一種固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法
【專利摘要】一種固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，包括以下步驟：a.工程菌的固定化處理；b.增值固定化工程菌；c.將增值的固定化工程菌投入土壤中，培養(yǎng)后測定土壤中有機(jī)磷的含量。本發(fā)明方法簡便，操作程序易于控制，無毒，通氣性良好，不會(huì)造成土壤的二次污染，降解有機(jī)磷速度快等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng) 藥的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前我國約有87?107萬hm2的農(nóng)田土壤受到有機(jī)磷農(nóng)藥污染，種植在農(nóng)藥污 染的土壤上的作物從土壤中吸收累積農(nóng)藥，不但影響植物的正常生長發(fā)育，而且還會(huì)在植 物體內(nèi)殘留，導(dǎo)致主要農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標(biāo)。大部分農(nóng)藥會(huì)落入土壤中，而且不斷的進(jìn) 行積累，破壞了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌種受到抑制，土壤微生物的種群趨于單一 化，引起原有的平衡紊亂、功能失調(diào)從而影響土壤物質(zhì)和能量的循環(huán)，影響土壤微生物的氨 化硝化和呼吸作用等，由此破壞了土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，影響著作物生長，造成土壤結(jié)構(gòu)板 結(jié)導(dǎo)致土壤退化、酸化、養(yǎng)分減少、農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降。
[0003] 土壤污染的治理主要有物理治理技術(shù)、化學(xué)治理技術(shù)、微生物治理技術(shù)、植物治理 技術(shù)。微生物治理技術(shù)有著物理、化學(xué)方法無可比擬的優(yōu)越性，如處理費(fèi)用低，處理效果好， 對環(huán)境的影響小，不會(huì)造成二次污染，不破壞植物生長所需的土壤環(huán)境，處理操作簡單等優(yōu) 點(diǎn)。微生物治理技術(shù)可通過自然的或人工方式加速土壤殘留農(nóng)藥的微生物降解，實(shí)現(xiàn)受污 染土壤的微生物修復(fù)。然而采用傳統(tǒng)的游離微生物技術(shù)修復(fù)受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤時(shí)存 在一些缺陷，如反應(yīng)速度慢、有效降解菌無法形成優(yōu)勢菌群、抗不利環(huán)境能力差、對環(huán)境變 化敏感、與土著菌競爭營養(yǎng)時(shí)處于劣勢，達(dá)不到污染土壤修復(fù)的預(yù)期目標(biāo)，而固定化細(xì)胞技 術(shù)有望克服這些缺點(diǎn)和弊端。
[0004] 固定化細(xì)胞技術(shù)是將細(xì)胞通過化學(xué)或物理的方法固定在水溶性或不溶性的顆粒 狀、管狀、膜狀的載體之上，使其保持活性并能反復(fù)使用的一種技術(shù)，較游離菌具有較大優(yōu) 勢，可以明顯地提高細(xì)胞對不利環(huán)境的適應(yīng)能力，能在持續(xù)增殖、休眠及衰亡的同時(shí)，其活 性始終保持穩(wěn)定，具有降低污染修復(fù)成本、節(jié)約能源消耗、簡化環(huán)保方法等很多優(yōu)點(diǎn)。目前 固定化技術(shù)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于流體介質(zhì)中，但在修復(fù)非流體介質(zhì)，尤其是有機(jī)磷農(nóng)藥污染的 土壤尚未見成功的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 解決的技術(shù)問題：針對現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種固定化工程菌 降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，降解效果好，避免對土壤造成二次污染。
[0006] 技術(shù)方案：為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為： 一種固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，包括以下步驟： a. 工程菌的固定化處理，采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌制成菌懸液，再經(jīng)液體發(fā)酵培 養(yǎng)基培養(yǎng)后得工程菌發(fā)酵菌種，以工程菌發(fā)酵菌種為固定化對象，采用固定化細(xì)胞技術(shù)，以 聚乙烯醇、海藻酸鈉、活性炭對工程菌進(jìn)行包埋，形成固定化工程菌； b. 將固定化工程菌接種到5(T80ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，溫度為 28~32°C，在轉(zhuǎn)速為150?250r/ min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)6~12h，用無菌紗布過濾分離得增 殖的固定化工程菌； c.將增殖的固定化工程菌按土壤重量3~10%投粒比，均勻分布于供試土壤中，再將 10(T600mg/kg有機(jī)磷農(nóng)藥添加到無菌水中，通過調(diào)節(jié)土壤含水量時(shí)加入，調(diào)節(jié)含水量達(dá)到 土壤飽和含水量的40~60%，培養(yǎng)后取樣檢測土壤中有機(jī)磷含量。
[0007] 作為優(yōu)選的是，所述工程菌為枯草芽孢桿菌菌株，已保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號：CGMCC No. 9272,保藏 日期：2014年06月05日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物 研究所。
[0008] 上述固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法中步驟a工程菌的固定化處理 的具體步驟為： (1) 采用LB液體培養(yǎng)基28-32 °C培養(yǎng)工程菌12-24h制成菌懸液，接種到含有 10(T600mg/L甲基對硫磷的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為5(T80 ml/250ml錐形瓶，搖勻， 28?32°C，15(T250 r/ min恒溫振蕩培養(yǎng)24?48 h，獲得工程菌發(fā)酵菌種； (2) 聚乙烯醇冷水溶脹后加入95°C水中溶解，將聚乙烯醇和活性炭混入海藻酸鈉溶液 中使三者終濃度分別達(dá)到10(Tl20 g/L、8?10 g/L和擴(kuò)11 g/L，將工程菌發(fā)酵菌種與液體 發(fā)酵培養(yǎng)基用無菌紗布過濾分離，菌種用去離子水清洗后，按照菌種：聚乙烯醇-海藻酸 鈉-活性炭溶液質(zhì)量體積比為1:1~2:1的標(biāo)準(zhǔn)取菌種加入聚乙烯醇-海藻酸鈉-活性炭溶 液中混勻； (3) 用注射器吸取上述混合液滴入8?10g/L的CaCl2溶液中形成直徑為0. 3?0. 5cm固 定化顆粒，室溫固定廣3h后，4°C冰箱固定4~6h，再用去離子水沖洗2~4遍后，直接加入液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中增殖或4°C冷藏備用。
[0009] 作為優(yōu)選的是，步驟b中固定化工程菌的培養(yǎng)溫度為30°C。
[0010] 作為優(yōu)選的是，工程菌的固定化處理中聚乙烯醇終濃度為120 g/L，海藻酸鈉終濃 度為10 g/L，活性炭終濃度為11 g/L，CaCl2溶液的濃度為10g/L。
[0011] 有益效果 本發(fā)明固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，具有方法簡便，操作程序易于控 制，無毒，通氣性良好，不會(huì)造成土壤的二次污染，降解有機(jī)磷速度快等優(yōu)點(diǎn)，與未固定化工 程菌相比，固定化工程菌穩(wěn)定、降解率高且降解速度快。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1固定化工程菌降解對硫磷的效果； 圖2固定化工程菌降解甲胺磷的效果； 圖3不同投粒的固定化工程菌比對降解對硫磷的影響； 圖4不同投粒的固定化工程菌比對降解甲胺磷的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面的實(shí)施例可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。
[0014] 本發(fā)明的生物材料的來源說明 1、工程菌：枯草芽孢桿菌菌株，已保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號：CGMCC No. 9272,保藏日期：2014年06月05 日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0015] 2、培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5, NaCl 10, pH 7. (T7. 2 ; 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 1〇, NH4Cl 2, KH2PO4 0? 5, K2HPO4 L 5, MgSO4 0? 2, NaCl 〇? 5,甲基對硫磷0? 1，pH 7. 0?7. 2。
[0016] 實(shí)施例1 本實(shí)施例說明工程菌的固定化處理。
[0017] (1)工程菌發(fā)酵菌種的制備： 接種工程菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C，250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜后，培養(yǎng)物繼 續(xù)于30°C，300 r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=O. 8,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. 2 mmol/L，繼續(xù)培 養(yǎng)3h，離心收集菌體，并用0. lmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0)清洗，于3000 r/min，4°C離心， 菌體重復(fù)洗滌、離心3次，制得菌懸液；菌懸液按照4%接種量（v/v)接種到50ml液體發(fā)酵 培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，30°C，250 r/min振蕩培養(yǎng)12h，液體菌種按照上述接種量擴(kuò)大 培養(yǎng)至240ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/500ml錐形瓶，獲得工程菌發(fā)酵菌種。
[0018] (2)PVA冷水溶脹后加入95°C水中溶解，將PVA和活性炭混入SA溶液中，使三者終 濃度分別為100 g/L、9 g/L和10 g/L，用無菌紗布過濾分離工程菌發(fā)酵菌種與發(fā)酵培養(yǎng)基， 工程菌發(fā)酵菌種用去離子水清洗后，按照工程菌發(fā)酵菌種：PVA-SA-活性炭溶液=1 :l(w/v) 的比例，取0. 3g菌體，加入300ml PVA-SA-活性炭溶液混勻。
[0019] (3)用5號注射器吸取上述菌體與PVA-SA-活性炭溶液滴入到9 g/L的CaCl2溶 液中得約2500個(gè)固定化工程菌顆粒，粒徑約0. 5cm，室溫固定Ih后，4°C冰箱固定4h，顆粒 用去離子水沖洗2遍后4°C冷藏備用。
[0020] 實(shí)施例2 本實(shí)施例說明固定化工程菌的增值。
[0021] 將固定化工程菌接種到50ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，溫度為30°C， 在轉(zhuǎn)速為250 r/ min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)6 h，用無菌紗布過濾分離得增殖的固定化工程 菌。
[0022] 實(shí)施例3 本實(shí)施例比較固定化工程菌與非固定化工程菌對降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的效果。
[0023] 將增殖的固定化工程菌按土壤重量5%投粒比，均勻分布于供試土壤中，添加有 機(jī)磷農(nóng)藥使其終濃度為100 mg/kg，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間土壤的持水量保持在 60%，培養(yǎng)12h、24h和36h后取樣，按照快速溶劑萃取（ASE)方法制樣，環(huán)己燒萃取各土樣 中的農(nóng)藥，高效液相色譜檢測土壤中對硫磷和甲胺磷殘留量。以相同的方法和步驟接種未 經(jīng)固定化的工程菌和不接菌的作為對照，檢測結(jié)果如表1所示，其中，CK代表不接菌的空 白樣品，非固定化是指未經(jīng)固定化處理的工程菌，固定化是指本發(fā)明固定化工程菌，降解率 (%) = (1 -處理樣品殘留量/對照樣品殘留量）X 100%。
[0024] 高效液相測定對硫磷色譜條件：色譜柱Hypersil C18柱；流動(dòng)相：V (甲醇）：V (水）：=80 :20 ;流速：1.0 ml/ min ;檢測波長 280 nm，柱溫：35°C ;進(jìn)樣量：20ii 1。
[0025] 高效液相測定甲胺磷色譜條件：色譜柱Hypersil C18柱；流動(dòng)相：V (甲醇）：V (水）：=30:70;流速：1.5 1111/111111;檢測波長215 11111，柱溫：301：;進(jìn)樣量：15111。
[0026] 表I CK、非固定化與固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的效果：

【權(quán)利要求】
1. 一種固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于，包括以下步驟：a. 工程菌的固定化處理，采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌制成菌懸液，再經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基培 養(yǎng)后得工程菌發(fā)酵菌種，以工程菌發(fā)酵菌種為固定化對象，采用固定化細(xì)胞技術(shù)，以聚乙 烯醇、海藻酸鈉、活性炭對工程菌進(jìn)行包埋，形成固定化工程菌；b.將固定化工程菌接種到 5(T80ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，溫度為28?32°C，在轉(zhuǎn)速為150?250r/ min 的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)6~12h，用無菌紗布過濾分離得增殖的固定化工程菌；c.將增殖的固 定化工程菌按土壤重量:T10%投粒比，均勻分布于供試土壤中，再將10(T600mg/kg有機(jī) 磷農(nóng)藥添加到無菌水中，通過調(diào)節(jié)土壤含水量時(shí)加入，調(diào)節(jié)含水量達(dá)到土壤飽和含水量的 40~60%，培養(yǎng)后取樣檢測土壤中有機(jī)磷含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于：所 述工程菌為枯草芽孢桿菌菌株，已保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號：CGMCC No. 9272,保藏日期：2014年06月05日， 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于，步 驟a工程菌的固定化處理的具體步驟為： (1) 采用LB液體培養(yǎng)基28-32 °C培養(yǎng)工程菌12-24h制成菌懸液，接種到含有 10(T600mg/L甲基對硫磷的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為5(T80 ml/250ml錐形瓶，搖勻， 28?32°C，15(T250 r/ min恒溫振蕩培養(yǎng)24?48 h，獲得工程菌發(fā)酵菌種； (2) 聚乙烯醇冷水溶脹后加入95°C水中溶解，將聚乙烯醇和活性炭混入海藻酸鈉溶液 中使三者終濃度分別達(dá)到10(Tl20 g/L、8?10 g/L和擴(kuò)11 g/L，將工程菌發(fā)酵菌種與液體 發(fā)酵培養(yǎng)基用無菌紗布過濾分離，菌種用去離子水清洗后，按照菌種：聚乙烯醇-海藻酸 鈉-活性炭溶液質(zhì)量體積比為1:1~2:1的標(biāo)準(zhǔn)取菌種加入聚乙烯醇-海藻酸鈉-活性炭溶 液中混勻； (3) 用注射器吸取上述混合液滴入8?10g/L的CaCl2溶液中形成直徑為0. 3?0. 5cm固 定化顆粒，室溫固定廣3h后，4°C冰箱固定4~6h，再用去離子水沖洗2~4遍后，直接加入液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中增殖或4°C冷藏備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于：步 驟b中固定化工程菌的培養(yǎng)溫度為30°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述固定化工程菌降解土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，其特征在于：聚 乙烯醇終濃度為120 g/L，海藻酸鈉終濃度為10 g/L，活性炭終濃度為11 g/L，CaCl2溶液 的濃度為l〇g/L。
【文檔編號】C12N11/10GK104208841SQ201410419449
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】董玉瑋, 李同祥, 高明俠, 湯薇 申請人:徐州工程學(xué)院