一種frm1基因cgg序列重復(fù)的檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種FRM1基因CGG序列重復(fù)的檢測(cè)方法及應(yīng)用。其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟：設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，內(nèi)參引物和檢測(cè)引物，一對(duì)內(nèi)參引物位于CGG重復(fù)區(qū)的5’端，另外一對(duì)檢測(cè)引物跨越整個(gè)CGG重復(fù)區(qū)。當(dāng)此檢測(cè)引物覆蓋區(qū)域內(nèi)的CGG重復(fù)數(shù)在0至200之間，會(huì)擴(kuò)增出一條（470+3n）bp（n為CGG重復(fù)數(shù)）的片段；當(dāng)此檢測(cè)引物覆蓋區(qū)域內(nèi)的CGG序列重復(fù)數(shù)超過(guò)200時(shí)，實(shí)驗(yàn)條件限制反應(yīng)，擴(kuò)增不出任何的片段的；此技術(shù)在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩條不同的產(chǎn)物，根據(jù)和DNA標(biāo)記之間的比對(duì)來(lái)鑒定樣本基因型。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)FRM1基因CGG序列重復(fù)，可以輔助快速方便地查出脆性X染色體綜合征致病基因的攜帶者以及病人，可應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、阻止患兒出生，降低脆性X綜合癥的發(fā)病率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種FRM1基因CGG序列重復(fù)的檢測(cè)方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是分子生物學(xué)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

【背景技術(shù)】
[0002] FMR1基因位于X染色體的q27. 3,序列長(zhǎng)度約38kb，由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子 組成，編碼脆性X智力殘疾基因蛋白（FMRP)。FMR1基因是一個(gè)高度保守的基因，其5'端外 顯子上的非翻譯區(qū)內(nèi)有一個(gè)（CGG) η三核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，（CGG) η片段在重復(fù)模式上存 在多態(tài)性，并且可以遺傳，在其上游大約250bp處有一個(gè)CpG島。正常FMR1基因（CGG)n中 η的數(shù)值介于7至54之間。當(dāng)η增加到54至200時(shí)，攜帶者表型雖正常，但在傳代過(guò)程中易 發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展，這種FMR1基因的突變稱(chēng)為FMR1基因的前突變。前突變的FMR1基因中的 CpG島一般不甲基化，F(xiàn)MR1基因具有正常的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平，不表現(xiàn)出臨床癥狀。當(dāng)η擴(kuò) 展達(dá)200以上時(shí)，男性表型100%表現(xiàn)為典型的脆性X染色體綜合征（Fragile X Syndrome)， 女性中也有30%-50%表型表現(xiàn)輕重程度不等的智力殘疾（Martin-Bell綜合征)，這種FMR1 基因的突變稱(chēng)全突變。前突變至全突變的擴(kuò)展是嚴(yán)格母系的遺傳，全突變（CGG)n重復(fù)序列 大量擴(kuò)展，引起FMR1基因5'端CGG序列重復(fù)區(qū)一側(cè)的CpG島異常甲基化，使FMR1基因失， 導(dǎo)致FMRP的缺失引起智力殘疾。
[0003] FMR1基因突變可以導(dǎo)致脆性X染色體綜合征，是智力殘疾的主要因素之一。脆性X 染色體綜合征是一種發(fā)病率僅次于先天愚型的遺傳性智能低下綜合征，發(fā)病率占全部?jī)和?的0. 05%，呈X連鎖遺傳，占 X連鎖智能低下的40%。其外顯率因性別不同有差異，男性80%， 女性30%。95%以上的脆性X染色體綜合征患者發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是FMR1基因（CGG) η結(jié)構(gòu)擴(kuò)展的動(dòng)態(tài)突變引起的，約5%以下則是由于FMR1基因的錯(cuò)義突變和缺失型突變影響 了 FMRP的正常結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的。脆性X染色體綜合征發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，遺傳規(guī)律明確， 目前無(wú)有效的治療方法，要降低其發(fā)病率，關(guān)鍵是查出攜帶者及病人，然后通過(guò)遺傳咨詢(xún)、 產(chǎn)前診斷、阻止患兒出生。
[0004] 目前針對(duì)FMR1基因的檢測(cè)方法主要為RFLP連鎖分析、DNA雜交分析、PCR擴(kuò)增等 方法，但是由于FMR1基因 CGG序列重復(fù)區(qū)和CpG島中高含量的CG使FMR1基因的DNA解鏈 以及引物的延伸都變得非常困難。
[0005] 鑒于以上的問(wèn)題，一種可操作性更強(qiáng)的檢測(cè)方法的發(fā)明是一種趨勢(shì)的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題主要是： FMR1基因其5'端外顯子上的非翻譯區(qū)CGG序列重復(fù)區(qū)和CpG島中有高含量的CG，這 使FMR1基因的DNA解鏈以及引物延伸變得非常困難，這使得針對(duì)FMR1基因的PCR擴(kuò)增和 測(cè)序反應(yīng)的一次成功率很低，失敗率高。
[0007] 已有的報(bào)道中所采用的檢測(cè)方法是采用一種針對(duì)高GC含量的PCR擴(kuò)增方法，但 是，針對(duì)CG含量如此高的序列在實(shí)際操作中并不容易實(shí)現(xiàn)，失敗的幾率非常高，不能開(kāi)發(fā) 為針對(duì)FMR1基因中CGG序列重復(fù)數(shù)的穩(wěn)定檢測(cè)手段。
[0008] 為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明技術(shù)提供了一種檢測(cè)FRM1基因 CGG序列重復(fù)的方法， 其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟： 在FMR1基因 CGG序列重復(fù)區(qū)設(shè)定一對(duì)內(nèi)參引物：正向引物F和反向引物M，擴(kuò)增的片 段作大小約為220bp，用于驗(yàn)證PCR反應(yīng)是可行的和為計(jì)算CGG序列重復(fù)數(shù)提供基準(zhǔn)。 [0009] 所述擴(kuò)增的內(nèi)參引物序列為： SEQ NO. 1 F :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 2 Μ:5' -CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3' 在FMR1基因 CGG序列重復(fù)區(qū)下游設(shè)定一對(duì)引物：正向引物F1和反向引物R，擴(kuò)增片段 大小約為（470+3n) bp (η代表CGG重復(fù)數(shù))，用于確定CGG序列重復(fù)數(shù)所在的區(qū)域。
[0010] 所述擴(kuò)增的反向引物序列為： SEQ NO. 3 F1 :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 4 R:5' -AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3' 所述具體處理步驟如下： (1) DNA提取，取200 μ L DNA樣本溶液用試劑盒提取DNA，采用核酸分析儀或分光光度 計(jì)進(jìn)行DNA濃度及純度鑒定； (2) 反應(yīng)體系的配置,在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入一定的反應(yīng)體系； (3) 按一定的程序進(jìn)行擴(kuò)增； (4) 電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
[0011] 所述反應(yīng)體系以下：

【權(quán)利要求】
1. 一種FRM1基因 CGG序列重復(fù)的檢測(cè)方法及應(yīng)用，其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步 驟： 設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，內(nèi)參引物以及檢測(cè)引物，一對(duì)內(nèi)參引物位于CGG重復(fù)區(qū)的5'端；另外 一對(duì)檢測(cè)引物跨越整個(gè)CGG重復(fù)區(qū)； 所述擴(kuò)增的內(nèi)參引物序列為： SEQ NO. 1 F :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 2 Μ:5' -CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3' 所述擴(kuò)增的檢測(cè)引物序列為： SEQ NO. 3 F1 :5' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3' SEQ NO. 4 R:5' -AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3'。
2. 根據(jù)權(quán)利1所述的FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，檢測(cè)的引物可以采用相同或 不同的熒光染料標(biāo)記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述方 法的具體處理步驟如下： (1) DNA提取，取200 μ L DNA樣本溶液用試劑盒提取DNA，采用核酸分析儀或分光光度 計(jì)進(jìn)行DNA濃度及純度鑒定； (2) 反應(yīng)體系的配置,在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入一定的反應(yīng)體系； (3) 按一定的程序進(jìn)行擴(kuò)增； (4) 電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟 (2)反應(yīng)體系如下： 10Χ 擴(kuò)增緩沖液 5. 0 ul ;25mMMg2+ 4. 0 ul ;10mM dATP 1. 0 ul ;10mM dTTP 1. 0 ul ;10mM dCTP 1. 0 ul ;10mM dGTP 1. 0 ul ;10mM 7-deza-dGTP 2. 0 ul ;二甲亞砜 3. 0 ul ;引物（SEQ N0.120pmol/ul)1.5uld|*(SEQN0.2 20 pmol/ul)1.0uld|*(SEQN0.3 20 pmol/ul) 2. 0 ul ;無(wú)菌水 30. 0 ul ;模板 DNA (10 ng/ul) 2. 0 ul。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述 步驟（3) 按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增： 95°C lOmin ； 80 °C 8min ； 向每個(gè)反應(yīng)孔中加入5. 0U的DNA擴(kuò)增酶； 95°C 45sec - 58°C lmin - 72°C 4min，10 個(gè)循環(huán)； 95°C 15sec - 58°C lmin - 72°C 5min，20 個(gè)循環(huán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述 電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果步驟如下：配1. 5%瓊脂糖凝膠，取9 μ L擴(kuò)增的產(chǎn)物與10倍濃度上樣緩 沖液混勻后上樣，120V電泳30min，紫外判斷PCR結(jié)果。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，其特征還在于通 過(guò)凝膠電泳、毛細(xì)電泳等電泳方法分析樣本中FRM1基因序列CGG重復(fù)和拷貝數(shù)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)FRM1基因序列CGG重復(fù)的檢測(cè)方法，其特征在于：結(jié)果 判讀的標(biāo)準(zhǔn)如下 (1) 在同一泳道出現(xiàn)兩條條帶，一條條帶大小在DNA標(biāo)記220bp處，另一條條帶大小在 DNA標(biāo)記220bp和640bp之間，則表明樣本的CGG序列重復(fù)數(shù)小于54,樣本結(jié)果為正常； (2) 在同一泳道出現(xiàn)兩條條帶，一條條帶大小在DNA標(biāo)記220bp處，另一條條帶大小在 DNA標(biāo)記640bp和1077bp之間，則表明樣本的CGG序列重復(fù)數(shù)在54和200之間，樣本結(jié)果 為前突變； (3) 在同一泳道出現(xiàn)一條條帶，這條條帶大小在DNA標(biāo)記220bp處；樣本結(jié)果為全突 變； (4) 在同一泳道未任何條帶出現(xiàn)時(shí)，表明DNA提取出現(xiàn)問(wèn)題，需要重新進(jìn)行試驗(yàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法在檢測(cè)FRM1基因序列CGG序列重復(fù)數(shù) 中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104059981SQ201410312722
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】傅詠南, 何駿奇, 王校 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司