新的粘膜乳桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的粘膜乳桿菌菌株，其能夠降低腸屏障通透性。該菌株尤其用于減輕腸屏障功能障礙。
【專利說明】新的粘膜乳桿菌菌株
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及新的粘膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)菌株及其用途,尤其是用于減輕腸屏障功能障礙。
【背景技術】
[0002]腸上皮充當防御屏障，以保護粘膜表面來抵抗腸腔內(nèi)容物和外部環(huán)境。
[0003]由于細胞之間存在緊密連接(TJ)，腸上皮層具有低水平的通透性。緊密連接是細胞間的復合物，其功能是作為屏障來限制物質(zhì)從腸腔到腸粘膜的轉移?？梢酝ㄟ^外部因素如一些腸道病原體或通過促炎癥細胞因子(尤其包括TNF-α和IFN-Y)誘導這些復合物的損壞；這會導致增加的上皮細胞細胞旁通透性，其有助于各種腸道疾病，尤其包括腸易激綜合征、慢性炎性腸疾病(克羅恩病(Crohn’ s disease)或潰瘍性結腸炎)和乳糜瀉(綜述參見(CLAYBURGH 等人，Lab Invest，84，282-91，2004))。
[0004]已知各種益生乳酸菌通過不同的機制對腸上皮有保護作用(綜述參見(OHLAND&MACNAUGHTON, American Journal of Phys1logy-Gastrointestinal and LiverPhys1logy, 298，G807-G19，2010)。然而，僅少數(shù)種類中的某些菌株被證明通過降低其通透性而改善上皮屏障功能。(RESTA-LENERT&BARRETT，Gastroenterology, 130, 731-46，2006)中報道，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)防止由TNF-α和IFN-Y誘導的上皮通透性的增加。(MIYAUCHI等人，JDairy Sci, 92, 2400-8, 2009)研究了 4 種乳桿菌(德氏乳桿菌(L.delbrueckii)的一種菌株、干酪乳桿菌(L.casei)的一種菌株、加氏乳桿菌(L.gasseri)的一種菌株和鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)菌株0LL2838)對損傷的腸屏障功能和由TNF-α誘導的細胞旁通透性的作用。他們發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌0LL2838顯著抑制了 TNF-α誘導的細胞旁通透性的增加，而其它測試菌株均無顯著作用。(D0NAT0等人，Microb1logy，156，3288-97，2010)中表明鼠李糖乳桿菌菌株LGG減輕了 TNF- α或IFN- Y對上皮屏障完整性的影響。(EUN等人，Apmis, 119,49-56,2010)中表明干酪乳桿菌菌株DN114001 (CNCM 1-1518)也阻止了由TNF-α或IFN-Y誘導的上皮通透性的增加。Z.Zakostelska等人近期報道副干酪乳桿菌DN-11400KCNCM 1-1518)的裂解物在體內(nèi)加強了腸細胞屏障的完整性(ZAK0STELSKA等人，2011。 Plos0ne6(ll)。
[0005]首次從豬小腸分離得到粘膜乳桿菌，后來也自人腸道和陰道以及自狗、牛犢和馬的腸道中分離得到。
[0006] Roos和其合作者首先表征其為一種物種(R00S等人，Int J Syst Evol Microb1l,50Ptl, 251-8, 2000)。在分類學上，粘膜乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)和橋乳桿菌(Lactobacillus pontis)密切相關。粘膜乳桿菌包含編碼細胞表面蛋白的mub基因，該蛋白賦予了粘膜乳桿菌結合粘液的能力。Roos等人描述其為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、非孢子形成、非運動桿、生長于45°C而不是15°C。
[0007]粘膜乳桿菌中的一些菌株顯示出具有抗微生物活性。Tzortis等人(TZ0RTZIS等人，JAppl Microb1l，96，552-9，2004)報道了，粘膜乳桿菌的菌株NCMB41149在存在麥芽寡糖或麥芽糖的情況下生長時，對大腸桿菌(Echerichia coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhymurium)具有體外抑制活性,而在存在葡萄糖、異麥芽寡糖、龍膽二糖或纖維二糖的情況下不具有該活性。PCT申請W02011/107960中描述了粘膜乳桿菌菌株DSM23409和DSM23408用于治療或預防大腸桿菌感染的用途。
[0008]目前為止，未報道任何粘膜乳桿菌物種的菌株對腸屏障功能有影響。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]現(xiàn)在，本發(fā)明人鑒定了一種新的粘膜乳桿菌菌株，其除了抗微生物活性之外，還具有改善腸屏障功能的能力，尤其是通過減少腸上皮通透性。
[0010]本發(fā)明的一個主題是根據(jù)布達佩斯條約于2011年2月3日保藏于CNCM(Collect1n Nat1nale de Cultures de Microorganismes,25rue du Docteur Roux,Paris)編號為1-4429的菌株。
[0011]CNCM 1-4429菌株是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的微生物，非運動性，不形成孢子；細胞形狀為大小I X 2-4 μ m的桿狀，分離時成對或以短鏈形式出現(xiàn)。
[0012]其具有抗微生物的性質(zhì),尤其強烈地抑制腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)的生長。
[0013]其還具有減少腸屏障通透性的性質(zhì)，換言之，保護或恢復上皮細胞旁的不透性，尤其是具有防止或恢復由TNF-α誘導的上皮細胞旁通透性的增加的性質(zhì)。
[0014]本發(fā)明的主題還包括可通過誘變或通過遺傳轉化CNCM 1-4429菌株獲得的粘膜乳桿菌菌株。優(yōu)選地，這些菌株保留了 CNCM 1-4429菌株在降低腸屏障通透性上的性質(zhì)。其可以是突變了 CNCM 1-4429菌株內(nèi)源基因中的一個或多個的菌株，例如以修改其一些代謝性質(zhì)(如該菌株代謝糖的能力、其對于腸轉運的耐受、其對酸度的耐受、其后酸化或其代謝物生產(chǎn))。其也可以是用一種或多種目標基因遺傳轉化CNCM 1-4429菌株所得到的菌株以使得可能如在所述菌株上賦予另外的生理特征或表達具有治療性或疫苗興趣的蛋白，其希望通過所述菌株的方法來施用。
[0015]這些菌株可以通過用于隨機或定向誘變和乳桿菌的遺傳轉化的常規(guī)技術自CNCM1-4429 菌株獲得，如 GURY 等人(Arch Microb1l.，182，337-45，2004)或 Velez 等人(ApplEnviron Microb1l.，73，3595-3604，2007)中所述的技術，或者被稱為“基因組改組”的技術(Patnaik 等人，Nat B1technol, 20, 707-12, 2002 ;Wang Y.等人，J B1technol., 129,510-15,2007)。
[0016]本發(fā)明的一個主題還是一種用于獲得能降低腸屏障通透性的粘膜乳桿菌菌株的方法，該方法包括誘變或遺傳轉化CNCM 1-4429菌株的步驟。
[0017]本發(fā)明的一個主題還是用于從根據(jù)本發(fā)明的粘膜乳桿菌菌株獲得能夠降低腸屏障通透性的細胞組分的方法。所述的細胞組分尤其是從所述菌株的培養(yǎng)物獲得的DNA制劑或細菌壁制劑。其也可以是培養(yǎng)物上清液或這些上清液的組分。
[0018]本發(fā)明的主題還是組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明的粘膜乳桿菌菌株，或可通過誘變或遺傳轉化CNCM 1-4429菌株而獲得的粘膜乳桿菌菌株，或從所述菌株獲得的細胞組分。
[0019]這些組合物尤其可以是乳酸發(fā)酵物，組合了根據(jù)本發(fā)明的粘膜乳桿菌和一種或多種其它的(可任選為益生的)乳酸菌菌株。可提及的乳酸菌菌株的舉例包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，尤其是保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌菌株(Streptococcus thermophilus strain)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、干酪乳桿菌(L.casei)、植物乳桿菌(L.pi ant arum)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、干酪乳桿菌亞種副干酪菌株(Lactobacillus casei ssp.paracasei strain)。
[0020]其也可以是食物產(chǎn)品，尤其是乳制品或藥物或化妝品，其包括根據(jù)本發(fā)明的粘膜乳桿菌菌株，或通過誘變或遺傳轉化CNCM 1-4429菌株而獲得的粘膜乳桿菌菌株，或從所述菌株獲得的細胞組分。
[0021]當所述菌株以活菌形式存在時，其優(yōu)選以每克至少15Cfu的比例存在，有利地每克產(chǎn)品至少106cfu，更有利地每克至少107cfu，甚至更有利地每克至少108cfu。
[0022]本發(fā)明的一個主題還是用于獲得上述組合物的方法，其特征在于其包括:
[0023]-獲得根據(jù)本發(fā)明的粘膜乳桿菌或可通過上述方法獲得的粘膜乳桿菌菌株，或根據(jù)本發(fā)明的細胞組分，和
[0024]-將所述菌株或組分摻入到所述組合物中。
[0025]本發(fā)明的粘膜乳桿菌菌株、細胞組分和組合物可用于治療或預防涉及腸屏障功能障礙的病況，尤其是與腸屏障通透性增加相關的病況。
【具體實施方式】
[0026]通過以下的進一步描述并參考闡述粘膜乳桿菌菌株CNCM 1-4429的表征和性質(zhì)的實施例可以更清楚地理解本發(fā)明。
[0027]實施例1-粘膜乳桿菌菌株CNCM 1-4429的形態(tài)和發(fā)酵性質(zhì)
[0028]形態(tài)
[0029]菌株CNCM 1-4429的電子顯微鏡圖像示于圖1。菌株CNCM 1-4429表現(xiàn)出扭曲的形狀；其是扭曲的桿狀菌。
[0030]碳水化合物代謝的分析:
[0031]在B1screen儀器(0y Growth Curves Ab Ltd)上進行糖發(fā)酵分析。選擇21種糖用于分析。將其列于表1中。
[0032]用B1screen進行的分析歷時24小時，在10秒振蕩之后的每20分鐘進行測量。進行2次分析，每次一式三份。為了避免分解代謝產(chǎn)物抑制葡萄糖的效果，對預培養(yǎng)使用具有半乳糖的培養(yǎng)基。
[0033]-預培養(yǎng)基MRS-半乳糖；
[0034]-培養(yǎng)基，含有I%待測糖的MRS
[0035]-在每個孔中；300μ L的培養(yǎng)基和I %的預培養(yǎng)基
[0036]-24h期間內(nèi)，10秒振蕩之后每隔20分鐘測量OD
[0037]空白是由不含細菌的MRS表示。
[0038] 結果示于下述表1中:(+)表示存在生長，(+/-)表示適度生長和(_)表示沒有生長。當OD值達到0.8或以上時，認為生長是陽性的。
[0039]
【權利要求】
1.一種以編號1-4429保藏于CNCM的粘膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)菌株。
2.一種獲得能降低腸屏障通透性的粘膜乳桿菌菌株的方法，其特征在于其包括誘變或遺傳轉化CNCM 1-4429菌株的步驟。
3.一種獲得能降低腸屏障通透性的細胞組分的方法，其特征在于所述細胞組分獲取自權利要求1所述的粘膜乳桿菌。
4.一種組合物，其包括權利要求1所述的粘膜乳桿菌菌株，或通過權利要求2所述的方法所獲得的粘膜乳桿菌菌株，或通過權利要求3所述的方法獲得的細胞組分。
5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于其是食品。
6.一種獲得權利要求4和5所述的組合物的方法，其特征在于其包括獲得權利要求1所述的粘膜乳桿菌菌株，或通過權利要求2所述的方法所獲得的粘膜乳桿菌菌株，或通過權利要求3所述的方法獲得的細胞組分，并將所述菌株或組分摻入到所述組合物中。
7.如權利要求1所述的粘膜乳桿菌菌株或如權利要求4所述的組合物，其用作治療或預防由腸屏障功能障礙 所引起的病癥的藥物。
【文檔編號】A61K35/74GK104053767SQ201180075632
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2011年12月21日 優(yōu)先權日:2011年12月21日
【發(fā)明者】塔瑪拉·什莫克維納, 瑪麗-克里斯蒂娜·德吉弗里 申請人:熱爾韋·達諾尼公司