5蝴蝶蘭TUA作為內(nèi)參基因研究一個蝴蝶蘭MADS-box基因的表達(dá)特性。
【具體實施方式】
[0023]步驟1、簡并引物的設(shè)計。
[0024]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中微管蛋白的同源序列，利用DNAMAN軟件分別進(jìn)行多序列比對，再利用primerf.0軟件在多序列的保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物用于內(nèi)參基因片段序列的克隆，簡并引物見
TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT ；
TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC。
[0025]步驟2、PCR擴(kuò)增及測序 TUA片段序列的擴(kuò)增
以常見蝴蝶蘭栽培品種‘聚寶紅玫瑰’的葉片為實驗材料，取I g盛花期的葉片，在液氮中充分研磨，將粉末分別放入1.5 mL離心管中，加入I mL Invitrogen公司的Trizol試劑，充分振蕩混勻，室溫放置10 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m，吸取上清液于另一 1.5mL離心管中，加入0.2mL氯仿，充分振蕩混勻60 S，室溫放置5 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m，吸取上清液于另一 1.5 mL離心管中，再次加入0.2 mL氯仿，充分振蕩30 S，室溫放置5 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m,吸取上清液于另一 1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇輕輕混勻，室溫放置15 m，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m，棄上清液，加入ImL 75%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m，再棄上清液，再加入I mL 75%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m，棄上清液，加入ImL100%的乙醇，在4°C條件下12000轉(zhuǎn)/分離心15 m，棄上清液后放于超凈工作臺放置10 m，根據(jù)管內(nèi)RNA沉淀多少加入20~50 μ L RNAaseFree水，在50~60°C水浴中8 m,使RNA充分溶解，取I μ L總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷總RNA的質(zhì)量，以28S: 18S約為2為合格，提取的葉片總RNA放于-80°C冰箱備用，采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV試劑將葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，置于-20°C冰箱備用。
[0026]以cDNA為模板，利用步驟I的簡并引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(所用試劑購自TaKaRa公司)。PCR 擴(kuò)增體系為 20μ L，含 IOXbuffer 2 μ L, TaqDNA 聚合酶 1U，4 種 dNTP 各 150μ mol/L,每條引物0.5 μ mol/L, cDNA模板1000~2000ng, PCR擴(kuò)增程序為:95°C變性3~5 m ；95°C 40 s，56~60°C 40 s，72°C 40~60 s，35個循環(huán)；72°C延伸10 m，對擴(kuò)增片段進(jìn)行切膠回收純化。
[0027]測序
將回收的擴(kuò)增片段連接到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌株，篩選鑒定并由上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行陽性克隆測序，獲得一個長度為773 bp的片段序列，該序列編碼257個氨基酸，將此257個氨基酸序列提交到蛋白數(shù)據(jù)庫中分析，該氨基酸序列屬于微管蛋白家族，顯示773 bp片段序列為TUA基因片段，其序列見SEQ N0.1。
[0028]步驟3、實時熒光定量PCR特異引物的設(shè)計
以獲得TUA片段序列為基礎(chǔ)，利用DNAMAN和primer5.0軟件，遵循實時熒光定量PCR引物設(shè)計的原則設(shè)計實時熒光定量PCR引物，其擴(kuò)增片段為100 bp,實時熒光定量PCR特異引物序列如下:
RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC;
RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。
[0029]步驟4、實時熒光定量PCR檢測
利用TUA實時熒光定量PCR特異引物，以幼苗期葉片的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠回收擴(kuò)增片段，連接于PMD19-T克隆載體上，并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中送上海英駿生物技術(shù)公司測序，結(jié)果表明目的片段為TM特異片段。
[0030]選取蝴蝶蘭營養(yǎng)生長階段的組織:包括幼苗期的根和葉片，成苗期的根、葉片和莖，蝴蝶蘭生殖生長階段的組織:包括盛花期的根、葉片、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房和蕊柱，花后期的根、葉片和花葶等16種組織作為實驗材料，以步驟2中的方法提取16種組織的總RNA, 16種組織的總RNA采用TaKaRa公司的PrimeScriptRT reagent Kit withgDNAEraser試劑反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，將cDNA稀釋3~5倍，置于_20°C冰箱備用。
[0031] 以稀釋的16種組織的cDNA為模板，利用步驟3中設(shè)計的特異定量引物進(jìn)行實時熒光定量PCR，同時取等量的16種組織的cDNA混合均勻作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍和100000倍及未稀釋樣品6個梯度，以6個梯度的cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，由實時熒光定量PCR儀自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。實時熒光定量PCR的溶解曲線為單峰，顯示引物具有特異性。實時熒光定量PCR的擴(kuò)增效率為100%，相關(guān)系數(shù)為0.997，得到y(tǒng)=-3.23x+21.7的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在16種組織中的循環(huán)閾值平均值為20.57~24.21，顯示特異引物的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)可靠有效，適用于蝴蝶蘭不同發(fā)育時期不同組織基因的實時熒光定量PCR分析。
[0032]利用實時熒光定量特異引物，以16種組織的cDNA為模板，進(jìn)行PCR，20 μ L體系，反應(yīng)條件為:95 V 30 S，95 V 15 s、60°C 15 s、72°C 15 s, 28 個循環(huán)，72°C 5 m，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析(圖4)，結(jié)果顯示，7B4作為內(nèi)參基因在16種組織中亮度基本一致，表明在16種組織中穩(wěn)定表達(dá)，適用于蝴蝶蘭不同發(fā)育時期不同組織基因的定量表達(dá)分析。
[0033]以TUA片段序列為內(nèi)參基因，測定蝴蝶蘭發(fā)育相關(guān)基因MADS-box基因DtpsMADS2在各個階段中不同組織中的表達(dá)特性，其步驟如下:
以蝴蝶蘭苗期的根和葉片，成苗期的根、葉片和莖，盛花期的根、葉片、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房和蕊柱，花后期的根、葉片和花葶等16種組織作為實驗材料，所有材料的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄方法如步驟2和步驟4，根據(jù)蝴蝶蘭的姻基因Dtps_S2的序列(NCBI 登錄號 JQ065098)設(shè)計熒光定量引物，qMADS-F: 5’ -GGA TTC TTG ACC GTT ATG AGCG-3’ 和 qMADS-R: 5，-TTG CAT ATG TCC CCC TGT GAC T_3，，以 TUA 為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量 PCR。DtpsMADS2 基因相對表達(dá)量 Rel.Εχρ = 2-ΛΛα ,其中 ACt =Ct (DtpsMADS2 基因)-Ct (TUA基因)，Λ Δ Λ=(各植物組織ACV -(幼苗期根Λ Λ)，結(jié)果表明，DtpsMADS2在營養(yǎng)器官和生殖器官均有表達(dá)，表達(dá)量以盛花期花葶中最高，在花器官各輪結(jié)構(gòu)中只有少量表達(dá)，表明DtpsMADS 2的表達(dá)與開花進(jìn)程呈正相關(guān)，主要參與花期調(diào)控，此結(jié)果與已有的研究報道結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1.用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列，其特征在于，獲得了用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列，TUA片段序列如SEQ N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的用于蝴蝶蘭內(nèi)參基因的TUA片段序列的制備方法，其特征在于，通過多序列比對設(shè)計簡并引物，將利用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段連接到T載體上進(jìn)行測序，獲得α -微管蛋白基因(TUA)片段序列，根據(jù)TUA片段序列設(shè)計熒光定量特異引物，經(jīng)實時熒光定量PCR檢測確認(rèn)TUA片段序列為可在蝴蝶蘭不同發(fā)育階段不同組織穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，其中簡并引物序列為:
TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT ；
TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC ； 特異引物序列為
RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC ；
RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017812SQ201410303776
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】袁秀云, 蔣素華, 梁芳, 王林青, 王默霏 申請人:鄭州師范學(xué)院