利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法：將含重組腈水解酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，以濕菌體作為催化劑，以1-氰基環(huán)己基乙腈為底物，以pH值為3.0?10.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在25?70°C進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含1-氰基環(huán)己基乙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸；所述含重組腈水解酶基因的工程菌由SEQIDN0.2所示核苷酸序列編碼基因構(gòu)建而成；本發(fā)明所述含腈水解酶的工程菌作為催化劑，具有良好的區(qū)域選擇性和催化活力，生產(chǎn)過程對環(huán)境友好。
【專利說明】利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種加巴噴丁關(guān)鍵中間體1-氰基環(huán)己基乙酸的制備方法，特別涉及 一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 1-氰基環(huán)己基乙酸是合成加巴噴丁的關(guān)鍵中間體，目前主要用化學(xué)法生產(chǎn)，反應(yīng) 條件苛刻，產(chǎn)生的廢氣須大量堿液吸收，步驟較多，收率較低。
[0003] 腈水解酶能夠?qū)崿F(xiàn)有機(jī)腈化合物的一步區(qū)域選擇性水解合成對應(yīng)的有機(jī)羧酸。通 過腈水解酶實(shí)現(xiàn)氰基水解反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)效率高，而且具有比較高的區(qū)域選擇性和立 體選擇性。近年來，利用腈水解酶進(jìn)行氰基水解合成有機(jī)羧酸已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，大量文 獻(xiàn)、專利報(bào)道了利用腈水解酶的區(qū)域選擇性在有機(jī)羧酸合成中的應(yīng)用。
[0004] Zhu等人報(bào)道了來自于菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110中的臆水解酶 bll6402 (Dimming Zhu, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1667-1670)，發(fā)現(xiàn)此臆水解酶可以催 化各種雙腈，對部分雙腈（包括1-氰基環(huán)己基乙腈及其類似物）具有較高的區(qū)域選擇性。
[0005] Sophie Bergeron 等人報(bào)道了 一 株臆水解酶 BD9570 (來自 Diversa) (Sophie Bergeron, Organic Process Research & Development 20〇6, 10, 661_665)，此臆水解酶可 以催化3-羥基戊二腈合成阿托伐他汀側(cè)鏈關(guān)鍵手性中間體（R) -4-氰基-3-羥基丁酸，具 有較高的區(qū)域選擇性和立體選擇性。
[0006] Zhiyi Xie等人報(bào)道了 一株來自于Arabidopsis thaliana的腈水解酶 AtNitl(Zhiyi Xie, Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2006,41，75 - 80),該 腈水解酶可以催化異丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中間體（3S)-3-氰基-5-甲基己酸，具 有很高的區(qū)域選擇性和立體選擇性。
[0007] John E. Gavagan等人報(bào)道了一株來源于Acidovorax facilis 72W腈水解酶（John Ε· Gavagan，J. Org. Chem.，1998, 63, 4792-4801)，該脂肪族腈水解酶對于 α，ω -雙腈具有 較好的區(qū)域選擇性。專利US2005009157 Al也報(bào)道了該腈水解酶可以催化1-氰基環(huán)己基 乙腈合成加巴噴丁中間體1-氰基環(huán)己基乙酸。
[0008] 專利 US2005009157 Al 還報(bào)道了商品化腈水解酶 NIT-104, NIT-105, NIT-106(來 自Biocatalytics Inc.)以及來自菌株Bacillus sphaericus的腈水解酶對于1-氰基環(huán) 己基乙腈具有區(qū)域選擇性活力。
[0009] Carmela Bengis-Garber 等人報(bào)道 了菌株 Rhodococcus rhodochrous N.C.I.B. 11216中的腈水解酶對于α，ω-雙腈的催化具有區(qū)域選擇性。且該菌株的 區(qū)域選擇性與底物α，ω-雙腈的碳鏈長度以及培養(yǎng)時(shí)所用的誘導(dǎo)劑有關(guān)。（Carmela Bengis-Garber 1Appl Microbiol Biotechnol(1989)32:11-16)
[0010] Chandrani Mukherjee 等人報(bào)道了 一 株來自于 Synechocystis sp. Strain PCC6803 的臆水解酶（Chandrani Mukher jee, Eur. J. Org. Chem. 2006, 5238 - 5242)，該臆水 解酶催化各種α，ω-雙腈，其區(qū)域選擇性與α，ω-雙腈的碳鏈長度有很大的關(guān)系。隨著 碳鏈長度的增加，該腈水解酶的區(qū)域選擇性逐漸下降。
[0011] 迄今為止，有關(guān)對1-氰基環(huán)己基乙腈具有區(qū)域選擇性催化活力的腈水解酶報(bào)道 較少，主要來自 Acidovorax facilis 72W，Bradyrhizobium japonicum USDA110，Bacillus sphaericus以及商品化腈水解酶見1'-104、見1'-105、見1'-106。但是這些腈水解酶催化1-氰 基環(huán)己基乙酸存在催化活性較低和催化劑用量較大的問題。所以篩選新型生物催化劑，開 發(fā)高效加巴噴丁關(guān)鍵中間體酶法合成工藝，建立綠色經(jīng)濟(jì)的加巴噴丁合成新工藝具有重要 意義。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明目的在于解決傳統(tǒng)的化學(xué)法水解1-氰基環(huán)己基乙腈為1-氰基環(huán)己基乙酸 的工藝中，反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)中需要大量的有機(jī)溶劑，成本較高，收率較低，環(huán)境污染較為 嚴(yán)重的問題。
[0013] 本發(fā)明提供一種水解1-氰基環(huán)己基乙腈的區(qū)域選擇性腈水解酶，該酶在催化上 述反應(yīng)時(shí)具有良好的區(qū)域選擇性和催化活力，生產(chǎn)過程對環(huán)境友好。
[0014] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0015] 本發(fā)明提供一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法，所述方法 為：將含重組腈水解酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，以濕菌體作為催化劑，以 1-氰基環(huán)己基乙腈為底物，以PH值為3. 0?10. 0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)（優(yōu)選pH值為7的 磷酸緩沖液），在25?70°C (優(yōu)選35°C )進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含1-氰基環(huán)己 基乙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得1-氰基環(huán)己基乙酸；所述含重組腈水解酶基因 的工程菌由SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列編碼基因構(gòu)建而成。所述底物初始濃度為0. 02? lmol/L，優(yōu)選100mmol/L，所述濕菌體的質(zhì)量終濃度為10?100g/L，優(yōu)選50g/L。
[0016] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：將含腈水解酶基因的工程菌接種至 含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150rpm培養(yǎng)10?12小時(shí)，獲得種子 液；隨即將種子液以體積濃度2%的接種量接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C、150rpm培養(yǎng)至培養(yǎng)液的OD 6tltl為0. 6?0. 8,向培養(yǎng)液中加入終濃度為0. ImM 的IPTG，28°C、150rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時(shí)，將培養(yǎng)液離心，取沉淀水洗，獲得濕菌體即為催化 齊U ;所述LB液體培養(yǎng)基組成為：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉，溶劑為 水，pH值為7。
[0017] 本發(fā)明所述1-氰基環(huán)己基乙酸分離純化的方法通常為：轉(zhuǎn)化結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液內(nèi)加 入7?8mL、10. 5M的NaOH溶液（使產(chǎn)物較好溶解，提高回收率），調(diào)pH至8. 5-9. 0,離心 (9000rpm，IOmin)，取上清液。往上清液中按體積比1:1比例加入乙醇水溶液（含水量5% 體積濃度）（去除菌體破碎產(chǎn)生的核酸，蛋白質(zhì)等），抽濾。取濾液，減壓蒸餾（溫度控制在 50°C以下）。餾出酒精后的剩余液體內(nèi)加入5%。的HC-767針劑用活性炭吸附雜質(zhì)，抽濾。濾 液內(nèi)加鹽酸調(diào)pH至2. 5左右，靜置，抽濾，將漏斗內(nèi)含有單酸的濾液回收烘干（35 °C以下）， 即獲得產(chǎn)物1-氰基環(huán)己基乙酸。
[0018] 本發(fā)明所述生物催化1-氰基環(huán)己基乙腈制備1-氰基環(huán)己基乙酸的反應(yīng)方程為：
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法，其特征在于所述方法 為：將含重組腈水解酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，以濕菌體作為催化劑，以 1-氰基環(huán)己基乙腈為底物，以PH值為3. O?10. O的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在25?70°C進(jìn)行 轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含1-氰基環(huán)己基乙酸的混合液，將混合液分離純化，獲得1-氰 基環(huán)己基乙酸；所述含重組腈水解酶基因的工程菌是由SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列編碼 基因構(gòu)建而成。
2. 如權(quán)利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法，其特征在于 所述底物初始濃度為〇. 02?lmol/L，所述濕菌體的質(zhì)量終濃度為10?100g/L。
3. 如權(quán)利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法，其特征在于 所述催化劑按如下方法制備：將含腈水解酶基因的工程菌接種至含終濃度50mg/L卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10?12小時(shí)，獲得種子液；隨即將種子液以體積濃度2% 的接種量接種至含終濃度50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至培養(yǎng)液的0D_ 為0. 6?0. 8,向培養(yǎng)液中加入終濃度為0. ImM的IPTG，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時(shí)，將培養(yǎng)液離 心，取沉淀水洗，獲得濕菌體即為催化劑；所述LB液體培養(yǎng)基組成為：10g/L胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，l〇g/L氯化鈉，溶劑為水，pH值為7。
4. 如權(quán)利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法，其特征在于 所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)介質(zhì)為pH值為7的磷酸緩沖液。
5. 如權(quán)利要求1所述利用腈水解酶工程菌制備1-氰基環(huán)己基乙酸的方法，其特征在于 所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為35°C。
【文檔編號】C12R1/19GK104212850SQ201410395753
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】薛亞平, 鄭裕國, 徐喆, 柳志強(qiáng), 王應(yīng)鵬, 蘇新瑞, 賈東旭 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)