一種與鉑類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種與鉑類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs12883763、rs13014982、rs6750741、rs11892526、rs430253、rs7610842、rs12639117、rs623393、rs2051802、rs11968978、rs9390164、rs1485282、rs1904023、rs11026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451的組合。該標(biāo)志物可用于制備鉑類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷試劑盒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種與鉑類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀(jì)60年代以來(lái)，以順鉬為代表的鉬類(lèi)抗癌藥廣泛用于非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)等惡性腫瘤的治療，已成為NSCLC化療中不可缺少的藥物。鉬類(lèi)藥物進(jìn)入人體后迅速分布至全身，既可抑制腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散，也可殺滅遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤，對(duì)原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有治療作用。但由于鉬類(lèi)化療藥物對(duì)細(xì)胞選擇性差，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常的細(xì)胞也有很大的破壞作用，常引起一些毒副反應(yīng)。
[0003]血液中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞都源于骨髓干細(xì)胞，血液中的血細(xì)胞壽命短，常常需要不斷補(bǔ)充，為了達(dá)到及時(shí)補(bǔ)充的目的，作為血細(xì)胞前體的干細(xì)胞必須快速分裂，而鉬類(lèi)化療藥物常常導(dǎo)致正常骨髓細(xì)胞受到抑制，主要表現(xiàn)為白細(xì)胞(尤其是中性粒細(xì)胞)減少以及血小板減少。因此骨髓抑制毒副反應(yīng)的評(píng)價(jià)可按照上述指標(biāo)(單位血液體積內(nèi)白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白、粒細(xì)胞的水平)分為0、1、2、3-4四個(gè)毒性等級(jí)。骨髓抑制是鉬類(lèi)化療影響最大的不良反應(yīng)，常導(dǎo)致化療中斷或抗腫瘤藥物減量，影響治療效果，嚴(yán)重的骨髓抑制甚至可出現(xiàn)出血、感染等并發(fā)癥，危及患者的生命。因此，對(duì)接受鉬類(lèi)藥物化療的NSCLC患者進(jìn)行骨髓抑制毒性發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的診斷，對(duì)高危個(gè)體提前采取針對(duì)性的保護(hù)措施，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，顯得尤為重要。
[0004]許多因素能影響鉬類(lèi)藥物骨髓抑制毒副反應(yīng)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，如年齡、性別、吸煙、種族等。然而，在相同的臨床病理因素(臨床分期、年齡、性別、組織學(xué)類(lèi)型、發(fā)病部位及腫瘤大小等)下，采用同樣的治療手段，接受鉬類(lèi)藥物化療的NSCLC患者是否發(fā)生骨髓抑制毒性及其發(fā)生的嚴(yán)重程度仍有很大差異，提示在同等環(huán)境暴露下，具有不同遺傳背景的NSCLC個(gè)體鉬類(lèi)藥物骨髓抑制毒性的易感性不同。
[0005]研究表明，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是引起鉬類(lèi)藥物毒副反應(yīng)的重要遺傳因素。SNP是指人群中出現(xiàn)頻率大于I %的單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。SNP的存在能影響基因的結(jié)構(gòu)或功能，被認(rèn)為賦予了個(gè)體不同的表型性狀，以及對(duì)于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性，因此SNP可能是導(dǎo)致個(gè)體對(duì)常見(jiàn)疾病發(fā)生、預(yù)后，以及對(duì)藥物反應(yīng)易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。利用疾病易感的SNP譜診斷疾病，不僅靈敏、準(zhǔn)確和快速，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，針對(duì)腫瘤和心血管疾病等常見(jiàn)重大疾病的SNP研究已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)。
[0006]然而，目前還沒(méi)有將SNP應(yīng)用于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷的報(bào)道，若能篩選出鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性易感的SNP作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對(duì)我國(guó)鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷的現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)，也為其藥物預(yù)防與控制開(kāi)辟了新的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提出一種與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP標(biāo)志物。
[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物。
[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物。
[0010]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物及其特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明第五個(gè)目的是提供鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒。
[0012]發(fā)明人通過(guò)分離和研究接受鉬類(lèi)藥物化療并發(fā)生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性高度相關(guān)的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒，為鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。
[0013]本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0014]一種與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP標(biāo)志物，該標(biāo)志物為rsl2883763、rsl3014982、 rs6750741、 rsll892526、 rs430253、 rs7610842、 rsl2639117、 rs623393、rs2051802、 rsll968978、 rs9390164、 rsl485282、 rsl904023、 rsll026144、 rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179 和 rs2830451 的組合。
[0015]所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，這些引物為:
[0016]rsl2883763 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；rsl3014982 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5 ;rs6750741的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:7和SEQID No:8 ;rsll892526 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:ll ;rs430253 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:13和SEQ ID No: 14 ;rs7610842的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No: 16和 SEQ ID No:17 ;rsl2639117 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:19和 SEQ ID No: 20 ；rs623393的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23 ;rs2051802的擴(kuò)增引物序列為SEQ IDNo:25 和 SEQ ID No:26 ;rsll968978 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ；rs9390164的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:31和SEQ ID No:32 ;rsl485282的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;rs 1904023 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ IDNo:38 ;rsll026144 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;rs830379 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44 ;rs712476的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:46和SEQID No:47 ;rs8006004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50 ;rs6497934 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:52和SEQ ID No:53 ;rs6502373的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No:56 ;rs9909179 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:58和SEQ ID No:59 ；rs2830451的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:61和SEQ ID No:62。
[0017]所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，這些引物為:
[0018]rsl2883763的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ;rsl3014982的延伸引物序列為SEQID No:6 ;rs6750741的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ;rsll892526的延伸引物序列為SEQID No:12 ;rs430253的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;rs7610842的延伸引物序列為SEQID No: 18 ；rsl2639117的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ；rs623393的延伸引物序列為SEQID No:24 ;rs2051802的延伸引物序列為SEQ ID No:27 ;rsll968978的延伸引物序列為SEQID No:30 ；rs9390164的延伸引物序列為SEQ ID No:33 ;rs 1485282的延伸引物序列為SEQID No: 36 ;rsl904023的延伸引物序列為SEQ ID No: 39 ;rsll026144的延伸引物序列為SEQID No:42 ;rs830379的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ;rs712476的延伸引物序列為SEQ IDNo:48 ；rs8006004的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ；rs6497934的延伸引物序列為SEQ IDNo:54 ；rs6502373的延伸引物序列為SEQ ID No:57 ；rs9909179的延伸引物序列為SEQ IDNo:60 ；rs2830451 的延伸引物序列為 SEQ ID No:63。
[0019]所述的SNP標(biāo)志物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0020]所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0021]所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0022]一種鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)外周血DNA中rsl2883763、 rsl3014982、 rs6750741、 rsll892526、 rs430253、 rs7610842、 rsl2639117、rs623393、rs2051802、rsll968978、rs9390164、rsl485282、rsl904023、rsll026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179 和 rs2830451。
[0023]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延伸引物。
[0024]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物為:
[0025]rsl2883763 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；rsl3014982 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5 ;rs6750741的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:7和SEQID No:8 ;rsll892526 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:ll ;rs430253 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:13和SEQ ID No: 14 ;rs7610842的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No: 16和 SEQ ID No:17 ;rsl2639117 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:19和 SEQ ID No: 20 ；rs623393的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23 ;rs2051802的擴(kuò)增引物序列為SEQ IDNo:25 和 SEQ ID No:26 ;rsll968978 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ；rs9390164的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:31和SEQ ID No:32 ;rsl485282的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;rsl904023 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ IDNo:38 ;rsll026144 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;rs830379 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44 ;rs712476的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:46和SEQID No:47 ;rs8006004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50 ;rs6497934 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:52和SEQ ID No:53 ;rs6502373的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No:56 ;rs9909179 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:58和SEQ ID No:59 ；rs2830451的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:61和SEQ ID No:62。
[0026]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物為:
[0027]rsl2883763的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ;rsl3014982的延伸引物序列為SEQID No:6 ;rs6750741的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ;rsll892526的延伸引物序列為SEQID No:12 ;rs430253的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ;rs7610842的延伸引物序列為SEQID No: 18 ；rsl2639117的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ；rs623393的延伸引物序列為SEQID No:24 ;rs2051802的延伸引物序列為SEQ ID No:27 ;rsll968978的延伸引物序列為SEQID No:30 ；rs9390164的延伸引物序列為SEQ ID No:33 ;rs 1485282的延伸引物序列為SEQID No: 36 ;rsl904023的延伸引物序列為SEQ ID No: 39 ;rsll026144的延伸引物序列為SEQID No:42 ;rs830379的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ;rs712476的延伸引物序列為SEQ IDNo:48 ；rs8006004的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ；rs6497934的延伸引物序列為SEQ IDNo:54 ；rs6502373的延伸引物序列為SEQ ID No:57 ；rs9909179的延伸引物序列為SEQ IDNo:60 ；rs2830451 的延伸引物序列為 SEQ ID No:63。
[0028]所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP混合液、MgC12溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br> [0029]具體地說(shuō)，本發(fā)明解決問(wèn)題的技術(shù)方案包括:(I)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù):以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。(2)基因型檢測(cè):選擇接受鉬類(lèi)藥物化療并有詳細(xì)骨髓抑制毒性評(píng)價(jià)信息的NSCLC患者，利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內(nèi)找出與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP。(3)對(duì)于篩選出來(lái)的陽(yáng)性關(guān)聯(lián)SNP，進(jìn)一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證將其應(yīng)用于診斷的可重復(fù)性。(4)鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒的研制:根據(jù)不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開(kāi)發(fā)SNP診斷試劑盒。
[0030]本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等，采用了 Affymetrixe.0芯片進(jìn)行全基因組掃描，初篩陽(yáng)性位點(diǎn)采用Sequenom MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0031]具體來(lái)說(shuō)研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
[0032]1.研究樣本的選擇
[0033](I)首次入院就診并經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的新發(fā)NSCLC患者，其診斷按照世界衛(wèi)生組織頒布的標(biāo)準(zhǔn)由至少兩位病理科醫(yī)生確認(rèn)；
[0034](2)首次化療前血常規(guī)檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常；
[0035](3)接受2~6周期的以鉬類(lèi)化療為主的治療；排除化療前或化療期間接受放療的NSCLC患者；
[0036](4)有詳細(xì)的化療2周期或3周期后骨髓抑制毒性的評(píng)價(jià)信息。
[0037]本研究共采用328例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
[0038]2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20ng/ μ I~50ng/ μ I DNA,純度(紫外 2600D 與 2800D 比值)在 1.6-2.0。
[0039]3.Affymetrix6.0 芯片檢測(cè)
[0040](I)取受試者全基因組DNA樣本；
[0041](2)在Affymetrixe.0芯片(購(gòu)于美國(guó)昂飛公司，下同)上進(jìn)行全基因組掃描；
[0042](3)檢測(cè)并比較各基因型在不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中的分別差異。
[0043]4.Sequenom MassARRAY 基因分型檢測(cè)
[0044](I)取受試者DNA樣本；
[0045](2)設(shè)計(jì)SNP的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物；
[0046](3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物純化；
[0047](4)進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)及產(chǎn)物純化；
[0048](5)檢測(cè)并比較各基因型在不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中的分別差異。
[0049]5.診斷試劑盒制備方法
[0050]Affymetrix6.0芯片進(jìn)行全基因組掃描和Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行驗(yàn)證后確定了不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中基因型分布頻率有顯著差異的SNP,作為鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷指標(biāo)。最后篩選出的與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性發(fā)生有關(guān)的 SNP 組成診斷試劑盒(rsl2883763、rsl3014982、rs6750741、rsl 1892526、rs430253、rs7610842、rsl2639117、rs623393、rs2051802、rsll968978、rs9390164、rsl485282、rsl904023、rsll026144、rs830379、rs712476、rs8006004, rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0051]6.統(tǒng)計(jì)分析方法
[0052]運(yùn)用卡方檢驗(yàn)(用于分類(lèi)變量)或者student t檢驗(yàn)(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征、吸煙、組織類(lèi)型、分期等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,計(jì)算比值比(Odds Rat1, OR)以及它們的95%可信區(qū)間。定義那些骨髓抑制毒副反應(yīng)OR小于I的SNP為保護(hù)性SNP ;定義那些骨髓抑制毒副反應(yīng)OR大于I的SNP為危險(xiǎn)性SNP。
[0053]為了進(jìn)一步研究這21個(gè)SNP構(gòu)成的綜合指征用于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷的效果，我們構(gòu)建了一個(gè)數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個(gè)SNP與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性發(fā)生的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來(lái)說(shuō)，我們對(duì)每個(gè)SNP的三種基因型進(jìn)行評(píng)分，野生純合型=“O”,雜合型=“1”，變異純合型=“2”，以單個(gè)SNP分析時(shí)的additive模型下的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每個(gè)SNP的情況給每個(gè)研究對(duì)象確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。危險(xiǎn)分值的計(jì)算方法如下:危險(xiǎn)分值=(0.72Xrsl2883763的評(píng)分)+ (-0.60Xrsl3014982的評(píng)分) + (0.99Xrs6750741 的評(píng)分) + (0.65Xrsl 1892526 的評(píng)分) + (0.80Xrs430253 的評(píng)分)+ (0.70Xrs7610842 的評(píng)分)+ (-0.92Xrsl2639117 的評(píng)分)+ (0.66Xrs623393 的評(píng)分) + (0.65Xrs2051802 的評(píng)分) + (0.80Xrsl 1968978 的評(píng)分) + (-0.65Xrs9390164 的評(píng)分)+ (0.80Xrs 1485282 的評(píng)分)+ (0.64Xrs 1904023 的評(píng)分)+ (0.97Xrsl 1026144 的評(píng)分)+ (-0.58Xrs830379 的評(píng)分)+ (0.59Xrs712476 的評(píng)分)+ (0.60Xrs8006004 的評(píng)分)+ (0.60Xrs6497934 的評(píng)分)+ (0.59Xrs6502373 的評(píng)分)+ (-0.67Xrs9909179 的評(píng)分)+ (-0.62Xrs2830451的評(píng)分)，獲得的危險(xiǎn)分值系數(shù)以及界限值被應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的328例樣本中。(以rsl2883763為例:0.72為rsl2883763的回歸系數(shù)(見(jiàn)表1)；rs 12883763的評(píng)分，野生純合型=“0”，雜合型=“1”，變異純合型=“2”，某個(gè)SNP的基因型由儀器檢測(cè)結(jié)果確定；某個(gè)樣本的總評(píng)分是這些個(gè)SNP分別評(píng)分的總和，單個(gè)SNP的基因型只是計(jì)算評(píng)分的一個(gè)中間過(guò)程，不需要知道具體基因型。)
[0054]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過(guò)專(zhuān)門(mén)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成(PLINK1.07)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平P值設(shè)為1.0X 10_5，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
[0055]以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說(shuō)明:
[0056]我們將上述接受鉬類(lèi)藥物化療后發(fā)生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者經(jīng)Affymetrix6.0芯片進(jìn)行全基因組掃描獲得相關(guān)結(jié)果。
[0057]根據(jù)Affymetrixe.0芯片檢測(cè)，本發(fā)明人檢測(cè)到在不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中基因型分布頻率存在差異的SNP包括:rsl2883763、rsl3014982、rs6750741、rsll892526、rs430253、rs7610842、rsl2639117、rs623393、rs2051802、rsll968978、rs9390164、rsl485282、rsl904023、rsll026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179 和 rs2830451。
[0058]根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，我們將這21個(gè)與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP在Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與Affymetrix6.0芯片檢測(cè)一致。
[0059]多因素logistic回歸分析結(jié)果表明，這21個(gè)SNP與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系:15個(gè)為危險(xiǎn)因素(rs712476、rs6502373、rs8006004、rs6497934、rsl904023、rs2051802、rsll892526、rs623393、rs7610842、rsl2883763、rs430253、rsll968978、rsl485282、rsll026144 和 rs6750741,變異等位基因型增加骨髓抑制毒性風(fēng)險(xiǎn))，6 個(gè)為保護(hù)因素(rsl2639117、rs9909179、rs9390164、rs2830451、rsl3014982和rs830379，變異等位基因型降低骨髓抑制毒性風(fēng)險(xiǎn))。
[0060]進(jìn)一步分析這21個(gè)SNP的組合用于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合能夠很好的區(qū)分不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者。
[0061]根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于臨床鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷的試劑盒，包含測(cè)定受試者血標(biāo)本DNA中上述SNP的特異性擴(kuò)增引物、特異性延伸引物和其他檢測(cè)試劑。
[0062]具體而言，這21個(gè)SNP的組合，或者這21個(gè)SNP的特異性擴(kuò)增引物及特異性延伸引物的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷，對(duì)高危個(gè)體提前采取針對(duì)性的保護(hù)措施，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，顯得非常重要。
[0063]本發(fā)明有益效果:
[0064]本發(fā)明提供的SNP標(biāo)志物作為鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于:
[0065](I)SNP是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物,穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類(lèi)生物標(biāo)志物的成功開(kāi)發(fā)將為鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷和控制開(kāi)創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0066](2) SNP試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷，有助于反映腫瘤患者對(duì)鉬類(lèi)藥物骨髓抑制毒性的易患程度，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0067](3)采用嚴(yán)密的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)系統(tǒng)，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取鉬類(lèi)藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP譜，并在Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)上進(jìn)行了驗(yàn)證；該策略的應(yīng)用加速和保證了 SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0068]本發(fā)明通過(guò)控制年齡等對(duì)毒副反應(yīng)發(fā)生的影響因素，研究SNP在鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷中的應(yīng)用前景，闡述SNP對(duì)于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性進(jìn)展的影響，揭示其診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明獲得了鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)SNP譜和特異性標(biāo)志物；通過(guò)SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得臨床醫(yī)生更好地識(shí)別鉬類(lèi)藥物骨髓抑制毒性的高危個(gè)體，為快速準(zhǔn)確掌握患者病情及實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0069]圖1:顯示全基因組關(guān)聯(lián)研究不同程度骨髓抑制毒性(O~1、2~4級(jí))的NSCLC患者的ROC曲線(xiàn)。
[0070]顯示接受鉬類(lèi)藥物化療的NSCLC患者中發(fā)生嚴(yán)重骨髓抑制毒性(2~4級(jí))組對(duì)低骨髓抑制毒性(O~I級(jí))組為參照的ROC曲線(xiàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0071]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0072]實(shí)施例1:樣品的收集和樣品資料的整理
[0073]發(fā)明人于2005月4月開(kāi)始至2011年I月從南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院及南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集了大量的原發(fā)性NSCLC患者血標(biāo)本，通過(guò)對(duì)樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 328例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的全基因組芯片掃描樣本:
[0074](I)首次入院就診并經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的新發(fā)NSCLC患者，其診斷按照世界衛(wèi)生組織頒布的標(biāo)準(zhǔn)由至少兩位病理科醫(yī)生確認(rèn)；
[0075](2)首次化療前血常規(guī)檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常；
[0076](3)接受2~6周期的以鉬類(lèi)化療為主的治療；排除化療前或化療期間接受放療的NSCLC患者；
[0077](4)有詳細(xì)的化療2周期或3周期后骨髓抑制毒性的評(píng)價(jià)信息。
[0078]并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0079]實(shí)施例2:外周血DNA中SNP的全基因組掃描
[0080]將上述符合條件的328例接受鉬類(lèi)藥物化療的NSCLC患者外周血DNA進(jìn)行AfTymetrix6.0芯片檢測(cè)獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為:
[0081]1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑(即裂解液，40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化鎂2.02g和曲拉通X-100 (amresco0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0082]2、去除紅細(xì)胞:用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄上清。
[0083]3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化鈉，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15mll0%十二烷基硫酸鈉，148.1ml雙蒸水，下同)和8μ I蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過(guò)夜。
[0084]4、去除蛋白質(zhì):加Iml飽和酹充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1, v/v,下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個(gè)1.5ml的離心管)。
[0085]5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ I,再加入與上清液等體積的冰無(wú)水乙醇，上下輕搖，可見(jiàn)白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心10min。
[0086]6、DNA洗漆:在沉淀中加入冰無(wú)水乙醇lml, 12000rpm離心1min,棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0087]7、測(cè)量濃度:通常能得到20ng/ μ l_50ng/ μ I DNA，純度(紫外2600D與2800D比值)在 1.6-2.0。
[0088]8、在Affymetrix6.0芯片(購(gòu)于美國(guó)昂飛公司，下同)上進(jìn)行全基因組掃描；
[0089]9、數(shù)據(jù)分析與處理:在接受鉬類(lèi)藥物化療后發(fā)生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC
患者中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0090]表1不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
[0091]
&點(diǎn)OR 丨"Μ I系數(shù) P
rsl 28837632.06 0.72 8,20x10^.rsl 30149820,55 -0.60 7,29^10^
rs67507412,68 0.99 2,84χ10_5
rsl 18925261.92 0.65 6.70x105
rs4302532.22 0.80 8.87x10'5
rs76108422.01 0.70 6.67x10^
rsl 26391170.4 -0.92 7.08x10^'
rs62 33931.94 0.66 2.46xlO-J
[0092]
rs2051802UI 0.65 4,05x1 O'*
rs 11968978 2,22 0,80 3,25^10"
rs9390I64 0,52 -0.65 3,12x10"
rs 1485282 2,23 OJO 5,05^10"
rs 1904023 1.9 0,64 7,43^10^
rs 11026144 2,64 0,97 9,32x10"
rs830379 0,56 -0.58 5,63^10^
rs712476 1,80.59 6.27 M (T5
rs8006004 1.83 0.60 5.32讀5
rs6497934 1.83 0.60 4.86M04
rs6502373 1.81 0.59 5.MMO4
rs9909179 0.51 -0.67 4.60M04
rs2830451_0.54 -0.62 4.37M04
[0093]實(shí)施例3:SNP 的 Sequenom MassARRAY 基因分型
[0094]將上述全基因組掃描發(fā)現(xiàn)與鉬類(lèi)化療藥物的骨髓抑制毒性有關(guān)的SNP在
Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè),具體步驟為:
[0095]1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0096]2、去除紅細(xì)胞:用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘,棄上清。
[0097]3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化鈉，
14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15mll0%十二烷基硫酸鈉，148.1ml雙蒸水，下同)和8μ I蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過(guò)夜。
[0098]4、去除蛋白質(zhì):加Iml飽和酹充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1, v/v,下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個(gè)1.5ml的離心管)。
[0099]5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ I,再加入與上清液等體積的冰無(wú)水乙醇，上下輕搖，可見(jiàn)白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心1min。
[0100]6、DNA洗漆:在沉淀中加入冰無(wú)水乙醇lml, 12000rpm離心1min,棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0101]7、測(cè)量濃度:通常能得到20ng/ μ l_50ng/ μ I DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1.6-2.0。
[0102]8、在Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)上進(jìn)行基因分型。對(duì)全基因組掃描發(fā)現(xiàn)的與鉬類(lèi)化療藥物的骨髓抑制毒性有關(guān)的21個(gè)SNP設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物；擴(kuò)增反應(yīng)的體系包括:0.1 μ I dNTP mix(25mM) ,0.5μ 110XPCR Buffer, 0.4 μ IMgC12(25mM),0.1μ I HotStar Taq (5U/μ L)，每對(duì)正向和反向擴(kuò)增引物的混合物I μ I和1.9μ I雙蒸水。加入IyL的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。延伸反應(yīng)的體系包括:EXTEND Mix液2μ 1(其中各延伸反應(yīng)引物混合物0.94 μ 1，iPLEX酶0.041 μ 1，延伸混合物0.2 μ I)。加入SAP(shrimp alkaline phosphatase,奸堿性磷酸酶)處理后的PCR產(chǎn)物7 μ L進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。使用的儀器為ΑΒΙ9700型PCR儀。純化的產(chǎn)物4，OOOrpm離心4分鐘，沉淀樹(shù)脂后使用 MassARRAY Nanodispenser RS1000 點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移到 384 孔 SpectroCHIP (Sequenom)芯片上，進(jìn)行MALD1-T0F質(zhì)譜分析，檢測(cè)結(jié)果采用Typer V4.0軟件分型并輸出結(jié)果。
[0103]9、數(shù)據(jù)分析與處理:用logistic回歸分析中的additive模型比較每個(gè)SNP在接受鉬類(lèi)藥物化療后發(fā)生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者中的基因型分布頻率的差異，結(jié)果與全基因組掃描類(lèi)似不再列出。
[0104]實(shí)施例4:利用危險(xiǎn)度評(píng)分方法進(jìn)一步分析SNP與鉬類(lèi)化療藥物的骨髓抑制毒性
[0105]根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者基因型分布頻率的比較，選擇陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的SNP，以全基因組掃描樣本中單個(gè)SNP回歸系數(shù)為權(quán)重，進(jìn)一步求得危險(xiǎn)分值，繪制ROC來(lái)評(píng)價(jià)診斷的靈敏性和特異性，進(jìn)而評(píng)價(jià)這些SNP對(duì)鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷能力。對(duì)21個(gè)SNP標(biāo)志物的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，這21個(gè)SNP以88.2%的AUC將發(fā)生不同程度骨髓抑制(O~1、2~4級(jí))的NSCLC患者分開(kāi)，最佳臨界點(diǎn)的靈敏度為75.86%，特異度:84.41% (圖1)。
[0106]因此，本發(fā)明人證明了采用 rsl2883763、rsl3014982、rs6750741、rsll892526、rs430253、rs7610842、rsl2639117、rs623393、rs2051802、rsll968978、rs9390164、rsl485282、rsl904023、rsll026144、rs830379、rs712476、rs8006004, rs6497934、rs6502373、rs9909179和rs2830451的組合能夠很好地將易發(fā)生不同程度骨髓抑制毒性的NSCLC患者區(qū)分。
[0107]實(shí)施例5:用于鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性的診斷SNP試劑盒的制作
[0108]SNP試劑盒的制作和操作流程是基于Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)檢測(cè)技術(shù)。試劑盒含有一批SNP特異性擴(kuò)增引物(包括下列引物:rsl2883763的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:l 和 SEQ ID No: 2 ;rsl3014982 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ；rs6750741的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 ;rsll892526的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No: 11 ;rs430253 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:13 和 SEQ IDNo:14 ;rs7610842 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:16 和 SEQ ID No: 17 ;rsl2639117 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No:20 ;rs623393的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23 ;rs2051802 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ；rsll968978的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:28和SEQ ID No:29 ;rs9390164的擴(kuò)增引物序列為SEQ IDNo:31 和 SEQ ID No:32 ;rsl485282 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ；rsl904023的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:37和SEQ ID No:38 ;rsll026144的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;rs830379 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ IDNo:44 ;rs712476 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:46和 SEQ ID No:47 ;rs8006004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49和 SEQ ID No:50 ;rs6497934 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:52和 SEQID No:53 ;rs6502373 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:55 和 SEQ ID No:56 ;rs9909179 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:58和SEQ ID No:59 ;rs2830451的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:61和SEQ ID No:62)、和/或特異性延伸引物(包括下列延伸引物:rsl2883763的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ；rsl3014982的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ；rs6750741的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ；rsll892526的延伸引物序列為SEQ ID No: 12 ；rs430253的延伸引物序列為SEQ ID No:15 ;r s7610842的延伸引物序列為SEQ ID No: 18 ;rsl2639117的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ；rs623393的延伸引物序列為SEQ ID No:24 ；rs2051802的延伸引物序列為SEQ ID No:27 ；rsll968978的延伸引物序列為SEQ ID No:30 ；rs9390164的延伸引物序列為SEQ ID No: 33 ;rsl485282的延伸引物序列為SEQ ID No: 36 ;rsl904023的延伸引物序列為SEQ IDNo:39 ；rsll026144的延伸引物序列為SEQ ID No:42 ；rs830379的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ；rs712476的延伸引物序列為SEQ ID No:48 ；rs8006004的延伸引物序列為SEQ ID No: 51 ;rs6497934的延伸引物序列為SEQ ID No: 54 ;rs6502373的延伸引物序列為SEQ ID No:57 ;rs9909179的延伸引物序列為SEQ ID No:60 ;rs2830451的延伸引物序列為SEQ ID No:63)，還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如:dNTPs，MgC12，雙蒸水等，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照等)。此試劑盒的價(jià)值在于只需要外周血而不需要其它組織樣品，通過(guò)最精簡(jiǎn)和特異的擴(kuò)增引物及延伸引物檢測(cè)SNP，再通過(guò)SNP譜評(píng)價(jià)接受鉬類(lèi)藥物化療的腫瘤患者骨髓抑制毒副反應(yīng)，不僅穩(wěn)定，檢測(cè)方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指導(dǎo)高危人群的篩檢和更有效的個(gè)體化治療。
[0109]表2.相關(guān)SNP引物信息
[0110]

【權(quán)利要求】
1.一種與鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性相關(guān)的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為rsl2883763、 rsl3014982、 rs6750741、 rsll892526、 rs430253、 rs7610842、 rsl2639117、rs623393、rs2051802、rsll968978、rs9390164、rsl485282、rsl904023、rsll026144、rs830379、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179 和 rs2830451 的組合。
2.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于該引物為: rsl2883763 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ； rsl3014982 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ； rs6750741 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ； rsll892526 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:ll ； rs430253 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ； rs7610842 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ； rsl2639117 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 19 和 SEQ ID No:20 ； rs623393 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ； rs2051802 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No: 26 ； rsll968978 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ； rs9390164 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No: 32 ； rsl485282 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No: 35 ； rsl904023 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No: 38 ； rsll026144 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ； rs830379 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ； rs712476 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ； rs8006004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No: 50 ； rs6497934 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No: 53 ； rs6502373 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:55 和 SEQ ID No: 56 ； rs9909179 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No: 59 ； rs2830451 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62。
3.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，其特征在于該引物為: rsl2883763的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ； rsl3014982的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ； rs6750741的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ； rsll892526的延伸引物序列為SEQ ID No: 12 ； rs430253的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ； rs7610842的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ； rsl2639117的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ； rs623393的延伸引物序列為SEQ ID No: 24 ； rs2051802的延伸引物序列為SEQ ID No: 27 ； rs11968978的延伸引物序列為SEQ ID No: 30 ； rs9390164的延伸引物序列為SEQ ID No: 33 ； rs 1485282的延伸引物序列為SEQ ID No: 36 ；rs 1904023的延伸引物序列為SEQ ID No: 39 ； rs 11026144的延伸引物序列為SEQ ID No: 42 ； rs830379的延伸引物序列為SEQ ID No: 45 ； rs712476的延伸引物序列為SEQ ID No:48 ； rs8006004的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ; rs6497934的延伸引物序列為SEQ ID No:54 ； rs6502373的延伸引物序列為SEQ ID No: 57 ； rs9909179的延伸引物序列為SEQ ID No:60 ； rs2830451的延伸引物序列為SEQ ID No:63。
4.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7.一種鉬類(lèi)化療藥物骨髓抑制毒性診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測(cè)外周血 DNA 中 rsl2883763、rsl3014982、rs6750741、rsll892526、rs430253、rs7610842、rsl2639117、rs623393、rs2051802、rsll968978、rs9390164、rsl485282、rsl904023、rsll026144、rs83037 9、rs712476、rs8006004、rs6497934、rs6502373、rs9909179 和rs2830451o
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求3所述SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的試劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104164495SQ201410351322
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】沈洪兵, 胡志斌, 靳光付, 馬紅霞, 江玥, 潘蕓 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)