雜交瘤細(xì)胞株fq-2g3,其產(chǎn)生的抗甲基毒死蜱單克隆抗體及免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，該細(xì)胞株分泌的抗甲基毒死蜱單克隆抗體及檢測甲基毒死蜱的免疫層析試紙條。雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO.C2014106。其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體可識(shí)別甲基毒死蜱，靈敏度高、特異性好。由該單克隆抗體研制的免疫層析試紙條可實(shí)現(xiàn)水、青菜和土壤中甲基毒死蜱的檢測，對(duì)檢測溶液中甲基毒死蜱含量的最低檢測限可達(dá)12.5ng/mL。CCTCC NO:C20141062014.05.30
【專利說明】雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，其產(chǎn)生的抗甲基毒死蜱單克隆抗體及免疫層析試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，其分泌的抗甲基毒死蜱的單克隆抗體及檢測甲基毒死蜱的免疫層析試紙條。

【背景技術(shù)】
[0002]甲基毒死蜱是一種廣譜的有機(jī)磷殺蟲劑，用于防止儲(chǔ)藏谷物中的害蟲和各種葉類作物上的害蟲，也用來防治蚊成蟲、蠅類、水生幼蟲和衛(wèi)生害蟲，目前仍在廣泛應(yīng)用。其作用機(jī)理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿是神經(jīng)遞質(zhì)，過量的乙酰膽堿過度刺激乙酰膽堿受體，導(dǎo)致靶生物死亡。同時(shí)，由于環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的增加，一些不是預(yù)定目標(biāo)的生物也遭到了毒害，包括人、魚等其他生物。
[0003]目前，農(nóng)藥的殘留檢測多采用薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等方法。這些方法的檢測限低、靈敏度高，已有相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可供參考，但由于需要昂貴的儀器、專門的操作人員，以及樣品前處理復(fù)雜、成本高、時(shí)間長，因此不能更好地滿足快速簡便的現(xiàn)場檢測要求。
[0004]免疫檢測方法具有快速、廉價(jià)、簡便、特異的優(yōu)點(diǎn)，可便攜而進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測?？朔藗鹘y(tǒng)檢測方法的缺點(diǎn)。要建立免疫檢測方法，特別是針對(duì)農(nóng)藥小分子的免疫檢測方法，篩選出高效單克隆抗體最為關(guān)鍵。本發(fā)明即為實(shí)現(xiàn)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品中甲基毒死蜱的免疫檢測方法，化學(xué)合成針對(duì)甲基毒死蜱的多種半抗原，與載體蛋白結(jié)合成為免疫原或包被源，并篩選出能夠分泌針對(duì)甲基毒死蜱的高效單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3。并利用該雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體建立了針對(duì)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品中甲基毒死蜱的免疫層析試紙條檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，其分泌的抗甲基毒死蜱的單克隆抗體，及檢測甲基毒死蜱的免疫層析試紙條。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]1.本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，已于2014年5月30號(hào)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是:中國，武漢，武漢大學(xué)；保藏編號(hào)為CCTCCN0.C2014106。
[0008]2.抗甲基毒死蜱單克隆抗體，它由保藏編號(hào)為CCTCC N0.C2014106的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3分泌產(chǎn)生。
[0009]3.上述雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，是通過以下方法篩選得到:
[0010]3.1人工抗原的合成
[0011]通過化學(xué)合成手段合成甲基毒死蜱半抗原:0-甲基-0-(3，5，6-三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯(Hl)。利用活潑酯法將具有羧基末端的半抗原偶聯(lián)到大分子蛋白質(zhì)上(BSA或者OVA)。其中Hl-BSA作為免疫原，Hl-OVA作為包被源。
[0012]3.2雜交瘤細(xì)胞株的篩選
[0013]以100 μ g每只的抗原量免疫6-8周齡健康的雌性BALB/C小鼠。每次間隔時(shí)間為2-3周，最后一次加強(qiáng)免疫后3天，無菌條件下取出小鼠脾細(xì)胞，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以5:1的細(xì)胞數(shù)量用PEG介導(dǎo)的方法融合。融合后置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞長至培養(yǎng)孔1/3-1/2時(shí)，用間接競爭ELISA法篩選出效價(jià)高、抑制率高、細(xì)胞生長旺盛的培養(yǎng)孔進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過3-5次亞克隆后，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。
[0014]3.3單克隆抗體的制備
[0015]將獲得的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3注射預(yù)先用無菌石蠟油處理過的BA1B/C小鼠，收集該小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸銨法對(duì)收集的腹水進(jìn)行純化處理得到抗甲基毒死蜱單克隆抗體。
[0016]4檢測甲基毒死蜱的免疫層析試紙條，它包括紙板，紙板的一面從上到下依次黏貼吸水墊、檢測墊、金標(biāo)墊、樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接；所述檢測墊為硝酸纖維素膜，該膜自上而下設(shè)置質(zhì)控線和檢測線；所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG ;所述檢測線包被有甲基毒死蜱-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物；所述金標(biāo)墊噴涂有納米金標(biāo)記的抗甲基毒死蜱單克隆抗體，所述的抗甲基毒死蜱單克隆抗體為由權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0017]5上述的檢測甲基毒死蝶免疫層析試紙條,吸水墊長21mm,寬4mm ;檢測墊長25mm,寬4mm ;金標(biāo)墊長5mm,寬4mm ;樣品墊長13mm,寬4mm,相鄰各墊的交疊長度為1mm。
[0018]6上述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，檢測線與硝酸纖維素膜上沿的距離為8.3mm,檢測線與質(zhì)控線間的距離為7.3mm。
[0019]7上述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，檢測墊上檢測線上所噴涂的甲基毒死蜱-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物為516ng ;質(zhì)控線上所噴涂的兔抗鼠IgG為640ng。
[0020]8上述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，金標(biāo)墊中所用的納米金粒徑為40nm ；所述金標(biāo)墊上所噴涂的金標(biāo)記的抗甲基毒死蜱單克隆抗體為96ng。
[0021]9上述試紙條的結(jié)果評(píng)估:(1)陽性:待測樣品檢測試紙條的質(zhì)控線顯示出明顯的紅色線條，檢測線不顯色；(2)陰性:待測樣品檢測試紙條的質(zhì)控線顯示出明顯的紅色線條，檢測線也顯示出明顯紅色線條；(3)臨界值:待測樣品檢測試紙條的質(zhì)控線顯示出明顯的紅色線條，檢測線出現(xiàn)對(duì)比對(duì)照試紙條檢測線顏色稍淺的紅色線條。
[0022]有益效果
[0023](I)本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的抗體穩(wěn)定性高:雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮至少保持5年，抗體的穩(wěn)定性也會(huì)比較好，純化的抗體_20°C冰箱至少可以存放2年。
[0024](2)本發(fā)明提供的單克隆抗體靈敏度高:本發(fā)明提供的抗甲基毒死蜱單克隆抗體對(duì)甲基毒死蝶的最低檢測限可達(dá)12.5ng/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測甲基毒死蜱的單克隆抗體，由保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2014106的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3產(chǎn)生。
2.產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的用于檢測甲基毒死蜱的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3，于2014年5月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2014106。
3.檢測甲基毒死蜱的免疫層析試紙條，其特征在于:它包括紙板，紙板的一面從上到下依次黏貼吸水墊、檢測墊、金標(biāo)墊、樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接；所述檢測墊為硝酸纖維素膜，該膜自上而下設(shè)置質(zhì)控線和檢測線；所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG ;所述檢測線包被有甲基毒死蜱-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物；所述金標(biāo)墊噴涂有納米金標(biāo)記的抗甲基毒死蜱單克隆抗體，所述的抗甲基毒死蜱單克隆抗體為由權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，其特征在于:所述的吸水墊長21mm,寬4mm ;檢測墊長25mm,寬4mm ;金標(biāo)墊長5mm,寬4mm ;樣品墊長13mm,寬4mm,相鄰各墊的交疊長度為1mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，其特征在于:所述檢測線與硝酸纖維素膜上沿的距離為8.3mm，檢測線與質(zhì)控線間的距離為7.3mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，其特征在于:所述檢測墊上檢測線上所噴涂的甲基毒死蜱-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物為516ng ;質(zhì)控線上所噴涂的兔抗鼠 IgG 為 640ngo
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測甲基毒死蜱免疫層析試紙條，其特征在于:所述金標(biāo)墊中所用的納米金粒徑為40nm ;所述金標(biāo)墊上所噴涂的金標(biāo)記的抗甲基毒死蜱單克隆抗體為 96ng。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104262486SQ201410497727
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】劉鳳權(quán), 王利民, 蔡佳 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院