一種判斷nsclc患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒，該試劑盒包括能夠用于檢測(cè)STAT3基因中rs9912773和/或rs1294991位點(diǎn)的基因型的試劑。發(fā)明人通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行基因分型，分析STAT3基因SNP位點(diǎn)和吉非替尼對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌治療反應(yīng)性的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)根據(jù)rs9912773和/或rs1294991位點(diǎn)的基因型，可以判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼的治療反應(yīng)性。本發(fā)明的試劑盒的開(kāi)發(fā)為晚期非小細(xì)胞肺癌患者治療方案的確定提供了一種可靠、靈敏的方式。
【專利說(shuō)明】一種判斷NSCLC患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種判斷晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒以及SNP在制備該試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是最常見(jiàn)、死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率還在逐年增加。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占整個(gè)肺癌的80%以上，并且大部分患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期。化療曾經(jīng)是晚期非小細(xì)胞肺癌最主要的治療手段，但即便是最好的化療方案，目前治療的總有效率也不足50%，I年生存率僅40%左右。
[0003]靶向治療藥物的出現(xiàn)改變了非小細(xì)胞肺癌的治療現(xiàn)狀，顯著地提高了患者的生存期。其中吉非替尼(Gefitinib，ZD1839)是最早上市、目前臨床應(yīng)用最為廣泛的非小細(xì)胞肺癌靶向治療藥物，屬于一種選擇性、可逆性EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)酪氨酸激酶抑制劑，目前在包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家已經(jīng)上市，商品名為易瑞沙(Iressa)。
[0004]吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌的客觀有效率差異很大，文獻(xiàn)報(bào)道從8.9-69%不等。其中在IDEALl臨床研究中，日本人的有效率為27%，而美國(guó)人則僅為12%。而在EAP研究中，中國(guó)人的有效率約為30%。以上均提示吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌的臨床療效存在著顯著的個(gè)體差異。由于晚期非小細(xì)胞肺癌患者生存期很有限，因此盡早選擇最可能有效的藥物治療對(duì)延長(zhǎng)患者生存尤為重要。加之吉非替尼為代表的靶向治療藥物比較昂貴，價(jià)格是普通化療的數(shù)十倍，從衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度也要求選擇最可能獲益的患者接受靶向治療。因此，尋找吉非替尼療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)個(gè)體化靶向治療，是目前亟待解決的關(guān)鍵性臨床問(wèn)題。
[0005]目前最常用于預(yù)測(cè)吉非替尼療效的生物標(biāo)記物為EGFR基因的突變，主要為外顯子19的堿基缺失(G2235-A2249缺失)和外顯子21的點(diǎn)突變(L858R)。一項(xiàng)針對(duì)ISEL國(guó)際多中心III期臨床研究的生物標(biāo)記物回顧性分析發(fā)現(xiàn)，存在EGFR基因突變的16例NSCLC患者接受吉非替尼治療后的有效率為37.5%，而EGFR基因野生型的116例患者吉非替尼的有效率僅為2.6%。但是EGFR基因突變作為吉非替尼療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物，存在一定的不足:①突變的檢測(cè)需要腫瘤組織，而大部分肺癌在初次診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，失去手術(shù)獲得腫瘤標(biāo)本的機(jī)會(huì)，即便是少部分患者有可能活檢取得標(biāo)本，也會(huì)因?yàn)闄z出率有限和活檢標(biāo)本量限制，難以進(jìn)行突變檢測(cè)，目前臨床上能夠滿足突變檢測(cè)要求的患者比例少于20%(ISEL研究中約為17% );②基因突變受腫瘤異質(zhì)性的影響，同一患者在不同部位或者疾病不同階段獲得的腫瘤標(biāo)本，其突變檢測(cè)結(jié)果可能存在差異，因此檢測(cè)到的結(jié)果可能不能代表全身和全程的腫瘤特點(diǎn)突變檢測(cè)的流程復(fù)雜，儀器設(shè)備的要求高，一般實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展，同時(shí)檢測(cè)成本也高，影響了其廣泛的臨床應(yīng)用。
[0006]基于以上EGFR基因突變的不足之處，開(kāi)發(fā)更理想的療效預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法的臨床需求顯得更為迫切。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 rs9912773和rsl294991位點(diǎn)與晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的相關(guān)性，并據(jù)此開(kāi)發(fā)了能夠判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒，和rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)在制備晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的判斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0008]一方面，本發(fā)明提供了用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的兩個(gè)SNP位點(diǎn)，所述的SNP位點(diǎn)是rs9912773和rsl294991位點(diǎn)，當(dāng)rs9912773位點(diǎn)基因型為GG或GC時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性差，患者治愈率低；當(dāng)rs9912773位點(diǎn)基因型為CC時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性好，患者治愈率高。當(dāng)rsl294991位點(diǎn)基因型為CC或CT時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性差，患者治愈率低；當(dāng)rsl294991位點(diǎn)基因型為T(mén)T時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性好，患者治愈率高。
[0009]另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑，所述試劑可以為采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP所需的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs9912773和/或rs 1294991位點(diǎn)的基因型即可。
[0010]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以用多種技術(shù)在DNA水平上體外檢測(cè)CETP基因序列的多態(tài)性位點(diǎn)?？梢越?jīng)與用放射性標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴(kuò)增后的DNA序列雜交，以鑒別位點(diǎn)多態(tài)性。也可以基于已知的核苷酸順序的改變，合成正常的和具有特定多態(tài)性的PCR引物，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))的底物中加入熒光標(biāo)記的核苷酸，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中有無(wú)熒光出現(xiàn)，確定在擴(kuò)增所用的引物中有無(wú)堿基變化，從而檢測(cè)特定多態(tài)性。通過(guò)DNA直接測(cè)序可以直接揭示對(duì)照基因和攜帶具有特定多態(tài)性基因之間的序列差異。當(dāng)與PCR結(jié)合使用時(shí)，這種方法的靈敏性大大提高。各種DNA及DNA片段的核苷酸序列的測(cè)定也可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法。此外，核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒或自動(dòng)測(cè)序儀等。常規(guī)的自動(dòng)測(cè)序法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來(lái)確定核酸序列。也可以采用限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)來(lái)體外檢測(cè)CETP基因序列的多態(tài)性位點(diǎn)。
[0011]本發(fā)明提供的用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑，包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的單堿基延伸引物。對(duì)于rs9912773來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rs9912773位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物 5’ -ACGTTGGATGCAGTTGATTGTTAAAGCTGCC-3’ ；反向引物 5’ -ACGTTGGATGGGTCTGTTTTGTGGGTTTTC-3’ ；所述單堿基延伸引物序列為:5’ -tttgTTGTAGAGCTCAGACCT-3’。對(duì)于rsl294991來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rsl294991位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’ -ACGTTGGATGATCATGGGCTATCCCCAACA-3 ’ ；反向引物 5 ’ -ACGTTGGATGGAGAATACACGCTTAGAGAG-3’ ；所述單堿基延伸引物序列為:5’ -AGAGAGAATCTAGAAAGAAACA-3’。
[0012]又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑盒，該試劑盒包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP所需的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs9912773和/或rs 1294991位點(diǎn)的基因型。
[0013] 本發(fā)明提供的用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的單堿基延伸引物。對(duì)于rs9912773來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rs9912773位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物 5’ -ACGTTGGATGCAGTTGATTGTTAAAGCTGCC-3’ ；反向引物 5’ -ACGTTGGATGGGTCTGTTTTGTGGGTTTTC-3’;所述單堿基延伸引物序列為:5’ -tttgTTGTAGAGCTCAGACCT-3’。對(duì)于rsl294991來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rsl294991位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’ -ACGTTGGATGATCATGGGCTATCCCCAACA-3 ’ ；反向引物 5 ’ -ACGTTGGATGGAGAATACACGCTTAGAGAG-3’ ；所述單堿基延伸引物序列為:5’ -AGAGAGAATCTAGAAAGAAACA-3’。
[0014]本發(fā)明提供了用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒，該試劑盒的判斷原理是利用試劑盒中的試劑檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)的基因型，根據(jù)所測(cè)患者的上述SNP位點(diǎn)的基因型判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性。當(dāng)rs9912773位點(diǎn)基因型為GG或GC時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性差，患者治愈率低；當(dāng)rs9912773位點(diǎn)基因型為CC時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性好，患者治愈率高。當(dāng)rsl294991位點(diǎn)基因型為CC或CT時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性差，患者治愈率低；當(dāng)rsl294991位點(diǎn)基因型為T(mén)T時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性好，患者治愈率高。
[0015]該試劑盒中包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP基因型所需的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)的基因型即可。本發(fā)明提供的用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的單堿基延伸引物。對(duì)于rs9912773來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rs9912773位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物 5’ -ACGTTGGATGCAGTTGATTGTTAAAGCTGCC-3’ ；反向引物 5’ -ACGTTGGATGGGTCTGTTTTGTGGGTTTTC-3’;所述單堿基延伸引物序列為:5’ -tttgTTGTAGAGCTCAGACCT-3’。對(duì)于rsl294991來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rsl294991位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’ -ACGTTGGATGATCATGGGCTATCCCCAACA-3 ’ ；反向引物 5 ’ -ACGTTGGATGGAGAATACACGCTTAGAGAG-3’ ；所述單堿基延伸引物序列為:5’ -AGAGAGAATCTAGAAAGAAACA-3’。
[0016]本發(fā)明還提供了 rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)在制備檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑中的應(yīng)用。所述試劑可以為采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP基因型所需的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)的基因型即可。
[0017]本發(fā)明還提供了 rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)在制備檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒中包括能夠檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述試劑包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和/或能夠使用MassARRAY Sequenom檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的單堿基延伸引物。對(duì)于rs9912773來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增rs9912773位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’-ACGTTGGATGCAGTTGATTGTTAAAGCTGCC-3’ ；反向引物 5’ -ACGTTGGATGGGTCTGTTTTGTGGGTTTTC-3’ ；所述單堿基延伸引物序列為:5’ -tttgTTGTAGAGCTCAGACCT-3’。對(duì)于 rsl294991 來(lái)說(shuō)，用于擴(kuò)增 rsl294991位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’ -ACGTTGGATGATCATGGGCTATCCCCAACA-3’ ；反向引物5’ -ACGTTGGATGGAGAATACACGCTTAGAGAG-3’ ；所述單堿基延伸引物序列為:5， -AGAGAGAATCTAGAAAGAAACA-3，。
[0018] 本發(fā)明還提供了 rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)在制備用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的判斷原理是利用試劑盒中的試劑檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)的基因型，根據(jù)所測(cè)患者的上述SNP位點(diǎn)的基因型判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性。當(dāng)rs9912773位點(diǎn)基因型為GG或GC時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性差，患者治愈率低；當(dāng)1^9912773位點(diǎn)基因型為CC時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性好，患者治愈率高。當(dāng)rsl294991位點(diǎn)基因型為CC或CT時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性差，患者治愈率低；當(dāng)rsl294991位點(diǎn)基因型為T(mén)T時(shí)，晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性好,患者治愈率高。
[0019]本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)基因型的試劑在制備用于檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)基因型的試劑盒中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)基因型的試劑在制備用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下:發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，STAT3基因單核苷酸多態(tài)(rs9912773和/或rsl294991)是一種可預(yù)測(cè)吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌療效的生物指標(biāo)。以STAT3 rs9912773和/或rsl294991基因多態(tài)檢測(cè)作為吉非替尼療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，能在一定程度上克服現(xiàn)行預(yù)測(cè)指標(biāo)(EGFR基因突變)的部分缺點(diǎn):①rs9912773和/或rsl294991檢測(cè)的標(biāo)本可以來(lái)源自任何正常或腫瘤組織的有核細(xì)胞，最簡(jiǎn)便的方法是2ml外周血即可，因此幾乎所有患者均可以獲得檢測(cè)標(biāo)本；@rs9912773和/或rsl294991屬于遺傳變異，檢測(cè)結(jié)果不受腫瘤異質(zhì)性的影響，在患者一生中任何時(shí)候取得標(biāo)本，或者取自任何部位標(biāo)本，其檢測(cè)結(jié)果應(yīng)保持一致rs9912773和/或rsl294991檢測(cè)流程相對(duì)簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、成本低廉，有利于臨床推廣。
[0022]具體的實(shí)施方式
[0023]下面通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)注意，如無(wú)特別指出，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]1.研究對(duì)象:晚期非小細(xì)胞肺癌，86例。入選的患者(≥18歲)經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確證為晚期非小細(xì)胞肺癌，所有患者均提供了知情同意書(shū)。
[0025]2.用藥方法:吉非替尼250mg，每日一次，口服。用藥周期為I年。
[0026]3.STAT3基因SNP位點(diǎn)的選擇:在國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃提供的SNP公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hapmap:ncb1.nlm.nih.gov/)中檢索STAT3基因，首先選取已知漢族人群中信息的SNP位點(diǎn)，再以其中的標(biāo)簽SNP作為進(jìn)一步分型的候選多態(tài)位點(diǎn)，然后結(jié)合最小基因頻率(MAF)以及哈迪-溫伯格平衡P值(HWPval)等統(tǒng)計(jì)特征對(duì)候選標(biāo)簽SNP進(jìn)行篩選以得出最佳的標(biāo)簽SNP。選取要求:MAF>0.1且HWPvalX).1。針對(duì)STAT3基因進(jìn)行了基于標(biāo)簽SNP為主體的全面SNP位點(diǎn)選擇，并且將與之關(guān)聯(lián)的部分功能SNP替換進(jìn)去，STAT3基因的候選SNP位點(diǎn)為rs9912773和rs 1294991。
[0027]4.實(shí)驗(yàn)方法
[0028]4.1基因組DNA提取
[0029]采集病例研究對(duì)象2ml抗凝外周血標(biāo)本，采用酚-氯仿法提取基因組DNA。DNA標(biāo)本分離自外周血白細(xì)胞，簡(jiǎn)述如下:
[0030](I)將收集的抗凝血標(biāo)本從_80°C取出后置于室溫，待溶化后將血轉(zhuǎn)入另一干凈的離心管，蓋嚴(yán)后于5，000 Xg離心15min ；
[0031](2)將離心后的血上層棄去，留血細(xì)胞,加入適量裂解緩沖液(含1mM pH為8.0的 Tri s-HCl, 0.1M EDTA、20y g/ml 胰 RNA 酶、0.5% SDS)，混勻，于 37°C 溫浴 lh，加蛋白酶Κ(100μ g/ml)混勻后37°C溫浴過(guò)夜；
[0032](3)溫浴結(jié)束后加入等體積經(jīng)Tris-HCl飽和過(guò)的平衡酚(pH7.4)充分混勻后于8, 000 X g 離心 15min ；
[0033](4)將上層水相移至另一離心管并加入等體積酚:氯仿(1:1)，充分混勻后8, 000 X g 離心 15min ；
[0034](5)將上層水相移入另一離心管中，加入10%體積的乙酸銨溶液(1M)，混勻后加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后放入-20°C。沉淀出的DNA經(jīng)75%乙醇洗滌兩次后，溶于適量TE緩沖液。使用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。
[0035]提取出的DNA通過(guò)分光光度法來(lái)測(cè)定其濃度，Sequenom技術(shù)要求DNA達(dá)以下標(biāo)準(zhǔn):濃度在lOng/μ I以上；0D260/280 = 1.8~2.0。DNA樣品置于1.5ml EP管中儲(chǔ)存于_80°C超低溫冰箱內(nèi)。進(jìn)行SNP分型檢測(cè)時(shí)，樣品被編碼后分裝于96孔板內(nèi)。
[0036]4.2候選多態(tài)的基因分析
[0037]4.2.1 SNP 分型方法
[0038]根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物和單核苷酸擴(kuò)展引物，采用高通量的MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)(Sequenom)分析候選SNP的基因型。SNP分型由博淼生物科技(北京)有限公司協(xié)助完成。MassARRAY系統(tǒng)的工作原理是利用雜交探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合后進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)不同等位基因延伸長(zhǎng)度不同，通過(guò)質(zhì)譜飛行時(shí)間不同鑒別探針延伸長(zhǎng)度來(lái)確定不同基因型，其基因分型準(zhǔn)確率達(dá)到97%以上。MassARRAY系統(tǒng)是目前唯一采用質(zhì)譜法直接檢測(cè)SNP的設(shè)備，其反應(yīng)體系不依賴雜交，因此不受雜交錯(cuò)配的干擾。該系統(tǒng)與TaqMan分型平臺(tái)不同，也不需要對(duì)引物或探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，避免了熒光物質(zhì)對(duì)基因分型過(guò)程的干擾。
[0039]為了質(zhì)量控制，基因分型檢測(cè)時(shí)均設(shè)平行重復(fù)樣品和陰性對(duì)照(不含DNA的空白)，平行樣品分析結(jié)果的重現(xiàn)率為100%。此外，每一樣品的疾病狀態(tài)對(duì)分型操作及分析人員保持盲態(tài)。
[0040]4.2.2 Sequenom 實(shí)驗(yàn)操作步驟
[0041]4.2.2.1 引物設(shè)計(jì)
[0042]根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息,使用sequenom公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay design3.1,設(shè)計(jì)并合成PCR反應(yīng)和單堿基延伸引物(表1)。
[0043]表1各SNP位點(diǎn)PCR反應(yīng)弓丨物和延伸弓丨物
[0044]

【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)用于判斷人晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的SNP marker基因型的試劑，其特征在于，所述SNP marker是rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑包括用于擴(kuò)增所述rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述用于擴(kuò)增rs9912773位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’ -ACGTTGGATGCAGTTGATTGTTAAAGCTGCC-3’;反向引物5’-ACGTTGGATGGGTCTGTTTTGTGGGTTTTC-3’;所述用于擴(kuò)增rsl294991位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下:正向引物5’ - ACGTTGGATGATCATGGGCTATCCCCAACA-3’；反向引物5’ -ACGTTGGATGGAGAATACACGCTTAGAGAG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述試劑還包括能夠使用MassARRAYSequenom檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)基因型的單堿基延伸引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，對(duì)于rs9912773位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，所述單堿基延伸引物序列為:5’ -tttgTTGTAGAGCTCAGACCT-3’ ；對(duì)于rsl294991位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，所述單堿基延伸引物序列為:5’ -AGAGAGAATCTAGAAAGAAACA-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑包括能夠使用MassARRAYSequenom檢測(cè)rs9912773和/或rsl294991位點(diǎn)基因型的單堿基延伸引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑，其特征在于，對(duì)于rs9912773位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，所述單堿基延伸引物序列為:5’ -tttgTTGTAGAGCTCAGACCT-3’ ；對(duì)于rsl294991位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，所述單堿基延伸引物序列為:5’ -AGAGAGAATCTAGAAAGAAACA-3’。
8.—種檢測(cè)權(quán)利要求1所述的SNP marker基因型的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述的試劑和/或權(quán)利要求6所述的試劑。
9.一種用于判斷晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)吉非替尼治療反應(yīng)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求2所述的試劑和/或權(quán)利要求6所述的試劑。
10.權(quán)利要求1所述的S NPmarker在制備權(quán)利要求2所述的試劑和/或權(quán)利要求6所述的試劑、和/或權(quán)利要求8或9所述的試劑盒中的用途，權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的試劑在制備權(quán)利要求8或9所述的試劑盒中的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104131102SQ201410387024
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】馬飛, 寧力 申請(qǐng)人:馬飛