快速監(jiān)控混種酵母增殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了基于GeXP遺傳分析系統(tǒng)(原理是毛細(xì)管電泳技術(shù))平臺(tái)的檢測(cè)方法，用于啤酒的混種酵母的增殖規(guī)律和混種比例?？焖俦O(jiān)控混種酵母增殖的方法，包括引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液和優(yōu)化混種酵母比例。根據(jù)這種方法，研究人員可以了解混種發(fā)酵過(guò)程中不同酵母的生長(zhǎng)曲線和增殖規(guī)律以及不同酵母之間的相互影響，從而進(jìn)一步為調(diào)控混種比例和保持最佳發(fā)酵性能提供技術(shù)保證。
【專利說(shuō)明】快速監(jiān)控混種酵母增殖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測(cè)方法，具體涉及酵母的檢測(cè)方法，尤其涉及一種用于啤酒的混種酵母的增殖規(guī)律和混種比例的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]啤酒是以大麥經(jīng)發(fā)芽制成的大麥芽為主要原料，經(jīng)糖化、添加酒花、啤酒酵母發(fā)酵釀制而成的，含二氧化碳、低酒精濃度的、起泡的釀造酒。釀造啤酒，實(shí)際上是將淀粉轉(zhuǎn)換成被稱為“麥汁”的含糖液體，再利用酵母將麥汁發(fā)酵成含有酒精的啤酒。啤酒發(fā)酵過(guò)程是啤酒酵母在一定的條件下，利用麥汁中的可發(fā)酵性物質(zhì)而進(jìn)行的正常生命活動(dòng)，其代謝的產(chǎn)物就是所要的產(chǎn)品——啤酒。然而，普通的啤酒是利用純種啤酒酵母將麥汁進(jìn)行發(fā)酵制成的，口味較為單一，保健功能也有限。
[0003]為了提升啤酒的口感，研發(fā)人員使用混種酵母進(jìn)行啤酒發(fā)酵的研究。要研究混種酵母發(fā)酵對(duì)于釀造啤酒的品質(zhì)的影響，需要開發(fā)監(jiān)控不同酵母的增殖規(guī)律和混種比例的變化。這將有助于了解混種發(fā)酵過(guò)程中不同酵母的生長(zhǎng)曲線和增殖規(guī)律以及不同酵母之間的相互影響，從而進(jìn)一步為調(diào)控混種比例和保持最佳發(fā)酵性能提供技術(shù)保證，然而，目前還沒有這樣一種檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了基于GeXP遺傳分析系統(tǒng)(原理是毛細(xì)管電泳技術(shù))平臺(tái)的檢測(cè)方法，用于啤酒的混種酵母的增殖規(guī)律和混種比例。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0006]快速監(jiān)控混種酵母增殖的方法，包括引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液和優(yōu)化混種酵母比例。具體檢測(cè)步驟如下:
[0007]①引物設(shè)計(jì):搜索Lager啤酒酵母基因組序列中的差異片段，并根據(jù)差異片段設(shè)計(jì)區(qū)分不同酵母的引物；每條引物分別配制成100μΜ的儲(chǔ)存液，使用時(shí)稀釋成200 ηΜ的工作液；
[0008]②PCR擴(kuò)增反應(yīng):分別用提取的純種酵母DNA和步驟①設(shè)計(jì)的引物配制PCR反應(yīng)體系，上PCR反應(yīng)儀，擴(kuò)增得到不同純種酵母的特異產(chǎn)物，即為PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物稀釋50倍后待檢；
[0009]③GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè):采用GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)稀釋后的PCR產(chǎn)物并分析，確定純種酵母的特征峰；具體步驟包括:
[0010]Α.取DSS400 (分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400)，加入80倍體積SLS (上樣緩沖液，甲酰胺)，在渦旋震蕩器上震蕩30S，轉(zhuǎn)移至上樣板的孔中；
[0011]B.取0.6 μ I PCR產(chǎn)物稀釋液加到分裝有40 μ I的SLS和DSS混合液的上樣板的孔中，用移液槍混勻后覆蓋一滴石臘油；
[0012] C.在緩沖液板的每個(gè)孔中加入250 μ I的分離緩沖液；
[0013]D.上機(jī)進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)(使用Freg_3分離方法)，利用GeXP系統(tǒng)參數(shù)對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行分析，記錄結(jié)果；
[0014]④制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:(a)分別提取純種酵母的DNA，檢測(cè)核酸濃度并稀釋至相同濃度，按不同體積比混合，即得到具備特征峰的純種酵母的質(zhì)量百分比依次為0、20%、40%、60%、80%、100%的混種酵母DNA ； (b)對(duì)不同混合比例的混種酵母進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)，得到特征峰的峰高Ht以及兩種酵母共有峰的峰高Hb ; (c)根據(jù)混合比例和叫/U比值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0015]⑤實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液:提取混種發(fā)酵的酵母樣品DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將稀釋后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)，得到檢測(cè)樣品的Ht/Hb比值，通過(guò)步驟④制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兩種酵母的混合比例。
[0016]優(yōu)選的是，所述兩種純種酵母為酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp,所述兩種酵母的共有峰位于286bp。
[0017]優(yōu)選的是，所述兩種純種酵母為酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp,所述兩種酵母的共有峰位于286bp。
[0018]優(yōu)選的是，所述兩種純種酵母為酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp,所述兩種酵母的共有峰位于286bp。
[0019]其中，L830的拉丁文名稱為 Saccharomyces pastorianus,購(gòu)買自美國(guó) White Labs,編號(hào)為 WLP830 GERMAN LAGER YEAST。 L053 的拉丁文名稱為Saccharomyces pastorianus,購(gòu)買自芬蘭VTT技術(shù)研究中心，編號(hào)為A-78053。L820的拉丁文名稱為Saccharomyces pastorianus,購(gòu)買自美國(guó)White Labs,編號(hào)為WLP820 OKTOBERFEST/MARZEN LAGER YEAST。WP3470 的拉丁文名稱為 Saccharomycespastorianus,購(gòu)買自德國(guó)魏恩施蒂芬高等專業(yè)學(xué)院,編號(hào)為Weihenstephan34/70。
[0020] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種快速監(jiān)控混種酵母的增殖規(guī)律和混種比例的變化的方法。根據(jù)這種方法，研究人員可以了解混種發(fā)酵過(guò)程中不同酵母的生長(zhǎng)曲線和增殖規(guī)律以及不同酵母之間的相互影響，從而進(jìn)一步為調(diào)控混種比例和保持最佳發(fā)酵性能提供技術(shù)保證。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為純種酵母L830的檢測(cè)峰圖；
[0022]圖2為純種酵母L053的檢測(cè)峰圖；
[0023]圖3為純種酵母L820的檢測(cè)峰圖；
[0024]圖4為純種酵母WP3470的檢測(cè)峰圖；
[0025]圖5為根據(jù)L830和L053的混種比例和特征峰高比值H289/H286制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0026]圖6為L(zhǎng)830-L053混種體系中酵母的比例隨時(shí)間的變化；
[0027]圖7為根據(jù)L830和L820的混種比例和特征峰高比值H289/H286制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0028]圖8為L(zhǎng)830-L820混種體系中酵母的比例隨時(shí)間的變化；
[0029]圖9為根據(jù)L830和WP3470的混種比例和特征峰高比值H289/H286制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0030]圖10為L(zhǎng)830-WP3470混種體系中酵母的比例隨時(shí)間的變化。

【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0032]實(shí)施例1:
[0033]選擇L830酵母與L053酵母進(jìn)行混種發(fā)酵的1L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分別在發(fā)酵開始后64h，70.5h，92h，160h,280h取發(fā)酵液進(jìn)行混種酵母檢測(cè)。
[0034]①引物設(shè)計(jì):使用SSR Hunter軟件搜索Lager啤酒酵母(Saccharomycespastorianus)基因組序列中的微衛(wèi)星序列(SSR)并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，其部分序列為:
[0035]AGCTCGCGCAGCAAAACCCGCTGCCAGAGCCACTGCTAGCGCCAA CACCAAATCGGAAGACA TGAAATACCTGTTGTCCGGCTACGATTACTTCGACGTGAGCGTGTCCGGTTGAGTTTATGCTGAGTTTTTGCGCATCAATATTATTTTTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACATACTATTAAATATACTAAATAAGAGGAAAACGCTTTGGAAGTGACTGGCGCCGCCGCTGGCTACTATAATAGCAGCGACTGTAATTTA Λ TCTCA TCCCGTCA TTTi GGATTACCTCTTTTACTCGC......
[0036]序列中斜體加粗處為設(shè)計(jì)引物所在位置，兩端各自加上GeXP專用接頭后全長(zhǎng)引物序列為:
[0037]上游引物:5’一AGGTGACACTATAGAATACACCAAATCGGAAGACA— 3，
[0038]下游引物:5，一GTACGACTCACTATAGGGAAAATGACGGGATGAGAT—3，
[0039]將每條引物分別配制成100 μ M的儲(chǔ)存液，使用時(shí)稀釋成200ηΜ的工作液。
[0040]②PCR擴(kuò)增反應(yīng):分別采用純種酵母和步驟①設(shè)計(jì)的引物配制PCR反應(yīng)體系，上PCR反應(yīng)儀，擴(kuò)增得到不同純種酵母的特異產(chǎn)物，即為PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物稀釋50倍后待檢；使用 Roche DNA 提取試劑盒(High Pure PCR Template Preparat1n Kit, Cat.N0.11796828001)提取混種酵母樣品的DNA。PCR反應(yīng)體系的組成詳見表1，PCR反應(yīng)程序詳見表2。
[0041]表1PCR反應(yīng)體系的組成
[0042]

【權(quán)利要求】
1.快速監(jiān)控混種酵母增殖的方法，其特征在于:包括引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液；具體檢測(cè)步驟如下: ①引物設(shè)計(jì):搜索Lager啤酒酵母基因組序列中的差異片段，并根據(jù)差異片段設(shè)計(jì)區(qū)分不同酵母的引物； ②PCR擴(kuò)增反應(yīng):分別用提取的純種酵母DNA和步驟①設(shè)計(jì)的引物配制PCR反應(yīng)體系，上PCR反應(yīng)儀，擴(kuò)增得到不同純種酵母的特異產(chǎn)物，即為PCR產(chǎn)物； ③GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè):采用GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)稀釋后的PCR產(chǎn)物并分析，確定純種酵母的特征峰； ④制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:(a)提取兩種純種酵母的DNA，將二者按照不同比例混合，得到不同混合比例的混種酵母DNA，所述混合比例為質(zhì)量百分比；(b)對(duì)不同混合比例的混種酵母進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)，得到特征峰的峰高Ht以及兩種酵母共有峰的峰高Hb ； (c)根據(jù)混合比例和％/%比值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線； ⑤實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液:對(duì)由步驟④的兩種純種酵母組成的混種發(fā)酵樣品提取DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將稀釋后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)，得到檢測(cè)樣品的HT/HB比值，通過(guò)步驟④制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酵母中兩種酵母的混合比例。
2.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的快速監(jiān)控混種酵母增殖的技術(shù)，其特征在于:所述兩種純種酵母為酵母L830和酵母L053，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述兩種酵母的共有峰位于286bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速監(jiān)控混種酵母增殖的技術(shù)，其特征在于:所述兩種純種酵母為酵母L830和酵母L820，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述兩種酵母的共有峰位于286bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速監(jiān)控混種酵母增殖的技術(shù)，其特征在于:所述兩種純種酵母為酵母L830和酵母WP3470，所述酵母L830的特征峰位于289bp，所述兩種酵母的共有峰位于286bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的快速監(jiān)控混種酵母增殖的技術(shù)，其特征在于:所述步驟①中每條引物分別配制成100 μ M的儲(chǔ)存液，使用時(shí)稀釋成200ηΜ的工作液；所述步驟④(a)為分別提取純種酵母的DNA，檢測(cè)核酸濃度并稀釋至相同濃度，按不同體積比混合，即得到不同摩爾比的混種酵母DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速監(jiān)控混種酵母增殖的技術(shù)，其特征在于:所述混種酵母中，具備特征峰的酵母的質(zhì)量百分比依次為O、20 %、40 %、60 %、80 %、100 %。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的快速監(jiān)控混種酵母增殖的技術(shù)，其特征在于:所述GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)包括以下幾個(gè)步驟: ①取DSS400，加入80倍體積SLS，在渦旋震蕩器上震蕩30S，轉(zhuǎn)移入上樣板的孔中； ②取0.6 μ I稀釋后的PCR產(chǎn)物，加入裝有40 μ ISLS-DSS混合液的上樣板的孔中，用移液槍混勻后覆蓋一滴石臘油； ③在緩沖液板的每個(gè)孔中加入250μ I的分離緩沖液； ④上機(jī)進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳檢測(cè)并記錄結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12R1/85GK104131099SQ201410362636
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】樊偉, 董建軍, 尹花, 陳璐, 陳鵬, 賀揚(yáng), 萬(wàn)秀娟, 趙玉祥, 陳嶸, 候曉平 申請(qǐng)人:青島啤酒股份有限公司