轉(zhuǎn)基因玉米ie034的定性pcr檢測引物、方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測引物、方法及試劑盒。本方法首先公開了用于精準(zhǔn)檢測轉(zhuǎn)基因玉米IE034的特異性引物對。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測方法。本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測試劑盒。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因玉米IE034定性PCR檢測引物、方法及試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于轉(zhuǎn)基因玉米IE034及其衍生品種的特異性精準(zhǔn)檢測。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因玉米丨E034的定性PCR檢測引物、方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法，具體涉及轉(zhuǎn)基 因玉米IE034的定性PCR檢測引物、方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因玉米IE034是將密碼子經(jīng)過優(yōu)化的殺蟲基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn) 入玉米基因組中，獲得的一個抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品系。目前，IE034玉米已進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn) 階段，具有重大產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。建立IE034玉米的轉(zhuǎn)化體特異性精準(zhǔn)檢測方法，是對該轉(zhuǎn) 基因玉米進(jìn)行安全評價和安全監(jiān)管的重要手段。
[0003] PCR技術(shù)是當(dāng)前國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中應(yīng)用最為廣泛的方法。迄今為止，缺乏一 種針對轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米IE034及其衍生品種的特異性強(qiáng)、靈敏度高的定性PCR檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于公開轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測引物。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于公開一種轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于公開一種轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米IE034的轉(zhuǎn)化體特異性序列，設(shè)計(jì)合成IE034玉米的特異性定性PCR 檢測引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0: 1~2;確定定性PCR的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序；對定性 PCR檢測方法進(jìn)行特異性、靈敏度等測試。
[0008] 轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測引物，其核苷酸序列為： 上游引物序列，IE034-F1 :5' -TGCAGGAGAAGTTTGATGGA-3'（SEQ ID NO :1); 下游引物序列，IE034-R1 :5' -GGGTTTCGCTCATGTGTTG-3'（SEQ ID N0:2)。
[0009] 轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，包括以下步驟： (1) 合成上游引物（SEQ ID N0:1)和下游引物（SEQ ID N0:2); (2) 制備待測樣品的基因組DNA溶液； (3) 配制定性PCR反應(yīng)體系； (4) 運(yùn)行定性PCR反應(yīng)程序； (5) 若待測樣品中擴(kuò)增出258bp的特異性條帶，則該樣品中含有轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化 體成分；若待測樣品中未擴(kuò)增出258bp的條帶，則該樣品中不含有轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體 成分。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟（1)所述合成的上游引物和下游引物的濃度均為10Mffl〇l/L，步驟 (2)所述制備的DNA溶液的濃度為50ng/ μ L。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟（3)所述的配制定性PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括以下組 分：10XPCR緩沖液2. 5 μ L、dNTPs混合溶液2 μ L、上游引物0. 5 μ L、下游引物0. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶(λ 125 μ L、DNA 溶液 2 μ L、水 17. 375 μ L。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟（4)所述的定性PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C變性5min ;94°C變性30s， 58°〇退火3〇8,721：延伸3〇8，共進(jìn)行35次循環(huán)；721：延伸71^11。
[0013] 另外，本發(fā)明公開的轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測試劑盒，包括以 下組分：l〇XPCR緩沖液，dNTPs混合溶液，上游引物IE034-F1和下游引物IE034-R1，Taq DNA聚合酶和水。
[0014] 通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測引物、方法及試劑 盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于轉(zhuǎn)基因玉米IE034及其衍生品種的特異性精準(zhǔn) 檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為IE034玉米定性PCR檢測方法的反應(yīng)程序的篩選結(jié)果，a為56°C退火，b為 58°C退火，c為60°C退火，d為62°C退火，e為64°C退火；1為空白對照，2為陰性對照，3為 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的IE034玉米，4為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的IE034玉米； 圖2為IE034玉米定性PCR檢測方法的特異性測試結(jié)果，1為空白對照，2為陰性對 照，3為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的IE034玉米，4為轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034、M0N810、Btll、Btl76、 M0N863、M0N88017、MIR604、TC1507、59122 和 NK603 的混合樣品，5 為轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788、 GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、305423 和 356043 的混合樣品，6 為轉(zhuǎn)基因水稻 KF-6、 TT51-1 和 KMD-1 的混合樣品，7 為轉(zhuǎn)基因棉花 M0N531、M0N15985、M0N1445 和 LLC0TT0N25 的 混合樣品，8為轉(zhuǎn)基因油菜RF1、MS1、Topas 19/2和T45的混合樣品，Μ為DNA分子量Marker ; 圖3為IE034玉米定性PCR檢測方法的靈敏度測試結(jié)果，1為空白對照，2為陰性對照， 3?7依次為IE034玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、0· 5%、0· 1%、0· 05%、0· 01%的測試樣品，Μ為DNA 分子量Marker。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0017] 實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測方法的反應(yīng)程序優(yōu)化 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%和〇. 1%的IE034玉米為測試對象，以非轉(zhuǎn)基因玉米綜31為陰 性對照，以滅菌超純水為空白對照，設(shè)置56°C、58°C、60°C、62°C、64°C等5個退火溫度，采用 0· 2 μ mol/L的引物終濃度，進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增。
[0018] 結(jié)果表明（圖1)，使用5種不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，在IE034玉米質(zhì)量分 數(shù)為1%和0. 1%的樣品中均能擴(kuò)增獲得258bp的特異性條帶，表明本發(fā)明所述的檢測方法 對退火溫度有很好的容許度，最終確定退火溫度優(yōu)選為58°C，引物終濃度為0. 2 μ mol/L。
[0019] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測方法的特異性測試 對實(shí)施例1所述的轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測方法的特異性進(jìn)行測試，測試 樣品包括：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的IE034玉米，由轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034、M0N810、Btll、Btl76、 M0N863、M0N88017、MIR604、TC1507、59122和NK603制成的混合樣品（每種轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為 1%)，由轉(zhuǎn)基因大豆 M0N89788、GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、305423 和 356043 制成的混合樣品（每種轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，由轉(zhuǎn)基因水稻KF-6、TT51-1和KMD-1制 成的混合樣品（每種轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，由轉(zhuǎn)基因棉花M0N531、M0N15985、M0N1445 和LLC0TT0N25制成的混合樣品（每種轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，由轉(zhuǎn)基因油菜RF1、MSI、 Topasl9/2和T45制成的混合樣品（每種轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，非轉(zhuǎn)基因玉米綜31。
[0020] 結(jié)果表明（圖2)，僅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的IE034玉米樣品中擴(kuò)增出258bp的特異性條 帶，而其他轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因玉米中均未擴(kuò)增出258bp的條帶，表明本發(fā)明所述的檢 測方法對轉(zhuǎn)基因玉米IE034具有很好的特異性。
[0021] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定性PCR檢測方法的靈敏度測試 將轉(zhuǎn)基因玉米IE034與對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因玉米綜31按質(zhì)量比，混合制成IE034玉米質(zhì)量 分?jǐn)?shù)分別為l%、〇. 5%、0. 1%、0. 05%、0. 01%的樣品，對實(shí)施例1所述的轉(zhuǎn)基因玉米IE034的定 性PCR檢測方法的靈敏度進(jìn)行測試。
[0022] 結(jié)果表明（圖3)，在IE034玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%以上(含0. 05%)的樣品中均能穩(wěn) 定擴(kuò)增出258bp的特異性條帶，表明本發(fā)明所述的檢測方法的靈敏度可達(dá)到0. 05%。
[0023] 應(yīng)當(dāng)說明的是，上述實(shí)施例為本發(fā)明的具體實(shí)施例子，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 受上述實(shí)施例的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的 所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測引物，其特征在于： 上游引物序列，IE034-F1 :5' -TGCAGGAGAAGTTTGATGGA-3'（SEQ ID NO :1); 下游引物序列，IE034-R1 :5' -GGGTTTCGCTCATGTGTTG-3'（SEQ ID N0:2)。
2. 轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 合成權(quán)利要求1所述的上游引物和下游引物； (2) 制備待測樣品的基因組DNA溶液； (3) 配制定性PCR反應(yīng)體系； (4) 運(yùn)行定性PCR反應(yīng)程序； (5) 若待測樣品中擴(kuò)增出258bp的特異性條帶，則該樣品中含有轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化 體成分；若待測樣品中未擴(kuò)增出258bp的條帶，則該樣品中不含有轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體 成分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，其特征 在于，步驟（1)所述合成的上游引物和下游引物的濃度均為10Mffl 〇l/L，步驟（2)所述制備的 DNA溶液的濃度為50ng/ μ L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的轉(zhuǎn)基因玉米ΙΕ034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，其特 征在于，步驟（3)所述的配制定性PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括以下組分：10XPCR 緩沖液2. 5 μ L、dNTPs混合溶液2 μ L、上游引物0. 5 μ L、下游引物0. 5 μ L、Taq DNA聚合酶 0· 125 μ L、DNA 溶液 2 μ L、水 17. 375 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2?4所述的轉(zhuǎn)基因玉米ΙΕ034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，其 特征在于，步驟（4)所述的定性PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C變性5min ;94°C變性30s，58°C退火 3〇8,721：延伸3〇8，共進(jìn)行35次循環(huán)；721：延伸71^11。
6. 轉(zhuǎn)基因玉米IE034轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測試劑盒，包括以下組分：10XPCR緩沖 液，dNTPs混合溶液，權(quán)利要求1所述的上游引物和下游引物，Taq DNA聚合酶和水。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195256SQ201410457456
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】李飛武, 龍麗坤, 李蔥蔥, 徐俊鋒, 劉允軍, 閆偉, 董立明, 武奉慈 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院