煙草ATP synthase內參基因的克隆方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及煙草基因表達過程中所需的一種內參 基因ATPsynthase。
【背景技術】
[0002] 煙草(NicotianatabacumL.)為前科煙草屬，含有尼古丁(Nicotine)的葉用一年 生作物。人類使用煙草大約有1500年的歷史，作為煙草工業(yè)的重要原料，將葉片采收后經(jīng)過 調制、分級、加工處理，制成卷煙、雪茄煙、斗煙、嚼煙及鼻煙等，供人嗜用。煙草是經(jīng)典的基 因工程研究模式作物之一，然而，在分析煙草基因表達過程中可供選擇的內參基因并不多 見。目前，文獻中報道較多的有GAPDH、EF-la，而在其他植物中廣泛使用的內參基因，在煙草 中并未得到明確的克隆和驗證。同時，由于內參基因的選擇存在不通用性，即不同物種間的 內參基因存在差異性。這就要求在煙草中使用其他植物中的內參基因，要根據(jù)實驗要求開 展必要的穩(wěn)定性評價與鑒定。隨著基因芯片技術越來越成熟，大量的基因芯片數(shù)據(jù)為新內 參基因的挖掘提供了良好的數(shù)據(jù)基礎和平臺，為內參基因的選擇提供了更為廣闊的空間。 與傳統(tǒng)同源性比對方法所獲的內參基因相比較，通過基因芯片表達技術篩選到的內參具有 高量表達和穩(wěn)定表達的特性。
[0003] 實時焚光定量PCR(real-timequantitativereversetranscriptionPCR， qRT-PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應循環(huán)后產物總 量的方法。利用qRT-PCR分析基因表達水平是現(xiàn)在分子生物學中重要的研究手段，qRT-PCR 具有定量準確、靈敏度高和高通量等特點。在qRT-PCR中，對目標基因相對表達量的分析是 通過內參基因的均一化來確定。因此，內參基因的選擇是qRT-PCR的關鍵步驟。一個理想的 內參基因應該是在不同發(fā)育階段和不同組織器官中穩(wěn)定表達，且表達量不受其他外界因 素、實驗處理條件的影響。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)特別理想的內參基因。因此，研究者必須結合 各自的實驗條件和樣品類型來選擇合適的內參基因。
[0004] ATPsynthase是植物細胞能量合成中關鍵的一個酶，在植物細胞生物學代謝過程 中扮演一個基本的重要角色，ATPsynthase基因在植物不同組織器官以及不同生長階段的 高量、穩(wěn)定表達對植物的生命活動有著重要的意義。ATPsynthase基因在動物中作為內參 基因的研究較多，而在植物中鮮有相關報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供煙草ATPsynthase基因序列，可作為煙草內參基因的應用。并同時提 供克隆煙草ATPsynthase基因的特異性引物，建立基于SYBRGreen熒光染料技術的qRT-PCR方法，從而作為煙草ATPsynthase的內參基因，為利用實時熒光定量PCR對煙草基因表 達分析的研究提供有用的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案： 一種煙草ATPsynthase基因序列的克隆方法，通過對煙草不同生長發(fā)育時期的99個不 同組織樣本的芯片表達數(shù)據(jù)分析，篩選出在所有樣品中穩(wěn)定表達的變異系數(shù)(coefficient ofvariation，CV)較小的組成型ATPsynthase基因序列，以引物對ATPsynthase-F/ATP synthase-R進行PCR擴增、獲得陽性克隆，后經(jīng)質粒測序驗證；其中引物序列如SEQID N0.1/SEQIDN0.2K*。
[0007] 所獲得的目的片段如SEQIDNO.3,大小為681bp。
[0008] 所述PCR擴增的反應程序如下：94°C預變性4min，94°C變性30s，58°C退火30s， 72°C延伸2min，共25個循環(huán)，再72°C終延伸10min，4°C保存。
[0009] 本發(fā)明還提供一種qRT-PCR擴增ATPsynthase基因部分序列的方法，以ATP synthase的基因序列為基礎，按照qRT-PCR引物設計的原則設計出一對熒光定量特異引物。 以煙草不同生長發(fā)育時期、不同組織器官以及不同激素處理條件下的20個樣本的cDNA為模 板，利用半定量PCR評估ATPsynthase基因表達水平的穩(wěn)定性和可靠性之后，進一步進行實 時熒光定量PCR擴增，熒光染料為SYBRGreen，其中qRT-PCR的定量引物，其序列如SEQID N0.4/SEQIDN0.5K*。
[0010] 所述的qRT-PCR擴增反應程序如下：在95°C預變性10min，先運行40個循環(huán)再95°C 變性15s，60°C退火30s，然后為檢測PCR擴增基因的特異性，在PCR反應之后運用溶解曲 線，擴增溫度以〇.5°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，每個增幅的時間為5s。
[0011] 本發(fā)明的有益效果在于： 1. 本發(fā)明首次克隆到煙草ATPsynthase基因，其穩(wěn)定性和特異性經(jīng)由半定量PCR和實 時熒光定量PCR檢測和驗證； 2.ATPsynthase基因不僅在煙草不同組織器官、不同生長發(fā)育階段的組織中穩(wěn)定表 達，而且能夠在各種激素處理條件下亦穩(wěn)定表達。ATPsynthase基因穩(wěn)定表達的特性，為 煙草不同發(fā)育階段、不同組織器官、不同激素處理相關基因表達的定量研究提供了新的高 可信度的內參基因； 3. 經(jīng)實驗驗證，本發(fā)明所設計的用于熒光定量PCR檢測的引物亦可用于半定量PCR快速 檢測，且擴增特異性和穩(wěn)定性良好。
【附圖說明】
[0012]圖1:本發(fā)明中煙草ATPsynthase基因擴增的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 其中：]\C%BM2000Marker，l為煙草ATPsynthase基因； 圖2:本發(fā)明的ATPsynthase基因在煙草不同生長發(fā)育階段、不同組織器官中PCR擴增 的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3:本發(fā)明的ATPsynthase基因在煙草不同激素處理條件PCR擴增的1%瓊脂糖凝膠電 泳圖； 圖4:本發(fā)明中ATPsynthase基因實時熒光定量PCR擴增曲線圖； 圖5:本發(fā)明中ATPsynthase基因實時熒光定量PCR擴增的溶解曲線圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0014]實施例1.煙草ATP synthase基因的克隆 1.1煙草總RNA提?。?取約100mg煙草新鮮組織，在液氮中迅速研磨成粉末，加入相應量BB6(每lmLBB6，加10μ L0-疏基乙醇，現(xiàn)用現(xiàn)配），禍旋劇烈振蕩混勾；室溫孵育3min后，12000g離心2-5min，小心 吸取離心管中的上清至RNase-free的離心管中；向上清中加入0.5倍體積無水乙醇，并禍旋 徹底混勻，分散沉淀，再將得到的溶液和沉淀一起加入離心柱中，以12000g離心30s，棄掉流 出液后，加500ULCB6，室溫12000g離心30s，棄掉流出液；向離心柱中央加入80yL的DNasel 工作液，室溫放置15min，重復該步驟一次，以除去基因組DNA;加500燦WB6，12000g離心 30s，棄掉流出液;再12000g離心2min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置數(shù)分鐘，徹底晾干 離心柱后，加50yLRNase-freeH2O在離心柱的中央，室溫靜置lmin，12000g離心2min，洗脫 RNA。將luL原始樣品稀釋10倍或100倍后，取5nL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整 性檢測。并取lyLRNA用微量紫外分光光度計(NanoDrop2000)測定RNA樣品的純度和濃度值。 將合格樣品置于_8〇°C保存待用。
[0015] 1.2PCR擴增引物序列 ATP synthase的上游引物如SEQ ID NO. 1所示；ATP synthase的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
[0016]根據(jù)基因芯片表達分析所得到的在不同生長發(fā)育時期組織樣本中穩(wěn)定表達、且變 異系數(shù)較小的ATPsynthase基因，用Primer5.0軟件設計該擴增引物，最后由北京六合華 大基因科技股份有限公司合成。
[0017] 1.3 反轉錄(RT) 以煙草總RNA為模板，在25uL的反轉錄體系設置和反應過程中依次加入以下試劑:2.0ygRNA，1.5yL01igo(dT)Primer(20ymol/L)，再加RNase-freeH2O至 14yL;70°C溫浴6min 后，迅速將離心管放入冰浴中，再依次加入5.0仙的M-MLV5XBuffer，1.0yL的M-MLV逆轉 錄酶，l.OyL的RNaseinhibitor和4.0yLdNTPMixture，混勾后，42°C溫育75min，加水稀 釋5倍后，-20°C保存。
[0018] 1.4聚合酶鏈式反應(PCR) 以步驟1.3得到的cDNA為模板，以步驟1.2中獲得的序列為引物進行PCR擴增。PCR采用 以下25μ1反應體系：50ng