一種唾液乳桿菌及其制藥用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離自人胃粘膜的可用于防治由幽門螺桿菌引起的胃病的唾液乳桿菌(Lactobacillus?salivarius)，其保藏號為：CGMCC?No.8379。本發(fā)明還提供了用于預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品，其活性成分包括所述唾液乳桿菌。此外，本發(fā)明還提供了一種用于抑制幽門螺桿菌的制品，其活性成分包括所述唾液乳桿菌。本發(fā)明還證實了篩選出的所述唾液乳桿菌不僅能很好的適應人胃環(huán)境，具有很強的抗幽門螺桿菌生長、粘附、定值的能力，同時還能顯著降低小鼠胃組織中由幽門螺桿菌引起的炎癥。
【專利說明】一種唾液乳桿菌及其制藥用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物生物【技術領域】，特別涉及一種分離自人胃粘膜的可用于防治由 幽門螺桿菌引起的胃病的唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)。

【背景技術】
[0002] 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, H. pylori)是一種革蘭氏染色陰性、單極、多 鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的微需氧細菌。研究表明，它是慢性胃炎、十二指腸炎、消化性 潰瘍的主要致病因素，也是胃癌的主要誘發(fā)因子，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將其列為I類致癌物 質(zhì)。H. pylori在全球的感染率多達50%，發(fā)展中國家高達90%。所以防治H. pylori感染 對保護人類健康具有重要的臨床意義。
[0003] H. pylori相關疾病的治療策略是將其清除，從一種或多種抗生素聯(lián)合殺菌發(fā)展為 抗生素與質(zhì)子泵抑制劑、胃粘膜保護劑合用。這些措施曾一度取得有效的療效，H. pylori的 根除率也能達到60% -90%。但隨著治療的深入，人們發(fā)現(xiàn)它們只在疾病早期效果顯著，對 再次感染者的療效差，并且停藥后會復發(fā)，對不同個體間的療效存在差異。長期治療會產(chǎn)生 療效不穩(wěn)定，菌株抗生素耐藥，藥物副作用，患者依從性差等負面效應。
[0004] 面對上述問題，人們不得不尋找新的治療途徑，例如研發(fā)H. pylori相關疫苗和微 生態(tài)制劑，以徹底清除H. pylori。乳桿菌是人體胃內(nèi)的重要菌群，在調(diào)節(jié)胃內(nèi)微生態(tài)平衡和 抵御致病菌的侵犯中起到主要作用，并且越來越多的乳桿菌被證實可發(fā)揮益生菌的功能。 它們被應用到基礎研究領域中治療肥胖，肝臟損傷，胃炎，腸炎等疾病。目前圍繞著乳桿菌 與H. pylori相互作用的研究很多，Yoon JH等報道利用乳桿菌抗H. pylori的效應，并聯(lián)合 二聯(lián)或三聯(lián)療法可根除H. pylori ;Rokka S等和Lorca GL等均發(fā)現(xiàn)小鼠模型中加氏乳桿菌 能有效降低H. pylori的定植及其對胃粘膜的炎癥損傷。程勝平等利用復方嗜酸乳桿菌片 聯(lián)合四聯(lián)療法治療H. pylori陽性的消化性潰瘍療效顯著，且不良反應少。但這些乳桿菌并 不是從人胃中分離得到的，同時沒有驗證其能否適應人胃環(huán)境，這使開發(fā)益生乳桿菌在人 胃中發(fā)揮抗幽門螺桿菌感染、定值和所致炎癥的效果受到影響。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明基于上述領域的空白，對從人胃粘膜分離出的6株乳桿菌（Bacterium lacticum)菌株分別進行了體外耐胃環(huán)境測試及體外和體內(nèi)抗幽門螺桿菌功能的驗證，最 終篩選出一株唾液乳桿菌菌株（Lactobacillus salivarius)，該菌株于2013年10月21日 保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 8379。本發(fā)明證實了所述 唾液乳桿菌菌株能在PH2. 5和0. 2 %膽鹽條件下生長，并能在體外抑制幽門螺桿菌生長和 粘附GES-1細胞。同時，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)所述唾液乳桿菌菌株在無菌昆明小鼠模型中能降低 幽門螺桿菌定值并緩解其導致的炎癥。
[0006] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0007] 一種唾液乳桿菌菌株，其保藏號為：CGMCC No. 8379。
[0008] 用于預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的 活性成分包括所述唾液乳桿菌菌株。
[0009] 用于預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的 活性成分是所述唾液乳桿菌菌株。
[0010] 所述制品還含有制備菌劑的常規(guī)輔料成分。
[0011] 用于抑制幽門螺桿菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述唾液乳 桿菌菌株。
[0012] 用于抑制幽門螺桿菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是所述唾液乳桿 菌菌株。
[0013] 所述制品還含有制備菌劑的常規(guī)輔料成分。
[0014] 所述唾液乳桿菌在制備預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品中的用 途，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述的唾液乳桿菌菌株。
[0015] 所述唾液乳桿菌在制備預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品中的用 途，其特征在于：所述制品的活性成分是所述的唾液乳桿菌菌株。
[0016] 本發(fā)明采集21例胃鏡檢查者的胃粘膜組織標本，經(jīng)選擇平板培養(yǎng)、分純培養(yǎng)，并 結合形態(tài)、生化反應鑒定以及乳桿菌16S rDNA特異性引物確認，最終獲得6株乳酸桿菌菌 株并分別命名為L1-L6。
[0017] 本發(fā)明在同等的實驗條件下，分別對分離出的6株乳桿菌菌株及標準菌 株L. acidophilus ATCC4356進行了耐酸能力測定，耐膽鹽能力測定，牛津杯法抑菌 (H. pylori)能力測定以及與H. pylori競爭性粘附GES-1細胞實驗，結果發(fā)現(xiàn)：菌株L3在 pH2. 5、pH3. 0時，培養(yǎng)4小時后其菌量增加了 180%，且在pH4. 0、pH4. 5時，相對于其它菌株 也保持穩(wěn)定生長優(yōu)勢；在耐膽鹽能力測定中，菌株L3在膽鹽濃度達到0. 2%時還能緩慢生 長；在用牛津杯法測定上述菌株抑制幽門螺桿菌的能力的實驗中，菌株L3的抑菌環(huán)直徑最 大；將上述各菌株分別加入含有H. pylori的GES-1細胞培養(yǎng)液中，測定最終幽門螺桿菌對 GES-1細胞的粘附率，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株L3處理的培養(yǎng)液中幽門螺桿菌對GES-1的粘附率最 低。上述實驗結果充分說明菌株L3具有極好的耐胃環(huán)境的能力以及很強的抗幽門螺桿菌 生長和粘附胃黏膜細胞的作用。
[0018] 篩選出的這株乳桿菌菌株L3經(jīng)16S rDNA特異性引物擴增比對確認為一株唾液乳 桿菌，菌落形態(tài)為菌落較大，圓形突起，乳黃色，表面光滑，革蘭陽性，兩端圓且排列不一桿 狀，可發(fā)酵葡萄糖、乳糖等。所述菌株已經(jīng)送保藏，其保藏信息如下：
[0019] 保藏信息
[0020] 菌種保藏名稱：唾液乳桿菌
[0021] 保藏號：CGMCC No. 8379
[0022] 拉丁名：Lactobacillus salivarius
[0023] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0024] 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0025] 保藏日期：2013-10-21
[0026] 此外，本發(fā)明還驗證了所述唾液乳桿菌CGMCC No. 8379在模式生物：無菌的昆明 小鼠中的抑菌和抗炎癥功能。結果證實了該菌株在小鼠體內(nèi)能有效抑制幽門螺桿菌的感染 并能顯著降低胃組織中的MPO等因子，從而改善胃粘膜局部的病例損傷達到降低胃組織炎 癥的功效。
[0027] 本發(fā)明除提供了上述具有耐胃環(huán)境能力和抑制幽門螺桿菌作用的唾液乳桿菌 CGMCC No. 8379外，還提供了以該乳桿菌作為活性成分的用于預防和/或治療由幽門螺 桿菌引起的胃病的制品，所述制品的制備方法是本領域技術人員熟知的常規(guī)手段，例如但 不限于：《一種穩(wěn)定安全的微生態(tài)制劑及其制備方法和用途》（CN1663573B)，《滅活的乳酸 菌微生態(tài)制劑及其制備方法》（CN101612169B)，《一種乳酸桿菌微生態(tài)制劑的制備方法》 (CN101530160A)等現(xiàn)有技術中公開的制備方法或操作步驟，目前市場上公開銷售使用的 "雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片"、"復方嗜酸乳桿菌片"的制備工藝等等。以所述唾液乳桿菌 菌株CGMCC No. 8379為活性成分，本領域技術人員可以按照所述常規(guī)手段和/或現(xiàn)有技術 文獻中公開的制備方法或操作步驟或目前市場上公開銷售使用的產(chǎn)品的制備工藝，或通過 合乎邏輯的分析、推理對上述制備方法進行適應性改進，可以獲得用于預防和/或治療細 菌性陰道病的制品，或者用于抑制致病性細菌的制品。
[0028] 所述制品的劑型優(yōu)選但不限于：片劑、膠囊劑等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為分離出的6株人胃源乳桿菌菌株的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜。
[0030] 圖2為6株人胃源乳桿菌菌株和標準菌株L.acidophilus ATCC4356在不同酸環(huán) 境下生長4小時后的菌量比較圖譜。
[0031] 圖3為6株人胃源乳桿菌菌株和標準菌株L. acidophilus ATCC4356在0· 05%膽 鹽濃度下各自的生長率。
[0032] 圖4為6株人胃源乳桿菌菌株和標準菌株L.acidophilus ATCC4356在0· 1 %膽鹽 濃度下各自的生長率。
[0033] 圖5為6株人胃源乳桿菌菌株和標準菌株L. acidophilus ATCC4356在0· 2%膽鹽 濃度下各自的生長率。
[0034] 圖6為經(jīng)唾液乳桿菌菌株CGMCC No. 8379和/或幽門螺桿菌菌株H. pylori M13 處理的昆明小鼠中胃組織的ΜΡ0含量檢測圖譜。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但并不限制本發(fā)明的范 圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的 材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 牛物材料的來源及記載出處
[0037] 21例無痛胃鏡檢查者胃粘膜組織標本采集自第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院 (經(jīng)患者許可后獲?。?。無菌的昆明小鼠來自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，標準菌株 L.acidophilus ATCC4356來自美國菌種保藏中心，幽門螺桿菌菌株H. pylori M13來自第三 軍醫(yī)大學臨床微生物學教研室。
[0038] 豐要試劑和耗材
[0039] MRS液體培養(yǎng)基（配方：稱取MRS干粉55. 0g至1L水中），TTC (2, 3, 5-氯化三苯 基四氮唑），Skirrow血平板（配方：1L水中含蛋白胨15. Og，胰蛋白胨2. 5g，酵母提取物 5. Og，NaC15. Og，瓊脂粉20. Og ;每200mL上述培養(yǎng)基中再加入10mL凍溶小牛血清、10%葡 萄糖lOmL，抗生素混懸液lmL(10y g/mL萬古霉素，2500國際單位多粘菌素 Β，5μ g/mL甲 氧芐啶），GES-1細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基（上海信裕生物科技有限公 司）），無菌牛津杯，細菌基因組提取試劑盒，MPO Elisa檢測試劑盒。實施例1唾液乳桿菌 CGMCC No. 8379的分離與功能鑒定
[0040] 一、6株人胃源乳桿菌的分離
[0041] 方法和步驟:
[0042] 采集第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院21例無痛胃鏡檢查者胃粘膜組織標本，（標本經(jīng) 許可后獲?。?，以分區(qū)劃線法涂布于MRS選擇性平板，37°C微需氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5天，挑 取乳白色單個菌落，革蘭染色陽性的進一步分純培養(yǎng)，再對生長的菌落按《伯杰斯細菌鑒定 手冊》進行形態(tài)和生化反應鑒定。提取經(jīng)分離純化后的細菌的基因組用乳桿菌16SrDNA特 異性引物（F:5, -AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'，R:5' -ATTTCACCGCTACACATG-3'）進行 PCR 擴 增，目的條帶為344bp，純化后測序，并在NCBI上比對該序列。結合形態(tài)、生化反應鑒定和 16SrDNA結果確定菌株名稱。
[0043] 分離鑒定結果：
[0044] 21例人胃粘膜組織經(jīng)MRS瓊脂平板培養(yǎng)后，共分離出6株乳桿菌。分離菌株在 此平板上的菌落特征及鏡下形態(tài)如表1，生化特性見表2。乳桿菌16SrDNA特異性引物擴 增平板上單個菌落細菌DNA后，1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳如圖1 ;同時將PCR產(chǎn)物純化送 invitrogen公司測序，將測序結果在NCBI中進行Blast相似性比對，結合分離菌株的菌落 特征及鏡下形態(tài)，將上述6株乳桿菌確定為L1、L2為口腔乳桿菌，L3為唾液乳桿菌，L4為 卷曲乳桿菌，L5為加氏乳桿菌，L6為德氏乳桿菌。
[0045] 表1分離菌株的菌落特征及鏡下形態(tài)
[0046]

【權利要求】
1. 一種唾液乳桿菌菌株，其保藏號為：CGMCC No. 8379。
2. 用于預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活 性成分包括權利要求1所述的唾液乳桿菌菌株。
3. 用于預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活 性成分是權利要求1所述的唾液乳桿菌菌株。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的制品，其特征在于：還含有制備菌劑的常規(guī)輔料成分。
5. 用于抑制幽門螺桿菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括權利要求1所 述的唾液乳桿菌菌株。
6. 用于抑制幽門螺桿菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是權利要求1所述 的唾液乳桿菌菌株。
7. 根據(jù)權利要求5或6所述的制品，其特征在于：還含有制備菌劑的常規(guī)輔料成分。
8. 權利要求1所述的唾液乳桿菌在制備預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制 品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分包括權利要求1所述的唾液乳桿菌菌株。
9. 權利要求1所述的唾液乳桿菌在制備預防和/或治療由幽門螺桿菌引起的胃病的制 品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分是權利要求1所述的唾液乳桿菌菌株。
【文檔編號】C12R1/225GK104195093SQ201410493719
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權日:2014年9月24日
【發(fā)明者】郭剛, 黃微微, 杜方川, 劉開云, 蒲瑞雪, 宋陽, 鄒全明 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學