一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法。本發(fā)明鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用于鑒別硬葉兜蘭的核苷酸分子探針上游YYF：如SEQIDNO.2所示；下游YYR：如SEQIDNO.3所示。運(yùn)用核苷酸分子探針YYF/YYR，通過常規(guī)PCR方法來鑒別硬葉兜蘭。本發(fā)明樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個(gè)操作；準(zhǔn)確、靈敏度高，YYF/YYR為硬葉兜蘭專一性分子探針，若為其他兜蘭種類，為陰性反應(yīng)；方法簡(jiǎn)單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間短，半日即可完成。
【專利說明】-種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別硬葉兜蘭的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種鑒別硬葉兜 蘭的核苷酸序列、分子探針和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 硬葉兜蘭是蘭科（Orchidaceae)兜蘭屬 的植物，主要分布于我國(guó)云南、廣西、貴州等省區(qū)和越南北部。硬葉兜蘭 因花奇特，花姿優(yōu)美具有較高的觀賞價(jià)值，因而有"玉女蘭"之稱，被譽(yù)為世界最美的花朵之 一。由于具有非常高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，人為過度采收和生境破壞嚴(yán)重，硬葉兜蘭野生 種群數(shù)量急劇下降，分布范圍逐步縮小，野生資源處于極度瀕危狀態(tài)，被《瀕危野生動(dòng)植物 物種國(guó)際貿(mào)易公約》列為一級(jí)保護(hù)植物。因此，為了有效保護(hù)和尋找新的硬葉兜蘭群體，建 立有效的鑒別硬葉兜蘭的方法是十分重要的。
[0003] 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究方法不能從本質(zhì)上準(zhǔn)確反映物種的遺傳變異與材料間的遺傳 關(guān)系，單獨(dú)利用傳統(tǒng)的分類方法難以對(duì)種質(zhì)資源的系統(tǒng)分類做出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。隨著生命科學(xué) 的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記鑒定技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行鑒定取得了 快速發(fā)展。DNA分子標(biāo)記技術(shù)彌補(bǔ)和克服了傳統(tǒng)鑒別方法的一些缺陷和難題。本實(shí)驗(yàn)采用 目標(biāo)起始密碼子多態(tài)（start codon targeted Polymorphism, SCoT)分子標(biāo)記方法，對(duì)硬 葉兜蘭及其他一些兜蘭種類的遺傳多樣性進(jìn)行研究，獲得了兜蘭SCoT指紋圖譜，從中篩選 出硬葉兜蘭特異性條帶，通過克隆、測(cè)序等，設(shè)計(jì)了特異性探針，應(yīng)用于硬葉兜蘭的鑒定，為 有效的鑒別和保護(hù)硬葉兜蘭資源提供有效的分子技術(shù)依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸 序列。
[0005] 本發(fā)明用于鑒別硬葉兜蘭的特征性核苷酸序列來源于SCoT通用引物2 (5' -CAACAATGGCTACCACCC-3'）擴(kuò)增所得的硬葉兜蘭特異性核苷酸序列，具體序列為： CAACAATGGCTACCACCCCTTAGCCTAAGGAGCTCTAAAGCTAGGGGAGGCTCCAGACTAGCGTTCCCCACG GTCGTATCACCGTGGAGACCGCCGGAGCCTCCCGGAAATGAAACCGAAAGAAAGAGCAGCCGGTGGTGGAGATAGAG GCTTACCCATGGTCCGTCAGTCAGATAAGAAGGTCCCTCGAGCTTCCTGGAGATGAGACGGAGCTAACGGCACCGGC CGGTGGTTGCAAGGTGGCCGGAGTTGACGTAGTCGACGGTGGTCAGTAACTTGTAAAGAGAGATTTCGGTATCATCG GGTATCCGTTTTTCACGATTTTTGATTCTATGTCCTCTTGAGGGGAAGGAGAATAACTTCCTAGGAGGAAGGTTGAG CTAAGGAGGGCTCTATGGATGACTTTGGAGGCTATCAATAGGGATTTTTTTTTGAGCTCGGAGAAGGATGGTAGCAG CGGATTTAGAGGGGCCTAGCAGGGCGCTCGGGTGGACGTTCCTCACAAATTTTGGCTCTATATTCTACTGAAGGGAA GGATAACAACTTATTAGAAGGAAGGTTGAGCTAATTAGGGCTCTATGGAGGACTTTGGAGGCTATCAATATAGGGAT TCCTTGAGCTCAAAGGAGGGTGGTAGCCATTGTTG，如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供基于上述鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列設(shè)計(jì)的用于鑒 別硬葉兜蘭的核苷酸分子探針（YYF/YYR)，該核酸分子探針序列如下： 上游引物 YYF :5' -GAAATGAAACCGAAAGAAAG-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示； 下游引物 YYR :5' -AATGGCTACCACCCTCCT-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0007] 上述核苷酸分子探針（YYF/YYR)，具有極高的專一性，僅與硬葉兜蘭發(fā)生反應(yīng)，而 不與其他兜蘭種類反應(yīng)。利用該探針通過常規(guī)PCR擴(kuò)增可以快速的對(duì)硬葉兜蘭進(jìn)行鑒別。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述鑒別硬葉兜蘭的分子探針的方法。
[0009] 本發(fā)明采用上述核酸分子探針（YYF/YYR)作為特異性擴(kuò)增引物，以硬葉兜蘭基因 組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，獲得清晰的硬葉兜蘭特異性條帶，實(shí)現(xiàn)對(duì)硬葉兜蘭的 鑒別。
[0010] 本發(fā)明具有的有益效果： 1) 樣品用量少，只需少量樣品就可以完成整個(gè)操作； 2) 準(zhǔn)確、靈敏度高，YYF/YYR為硬葉兜蘭專一性分子探針，若為其他兜蘭種類，為陰性 反應(yīng)； 3) 方法簡(jiǎn)單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間較短，半日就可以完成。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明所述的硬葉兜蘭的特異性核苷酸序列及對(duì)硬葉兜蘭專一性核酸分 子探針YYF和YYR的位置圖，左側(cè)為5'端，右側(cè)為3'端，其中黑色部分為專一性核苷酸分 子探針YYF和YYR擴(kuò)增的序列片段大小及位置； 圖2是采用SCoT引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳圖(箭頭所指的條帶是硬葉兜蘭特有的條 帶，分子量為646 bp);其中，1、麻栗坡兜蘭（云南麻栗坡)，2、麻栗坡兜蘭(浙江杭州），3、杏 黃兜蘭(云南麗江)，4、硬葉兜蘭(云南文山），5、卷萼兜蘭(廣西南寧)，6、亨利兜蘭(云南麻栗 坡)，7、帶葉兜蘭(廣西龍州)，8、紫紋兜蘭(廣東廣州），9、彩云兜蘭（云南文山），Μ為DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn) marker DL2000 ; 圖3是采用硬葉兜蘭特異性核酸分子探針YYF/YYR對(duì)不同兜蘭樣品進(jìn)行檢測(cè)的PCR 擴(kuò)增電泳圖；1、麻栗坡兜蘭（云南麻栗坡)，2、麻栗坡兜蘭(浙江杭州)，3、杏黃兜蘭(云南麗 江)，4、硬葉兜蘭（云南文山），5、卷萼兜蘭(廣西南寧)，6、亨利兜蘭（云南麻栗坡)，7、帶葉 兜蘭(廣西龍州)，8、紫紋兜蘭(廣東廣州)，9、彩云兜蘭（云南文山），Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) marker DL2000〇

【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明可以從分子水平上較為客觀準(zhǔn)確的鑒定硬葉兜蘭，具體包括：1.提供用于 硬葉兜蘭鑒定的DNA片段；2.提供來源于上述DNA片段的兜蘭專一性核酸分子探針；3. 提供上述核酸分子探針的應(yīng)用方法。
[0013] 在采用SCoT分子標(biāo)記研究兜蘭屬植物遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SCoT通用引物2 (5' -CAACAATGGCTACCACCC-3'）擴(kuò)增的指紋圖譜中，硬葉兜蘭有特異性條帶，能將其與其他 兜蘭種類區(qū)別開。因此，可根據(jù)此特異性條帶設(shè)計(jì)特異性的核酸分子探針，建立簡(jiǎn)便、快速、 準(zhǔn)確鑒定硬葉兜蘭的分子生物學(xué)方法。
[0014] 本發(fā)明提供的用于鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列來源于采用SCoT通用引物2 (5'-CAACAATGGCTACCACCC-3'）擴(kuò)增得到的硬葉兜蘭特異性序列，該序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
[0015] 本發(fā)明的硬葉兜蘭專一性核酸分子探針是以上述硬葉兜蘭核苷酸序列為基礎(chǔ)，利 用 Primer Primer 5. 0 軟件設(shè)計(jì)得到的。分子探針（YYF/YYR)如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID Ν0. 3 所示。
[0016] 本發(fā)明所提供的硬葉兜蘭的鑒定方法，可采用PCR方法：以本發(fā)明的核酸分子探 針（YYF和YYR)為PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體步驟和過程按常規(guī)PCR方法進(jìn)行，采用該 PCR方法可快速、準(zhǔn)確地鑒定硬葉兜蘭，且樣品用量少。
[0017] 通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1 :硬葉兜蘭特異性核苷酸序列的制備 1.基因組DNA的提取 剪取-80°C保存的兜蘭葉片0. 2 g放入研缽中，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用 上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取兜蘭屬基因組 DNA，用1%瓊脂糖膠對(duì)所得DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，稀釋至 50ng/y 1〇
[0018] 2. SCoT-PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè) 用SCoT通用引物2 (5' -CAACAATGGCTACCACCC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2 μ 1 10XBuffer，2yl MgCl2 (25πιΜ)，0·8μ1 dNTPs (10πιΜ)，1μ1 SCoT 引物 2 (10μΜ)，1μ1 模板 DNA (50ng/ μ 1)，0· 5 μ 1 Taq 酶（2U/ μ 1)，12. 7 μ 1 ddH20?？傮w積為 20 μ 1。
[0019] PCR 程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 4 min ;35 個(gè)循環(huán)（94°C變性 45 s，50°C退火 45 s，72°C 延伸2 min);最后于72°C下延伸10 min。
[0020] PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2,箭頭標(biāo)的條帶(分子量為646 bp)，是采用SCoT引物2進(jìn) 行PCR擴(kuò)增時(shí)尋找到的硬葉兜蘭特有的條帶。如圖2 (圖中，通道1?9為不同兜蘭樣品， 具體見【專利附圖】

【附圖說明】；通道Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000)所示，只有硬葉兜蘭(通道4) 在分子量536 bp有條帶出現(xiàn)，而其他兜蘭種類在分子量536 bp沒有條帶出現(xiàn)。因此，此條 帶為硬葉兜蘭的特有條帶。
[0021] 3.序列測(cè)定 利用SCoT通用引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)只 在硬葉兜蘭中出現(xiàn)的特異SCoT片段（圖2中箭頭所指片段)進(jìn)行切膠，采用PCR產(chǎn)物純化試 劑盒(上海生工）回收純化所切片段。然后將所純化的DNA片段連接到PUCm-T載體(上海 生工）上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后送生物公司測(cè)序(上海生工)，得到如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸組成和排列。
[0022] 實(shí)施例2 :硬葉兜蘭特異性核苷酸分子探針YYF/YYR的制備，PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè) 在獲得硬葉兜蘭特異性核苷酸序列的基礎(chǔ)上，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)得出 YYF/YYR的核苷酸序列（分別為SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3所示的)，引物由上海生工生物 工程有限公司合成。然后利用設(shè)計(jì)合成的引物YYF/YYR，對(duì)不同兜蘭樣品(具體見【專利附圖】

【附圖說明】） 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
[0023] PCR擴(kuò)增體系為 2μ 1 10 X Buffer，2μ 1 MgCl2 (25mM)，0· 8μ 1 dNTPs (10mM)， 1μ 1 引物 YYF (10μΜ)，1μ 1 引物 YYR(10yM)，ly 1 模板 DNA(50ng/y 1)，0· 5μ 1 Taq 酶 (2υ/μ1)，11·7μ1 ddH20?？傮w積為 20μ1。
[0024] 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4 min ;35個(gè)循環(huán)（94°C變性45 s，57°C退火45 s，72°C延 伸2 min);最后于72°C下延伸10 min。
[0025] 用1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，電泳圖如圖3所示，從圖3(圖中，通道 1?9為來自8種的9份兜蘭樣品，具體見【專利附圖】

【附圖說明】；通道Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000)，可以看出，只有硬葉兜蘭(通道4)能擴(kuò)增出特異性片段，而其他兜蘭種類沒有擴(kuò)增 出任何條帶，這表明本發(fā)明的核酸分子探針具有極高的專一性，因此可以用于快速的鑒別 硬葉兜蘭。將硬葉兜蘭的特異性片段送去測(cè)序，其序列如SEQ ID NO. 1的107?642位堿 基所示，其長(zhǎng)度為536 bp，具體序列信息見圖1。
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列為： CAACAATGGCTACCACCCCTTAGCCTAAGGAGCTCTAAAGCTAGGGGAGGCTCCAGACTAGCGTTCCCCACG GTCGTATCACCGTGGAGACCGCCGGAGCCTCCCGGAAATGAAACCGAAAGAAAGAGCAGCCGGTGGTGGAGATAGAG GCTTACCCATGGTCCGTCAGTCAGATAAGAAGGTCCCTCGAGCTTCCTGGAGATGAGACGGAGCTAACGGCACCGGC CGGTGGTTGCAAGGTGGCCGGAGTTGACGTAGTCGACGGTGGTCAGTAACTTGTAAAGAGAGATTTCGGTATCATCG GGTATCCGTTTTTCACGATTTTTGATTCTATGTCCTCTTGAGGGGAAGGAGAATAACTTCCTAGGAGGAAGGTTGAG CTAAGGAGGGCTCTATGGATGACTTTGGAGGCTATCAATAGGGATTTTTTTTTGAGCTCGGAGAAGGATGGTAGCAG CGGATTTAGAGGGGCCTAGCAGGGCGCTCGGGTGGACGTTCCTCACAAATTTTGGCTCTATATTCTACTGAAGGGAA GGATAACAACTTATTAGAAGGAAGGTTGAGCTAATTAGGGCTCTATGGAGGACTTTGGAGGCTATCAATATAGGGAT TCCTTGAGCTCAAAGGAGGGTGGTAGCCATTGTTG，如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. 基于如權(quán)利要求1所述的一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列設(shè)計(jì)的核苷酸分子探針 YYF/YYR，其特征在于該核酸分子探針序列如下： 上游引物 YYF :5' -GAAATGAAACCGAAAGAAAG-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示； 下游引物 YYR :5' -AATGGCTACCACCCTCCT-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示。
3. -種鑒別硬葉兜蘭的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求2所述的核苷酸分子探針 YYF/YYR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定硬葉兜蘭，具體步驟按常規(guī)PCR方法進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104152565SQ201410409089
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】王慧中, 馮尚國(guó), 何仁鋒 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)