一種伯克氏菌株、其有機磷酯水解酶和基因及其在有機磷農(nóng)藥降解中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定為伯克氏屬(Burkholderia?jiangsuensis)的菌株ECU1088，其保藏號為CGMCC?No.9028；該菌種表達的有機磷酯水解酶及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，其重組酶及其制備方法，以及利用該有機磷酯水解酶或重組有機磷酯水解酶降解有機磷農(nóng)藥的方法。本發(fā)明的有益效果在于：利用本發(fā)明提供的伯克氏菌株及其重組有機磷酯水解酶降解有機磷農(nóng)藥具有催化效果好、反應條件溫和、對環(huán)境友好等顯著優(yōu)點。
【專利說明】一種伯克氏菌株、其有機磷酯水解酶和基因及其在有機磷農(nóng)藥降解中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】,具體涉及一株伯克氏屬新種菌株Burkholderiajiangsuensis E⑶1088，其保藏號為CGMCC9028，該伯克氏新菌株表達的有機磷酯水解酶及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，及其重組酶的制備方法，還涉及有機磷酯水解酶或其重組酶作為催化劑降解有機磷農(nóng)藥的應用。
【背景技術】
[0002]有機磷農(nóng)藥是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，對人體具有較高毒性，威脅人類健康。農(nóng)藥殘留是大量施用農(nóng)藥后的必然現(xiàn)象，如果超過最大殘留限量，會對人畜產(chǎn)生不良影響，或通過食物鏈對生態(tài)系統(tǒng)中的生物造成毒害。農(nóng)藥的發(fā)明和使用雖然大大提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量和效益，但隨著科學技術的發(fā)展和人們生活水平的提高，農(nóng)藥殘留對環(huán)境及人類健康造成的負面影響日益顯露出來。
[0003]大量研究表明，土壤微生物對環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著重要作用，篩選農(nóng)藥降解菌株無疑是控制農(nóng)藥殘留量，保護生態(tài)環(huán)境及人類健康的有效手段，有機磷農(nóng)藥降解菌主要是從有機磷農(nóng)藥污染的土壤、水體或污泥等環(huán)境中直接分離篩選或經(jīng)過富集培養(yǎng)獲得。目前已報道的有機磷農(nóng)藥降解菌主要為真菌和細菌，崔中利等人首次從Pseudomonas sp.M6的基因文庫中克隆了一種新的有機磷酯水解酶基因mpd(Appl.Environ.Microbiol.，67:4922-4925)，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基對硫磷的活力僅為 0.96U/ml,而后，人們分別從 Pseudomonas, Bacillus, Stenotrophomonas 等種屬的微生物中克隆出mpd基因 ，得到MPH酶。武漢病毒所周寧一等人從Pseudomonassp.WBC-3中克隆出mpd基因，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基對硫磷的比活力為12.7U/mg (Biochem Biophys Res Commun.，334:1107-1114),純酶液為 50.5U/mg (Research inMicrobiology.，158:143-149)，目前研究報道的重組有機磷酯水解酶催化活力還有待提高，且降解菌株的多樣性和新穎性也有待豐富。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]因此，本發(fā)明要解決的技術問題就是豐富降解菌株的多樣性，并從中挖掘新的有機磷農(nóng)藥降解酶。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案之一是:
[0006]1.本發(fā)明提供了一株伯克氏新菌株 Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028,是發(fā)明人從浙江、江蘇、上海、陜西等地區(qū)的150多份有機磷農(nóng)藥污染的土壤樣品中，經(jīng)過初篩、復篩及分離純化，得到的產(chǎn)有機磷酯水解酶的新菌株。
[0007]2.篩選菌株所用的培養(yǎng)基為本領域常規(guī)使用的培養(yǎng)基，本發(fā)明所述培養(yǎng)基優(yōu)選配方為:
[0008](I)富集培養(yǎng)基(MSM)配方:(NH4) 2S041.0g.l-1，K2HPO40.8g.l-1，KH2PO40.2g.l-1，MgS040.2g ?L-1, CaSO40.08g ?L-1, FeSO4 *7H200.005g.L-1，Na2MoO4 *2H200.0033g ?L-1,用自來水配制，pH7.0，第一輪添加終濃度為25mg.L-1的甲基對硫磷(MP)，每一輪逐步增加MP的濃度，直至底物濃度達到200mg.L-1 ；
[0009](2)豐富培養(yǎng)基(PY)配方:蛋白胨10.0g.L-\酵母膏5.0g ?L-1，氯化鈉5.0g ?L-1，用自來水配制，ΡΗ7.0 ;
[0010]3.本發(fā)明所述菌株的篩選方法包括以下步驟:
[0011](I)富集培養(yǎng):從浙江、江蘇、上海、陜西等地不同環(huán)境中采取土壤樣品。取Ig 土樣加入到5mL第一輪富集培養(yǎng)基中，30°C，180rpm培養(yǎng)3天后，按5 %的接種量轉接到5mL第二輪富集培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3d，不斷傳代，至MP濃度為200mg.L-1 ；
[0012](2)純種分離:富集培養(yǎng)后，取400 μ I樣品加入二倍體積的二氯甲烷進行萃取，分離萃取液，待二氯甲烷揮發(fā)完全后，加入20μ I乙腈，然后用薄板層析法定性檢測底物是否有減少或是否有產(chǎn)物生成，將有明顯底物減少或產(chǎn)物生成的富集培養(yǎng)液取樣劃線于含有200mg/L底物的MSM培養(yǎng)基固體平板上，30°C下倒置培養(yǎng)。置于30°C恒溫養(yǎng)箱中培養(yǎng)I~2d，觀察菌落的生長速率和水解圈的大小，初步判斷其降解能力，選擇水解圈大的，根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)進行單菌落的分離，分離后的單菌落于-20 V保藏用于初篩。
[0013](3)菌株初篩:挑取少量平板分離得到的單菌落，接入裝有5mL底物終濃度為SOOmg.r1的PY培養(yǎng)基的試管(15X150mm)中，于30°C，180rpm恒溫通風培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結束后取400 μ I培養(yǎng)液加入二倍體積的二氯甲烷進行萃取，12，OOOrpm離心2min，棄上層水相，下層有機相待二氯甲烷揮發(fā)完全后，加入20μ I乙腈重新溶解。采用薄板層析法定性檢測各菌株的活性大小，根據(jù)底物斑點是否明顯變淡或消失，淘汰沒有活性或者活性相對較低的菌株，將活性高的菌株 取一定體積的菌液分裝至事先滅菌的菌種保存管，以1:1 (v/v)的量加入50%的無菌甘油，置于_20°C保藏用于復篩。
[0014](4)菌株復篩:將初篩得到的活性較高的菌株接種到裝有5ml PY培養(yǎng)基的試管中，于30°C，180rpm培養(yǎng)24h，至生長對數(shù)期OD6tltl約為0.6-0.8，將菌液于8000rpm，離心5min，用無菌水洗滌兩次，加入無菌水調(diào)整0D_ = 1.0即為種子液，分別以I %的接種量接入裝有5ml豐富培養(yǎng)基PY的試管中，添加底物MP終濃度為200mg.L-1，于30°C，180rpm恒溫通風下反應。定時取樣，取200μ I反應液加入二倍體積的二氯甲烷萃取產(chǎn)物和底物，待有機相完全揮發(fā)后，加入200 μ I乙腈重新溶解，濾膜過濾后，即可通過高效液相色譜測定底物的降解速率。根據(jù)降解速率的檢測結果，淘汰性能較差的菌株，催化性能較好的菌株取一定體積的種子液分裝至事先滅菌的菌種保存管，以1:1 (v/v)的量加入50%的無菌甘油，置于-70°C保藏用于進一步研究。復篩菌株降解效果如表1所示。
[0015]表1.復篩菌株對MP降解狀況
[0016]
【權利要求】
1.一株伯克氏屬(Burkholderia jiangsuensis)菌株 EQJ1088,其保藏號為CGMCC9028。
2.如權利要求1所述的伯克氏屬(Burkholderiajiangsuensis)菌株EQJ1088,其特征在于，所述伯克氏菌株表達有機磷酯水解酶。
3.如權利要求2所述的有機磷酯水解酶，其特征在于，所述有機磷酯水解酶是具有SEQID N0.2所不氣基酸序列的蛋白質。
4.一種有機磷酯水解酶的編碼基因，其特征在于，其是如下(I)或(2)的核酸: (1)如序列表中SEQID N0.1所示的核酸； (2)編碼具有SEQID N0.2所不氣基酸序列的蛋白質。
5.一種重組表達載體，其包含如權利要求4所述的有機磷酯水解酶的編碼基因。
6.一種重組表達轉化體，其包含如權利要求5所述的重組表達載體。
7.—種重組有機磷酯水解酶的制備方法，所述方法包括:培養(yǎng)如權利要求6所述的重組表達轉化體，獲得重組表達的有機磷酯水解酶或含有機磷酯水解酶的重組生物細胞。
8.用如權利要求2所述的有機磷酯水解酶或如權利要求7所述方法獲得的重組表達的有機磷酯水解酶降解有機磷農(nóng)藥的方法。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于:所述有機磷農(nóng)藥包括甲基對硫磷、甲胺磷、毒死蜱、三唑磷、氧樂果、敵敵畏和二嗪磷。
【文檔編號】C12N1/20GK103952354SQ201410169274
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權日:2014年4月25日
【發(fā)明者】許建和, 柳絮云, 李春秀, 羅曉晶, 潘江 申請人:華東理工大學