Ace2多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組ACE2多肽，其中所述ACE2多肽以二聚體存在。所述二聚體特別地由糖基化的單體形成并且被用于制備具有延長的半衰期的藥學產(chǎn)品。
【專利說明】ACE2多肽
[0001] 本分案申請是基于申請?zhí)枮?00880100650. 6(國際申請?zhí)枮镻CT/ AT2008/000211)，申請日為2008年6月12日，發(fā)明名稱為"ACE2多肽"的原始中國專利申 請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的領域。
[0003] 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE2)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關鍵酶。它作為羧肽酶錨固 于膜上，作為受體主要在肺細胞、腎細胞和心臟細胞以及內(nèi)皮細胞上表達并裂解各種肽底 物。知名的代表底物是血管緊張素-II(Ang II)，其被裂解為血管緊張素l-7(Angl-7);血 管緊張素-1，其被裂解為血管緊張素1-9 ;同樣地，還有apelin和緩激肽。Ang II和Angl-7 是腎素_血管緊張素系統(tǒng)的拮抗劑。ACE2通過控制肽比例而決定性地負責血管厚度的調(diào)整 以及內(nèi)皮細胞的通透性并因此影響有機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。ACE2的表達尤其受細胞因子調(diào)節(jié) 并且在各種炎癥中降低，這繼而導致Ang II (ACE2最重要的底物之一）的病理性增加。
[0004] ACE2用于治療急性肺病的兩種形式ARDS或ALI，隨這兩種病在肺中出現(xiàn)下調(diào)的 ACE2表達。對于該種治療使用重組的可溶性人ACE2,其被全身性給予從而在最短的時間內(nèi) 供整個有機體使用，以便降低增加的Ang II濃度并與此同時產(chǎn)生Angl-7。這補償了增加的 Ang II濃度的負性作用。為此，很希望擁有一種產(chǎn)物，其具有合適的藥學特征：相應地，其具 有在有機體內(nèi)良好的分布、藥學上有意義的半衰期以及具有低免疫原性的適宜的物質(zhì)。特 別是該產(chǎn)物必須是有酶活性的、可良好溶解的以及在溶液中穩(wěn)定的，并且可以以高純度可 重復地和經(jīng)濟地進行制備。
[0005] Tipnis 等人（J Biol Chem. 275(43) (2000) : 33238-43)描述了 ACE2(在此文中還 被稱為ACEH)的分離和其cDNA的分離。通過在CH0細胞中進行生產(chǎn)獲得了具有120kDa摩 爾質(zhì)量的糖基化的蛋白質(zhì)單體。去糖基化后該蛋白質(zhì)具有85kDa的質(zhì)量。
[0006] Donoghue(Circ Res. 87(5) (2000) :1-9)描述了可溶性ACE2在CH0細胞中的表達， 它沒有完全被糖基化，并且表征為約90kDa的摩爾質(zhì)量。此外，該文獻還涉及各種ACE2序 列的序列對比和抗ACE2抗體。
[0007] W0 2004/023270 A2涉及ACE2單體在昆蟲細胞Sf9中表達后ACE2的結晶。在此 情況下，該蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量在質(zhì)譜分析后給出89. 6kDa。
[0008] 有效的酶替代療法的治療型轉(zhuǎn)變需要這樣的制備方法，其經(jīng)濟地和可重復地制備 高純度的藥學上有效的產(chǎn)物。ACE2的可溶的、細胞外截段包含7個N-糖基化位點。非糖基 化的ACE2是不溶的，傾向于聚集，是增強的免疫原并且具有縮短的半衰期。此外，它具有小 的流體力學直徑，其主要地不會負面地影響純化。因此，本發(fā)明的目的是提供具有好的體內(nèi) 半衰期的高活性ACE2。該目的通過權利要求的具體內(nèi)容來實現(xiàn)。
[0009] 本發(fā)明涉及重組ACE2多肽，其以二聚體存在。優(yōu)選的是糖基化的重組ACE2多肽， 其中ACE2多肽單體的糖基基團具有總計至少10、11、12、13、14、15或至少16個唾液酸殘 基，優(yōu)選14個唾液酸殘基，并且其中ACE2多肽以二聚體存在。同樣地，本發(fā)明包含具有本 文所述的糖基化的、摩爾加權平均的和進一步詳細說明的ACE2單體。優(yōu)選所述二聚體是同 二聚體，其單體單位特別地具有相同的序列和糖基化。通常，所述單體單位是非共價結合的 二聚體。單體可以通過變性步驟毫無困難地從二聚體獲得。優(yōu)選所有本文所述的糖基化不 但涉及二聚體而且也涉及單體，包括二聚體復合物的一個或兩個單體。特別優(yōu)選所述二聚 體包含兩個鋅離子。
[0010] "唾液酸殘基"，特別地理解為N-乙酰神經(jīng)氨酸類型（Neu5Ac)的殘基，特別是在 N-或0-糖基化。
[0011] 原則上，對于其半衰期從而其效應而言，治療劑的穩(wěn)定性是非常重要的標準。
[0012] 迄今為止，重組人ACE2僅鑒定為單體，并且在關于其功能、其晶體結構以及關于 其與高特異性抑制劑相互作用的文獻中也被描述為如此。
[0013] 因此，例如在參考 Vickers 等人（J Biol Chem277 (17)，2002:14838-14843)的情 況下，Towler 等人（J Biol Chem279 (17) ,2004:17996-18007)描述了 ACE2 在昆蟲細胞 Sf9 中的表達，其在作為最后純化步驟的小心的大小排阻色譜法之后以單體獲得。單體的摩爾 質(zhì)量為89. 6kDa。
[0014] 商購可得的ACE2同樣以單體形式存在（來自R&D Systems,編錄號933-ZN，批號 FIU035071)，其根據(jù)Tipnis等人（2000,同上）中的所述方法而制備，所不同的是，使用NS0 代替CH0細胞作為表達系統(tǒng)。它被描述為單體，其不但在還原條件下而且在非還原條件下 具有120kDa的摩爾重量。
[0015] 根據(jù) Donoghue 等人（Circ Res87, 2000: el-e9)，ACE2 單體在 CH0 細胞中表達，其 分泌后顯示90kDa的分子量。
[0016] 所有本文列出的文獻和出版物通過引用而合并入本文。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，為了使根據(jù)本發(fā)明的治療劑穩(wěn)定，發(fā)展了一種方法，其僅導致穩(wěn)定的 ACE2二聚體，所述二聚體相比于ACE2單體不但具有生產(chǎn)技術上的而且具有藥學上的優(yōu)點。
[0018] 所述二聚體化帶來下列的優(yōu)點：
[0019] ?在生理溶液中更好的溶解度和生物利用率：該二聚體顯示高的溶解度和更長的 體內(nèi)半衰期和利用率。
[0020] ?無聚集體形成：該ACE2二聚體了形成穩(wěn)定的復合物，而不會附加更多的ACE2分 子以形成二聚體。
[0021] ?減少的蛋白酶攻擊：因為單次蛋白質(zhì)切割后，在此所有的可能性都表明C-末端 部分在二聚體內(nèi)部，該C-末端不被降解。
[0022] ?增加的半衰期：由于低免疫原性、更好的溶解度和降低的對蛋白水解的易感性， 所述蛋白質(zhì)的半衰期增加了。
[0023] ?簡單的蛋白質(zhì)純化:ACE2二聚體的流體力學直徑基于其結構和大于計算直徑的 突出的溶劑化外殼。因此，ACE2二聚體能夠通過大小分離柱從來自蛋白質(zhì)表達的常規(guī)雜質(zhì)， 例如血清白蛋白（67kDa)中出色地被分離。
[0024] 優(yōu)選重組ACE2多肽在可能的N-糖基化位置的至少80%處被糖基化并且具有大 于 10% (總 ACE2 的質(zhì)量％ )或 11 %、12%、13%、14%，優(yōu)選大于 15%或 16%、17%、18%、 19%，特別地大于20%或21%、22%、23%、24%或25%的糖部分。
[0025]發(fā)展了 一種制備方法，其可重復地制備高純度的且有酶活性的、高度復雜的糖基 化ACE2。該產(chǎn)物表征為其高的糖部分（>20質(zhì)量％ )和復雜的、高度支化的、部分帶負電荷 的糖結構。這對產(chǎn)物的溶解度、生物利用率、酶活性以及藥學性質(zhì)產(chǎn)生積極作用。通過選擇 合適的表達構建體、合適的表達宿主、優(yōu)化的篩選策略，通過針對細胞代謝經(jīng)調(diào)整的培養(yǎng)基 以及通過細致的伴隨克隆分析和篩選，可以制備分泌所希望產(chǎn)物的細胞系。
[0026] ACE2已經(jīng)在昆蟲細胞Sf9和小鼠細胞NS0中進行了表達。該物質(zhì)主要在體外試驗 中使用。ACE2在CH0細胞中的瞬時表達也有結果。至今還沒有產(chǎn)生具有方法適宜的生產(chǎn)率 的細胞系。此外，還沒有進行關于產(chǎn)物性質(zhì)（特別是關于N-糖基化）的相應的克隆篩選。
[0027] 蛋白質(zhì)的溶解度不僅由其氨基酸序列而且由其折疊以及由翻譯后修飾所決定。主 要是所負載的糖結構，其決定性地增加蛋白質(zhì)的溶解度并影響其藥學特征。因此，就EP0而 言，可以表明，復雜的支化糖結構的存在積極影響這些蛋白質(zhì)的半衰期。
[0028] 原則上，為了進行ACE2的重組表達，考慮各種表達系統(tǒng)，其中基于缺失的N-糖基 化位點加工（Prozessierung)的原核生物宿主細胞不再進行測試。
[0029] 優(yōu)選至少70 %的糖基化的N-糖基化位點具有選自式1-8的相互獨立的結構：
【權利要求】
1. 重組ACE2多肽，其以二聚體存在。
2. 根據(jù)權利要求1的重組ACE2多肽，其特征在于，它被糖基化，其中ACE2多肽單體的 糖基基團具有總共至少14個唾液酸殘基。
3. 根據(jù)權利要求2的重組ACE2多肽，其特征在于，可能的N-糖基化位點的至少80 % 被糖基化并且具有大于10 % (質(zhì)量％，相對于整個ACE2分子），優(yōu)選大于15 %，特別地大于 20 %的糖部分。
4. 根據(jù)權利要求1、2或3的重組ACE2多肽，其特征在于，糖基化的N-糖基化位點的至 少70%相互獨立地選自式1-8的結構：
5. 根據(jù)權利要求1至4之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所有可能的N-糖基化位點 是都被糖基化的。
6. 根據(jù)權利要求1至5之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少80 %，優(yōu)選至少90 %， 特別地100 %的糖基化的N-糖基化位點具有式1-8的結構。
7. 根據(jù)權利要求1至6之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所述二聚體的ACE2單體單 位具有至少90kDa，優(yōu)選至少92kDa，尤其優(yōu)選至少94kDa，特別是至少96kDa，特別優(yōu)選至少 98kDa，最優(yōu)選至少IOlkDa的分子量。
8. 根據(jù)權利要求1至7之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所述ACE2多肽不具有跨膜 結構域，優(yōu)選ACE2多肽鏈由SEQIDNO: 1的氨基酸18-740或其酶活性片段組成。
9. 根據(jù)權利要求1至8之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDNO: 1的Ser740 相應的絲氨酸是O-糖基化的。
10. 根據(jù)權利要求1至9之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少70 %，優(yōu)選地至少 80 %，特別是至少90 %，最優(yōu)選100 %的糖基化的N-糖基化位點具有唾液酸，優(yōu)選與SEQID NO: 1 的Asn53、Asn90、Asnl03、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690 對應的N-糖基化位點被唾 液酸化。
11. 根據(jù)權利要求1至10之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少30%，優(yōu)選至少 40%，特別是至少55%，最優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點具有兩個唾液酸。
12. 根據(jù)權利要求1至11之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asn53 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
13. 根據(jù)權利要求1至12之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asn90 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
14. 根據(jù)權利要求1至13之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asnl03 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
15. 根據(jù)權利要求1至14之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asn322 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
16. 根據(jù)權利要求1至15之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asn432 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
17. 根據(jù)權利要求1至16之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asn546 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
18. 根據(jù)權利要求1至17之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:1的Asn690 相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、 7或8的結構的聚糖。
19. 重組ACE2多肽的制劑，其包含至少根據(jù)權利要求1至18之一的多肽，其特征在于， 具有通過凝膠電泳所測得的低于IOOkDa,優(yōu)選低于104kDa，特別優(yōu)選低于108kDa，特別是 低于112kDa，尤其優(yōu)選低于117kDa，最優(yōu)選低于119kDa的分子量的所述ACE2多肽部分以 低于20 %，優(yōu)選低于10 %，尤其優(yōu)選低于5 %，最優(yōu)選低于1 %，特別是0 %存在。
20. 根據(jù)權利要求19的制劑，其特征在于，具有跨膜結構域的ACE2多肽部分以低于 20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。
21. 根據(jù)權利要求19或20的制劑，其特征在于，ACE2的多聚體部分以低于20%，優(yōu)選 低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。
22. 根據(jù)權利要求19至21之一的制劑，其特征在于，ACE2分子的ACE2二聚體部分為 至少70 %，優(yōu)選至少80 %，尤其優(yōu)選至少90 %，特別優(yōu)選至少95 %，最優(yōu)選至少99 %。
23. 根據(jù)權利要求19至22之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的Asn53 的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60 %，優(yōu)選大于70 %，尤其優(yōu)選大于80 %，特 別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別為100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的 根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
24. 根據(jù)權利要求19至23之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的Asn90 的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60 %，優(yōu)選大于70 %，尤其優(yōu)選大于80 %，特 別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)地大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的 根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
25. 根據(jù)權利要求19至24之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的 Asnl03的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于 80 %，特別優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于99 %，特別是100 %，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中 定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
26. 根據(jù)權利要求19至25之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的 Asn322的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于 80 %，特別優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于99 %，特別是100 %，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中 定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
27. 根據(jù)權利要求19至26之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的 Asn432的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于 80 %，特別優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于99 %，特別是100 %，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中 定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
28. 根據(jù)權利要求19至27之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的 Asn546的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于 80 %，特別優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于99 %，特別是100 %，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中 定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
29. 根據(jù)權利要求19至28之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的 Asn690的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于 80 %，特別優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于99 %，特別是100 %，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中 定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。
30. 根據(jù)權利要求19至29之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO: 1的 Ser740的0-糖基化絲氨酸的ACE2多肽部分大于60 %，優(yōu)選大于70 %，尤其優(yōu)選大于80 %， 特別優(yōu)選大于90 %，最優(yōu)選大于99 %，特別是100 %。
31. 根據(jù)權利要求1至30之一的ACE2多肽或制劑，其具有基于從AngII(血管緊張素 II)至Angl-7(血管緊張素1-7)的轉(zhuǎn)化的至少4/s，優(yōu)選至少5/s，尤其優(yōu)選至少6/s，特別 優(yōu)選至少7/s，最優(yōu)選至少7. 6/s的催化活性。
32. 用于制備優(yōu)選地根據(jù)權利要求1至31之一的重組ACE2多肽或重組ACE2的制劑的 方法，其包含這樣的步驟：將編碼ACE2的多核苷酸，優(yōu)選地沒有跨膜結構域的編碼ACE2的 多核苷酸引入真核細胞中；表達ACE2多肽并收集經(jīng)表達的ACE2,尤其是二聚體形式的，其 中其中表達時優(yōu)選Zn2+濃度至少為1. 5微摩爾。
33. 根據(jù)權利要求32的方法，其特征在于，所述編碼ACE2的多核苷酸設計在載體上。
34. 根據(jù)權利要求32或33的方法，其特征在于，所述ACE2表達用標記、優(yōu)選DHFR進行 篩選。
35. 根據(jù)權利要求34的方法，其特征在于，所述標記存在于載體上。
36. 根據(jù)權利要求35的方法，其特征在于，所述載體具有用于所表達的ACE2mRNA的 IRES0
37. 根據(jù)權利要求32至36之一的方法，其特征在于，所述真核細胞是CHO細胞。
38. 重組ACE2多肽或重組ACE2多肽的制劑，其通過前述權利要求的方法而獲得。
39. 穩(wěn)定地用編碼ACE2的多核苷酸轉(zhuǎn)染的真核細胞系，優(yōu)選CHO細胞系，表達根據(jù)權利 要求1至31之一的ACE2。
40. 根據(jù)權利要求39的細胞，其具有至少IOpg/細胞/天，優(yōu)選至少15pg/細胞/天， 尤其優(yōu)選至少20pg/細胞/天的ACE2生產(chǎn)率。
41. 藥物，其包含根據(jù)權利要求1至18之一、31或38的重組ACE2多肽或根據(jù)權利要 求19至31之一或38的制劑。
【文檔編號】C12N15/85GK104450654SQ201410412672
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2008年6月12日 優(yōu)先權日:2007年6月12日
【發(fā)明者】M·舒斯特, H·洛博內(nèi), E·揚奇克-哈瓦拉特, B·佩巴爾, S·斯蘭內(nèi), B·瓦格內(nèi), R·維克 申請人:阿派隆生物制劑股份公司