一種β-葡萄糖苷酶及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種β-葡萄糖苷酶及其制備方法與應(yīng)用，尤其是應(yīng)用于酶法轉(zhuǎn)化制備人參皂苷20(S)-Rg3的應(yīng)用。本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶能耐受高溫，在70℃下保溫3h酶活力幾乎不變；本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶與人參皂苷Rb1孵育60min，人參皂苷Rb1幾乎完全轉(zhuǎn)化為人參皂苷20(S)-Rg3；本發(fā)明所述制備人參皂苷20(S)-Rg3的方法酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)中間產(chǎn)物少，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物人參皂苷20(S)-Rg3純度高。
【專利說明】一種p-葡萄糖苷酶及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種0 -葡萄糖苷酶及其制 備方法與應(yīng)用，尤其是應(yīng)用于酶法轉(zhuǎn)化制備人參皂苷20 (S) -Rg3的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人參（PanaxginsengC.A.Meyer)是一種多年生五爺科人參屬藥用植物，是我國 傳統(tǒng)名貴中藥材，對治療心血管疾病、糖尿病、精神類等疾病有較好的療效?，F(xiàn)代藥物學(xué)研 究已證明人參皂苷是其主要活性成分[1]，其顯著的抗腫瘤、抗炎、抗衰老活性一直以來都 是研究的熱點(diǎn)。
[0003] 至今，已分離鑒定的人參皂苷有50余種，其中人參皂苷單體化合物Rgl、Rbl、Re、 Rb2等含量較高，而人參皂苷Rd、Rg3、Rh2和CompoundK等含量低，為稀有皂苷，但其藥理 活性優(yōu)于上述高含量人參皂苷。其中，Rg3具有抗腫瘤、防治心腦血管疾病和冠心病、抑制 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、保肝、保護(hù)神經(jīng)、提高免疫力等多種藥理活性。
[0004] 然而Rg3不僅在天然人參中含量極其稀少，而且Rg3第20位的碳原子是手性碳， 有兩種旋光異構(gòu)體：20(S)-Rg3和20(R)-Rg3。兩者之間的理化及藥理性質(zhì)又具有較大的差 異，特別是20 (S) -Rg3的水溶性和生物利用度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于20 (R) -Rg3,因此選擇性的開發(fā)高效 制備20 (S)-Rg3的方法有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0005]目前，制備20 (S)-Rg3的方法主要包括化學(xué)方法、物理方法及生物轉(zhuǎn)化法三種， 其中有以20 (S)-人參原三醇為原料通過化學(xué)合成制得20 (S) -Rg3的報(bào)道，但是其反應(yīng)步 驟繁瑣且得率很低，除此之外該方法所需原料本身也較難獲得。而以人參中含量較高的 Rbl，Rb2,Rc等人參皂苷通過熱處理或酸處理等物理方法也能獲得Rg3,但是所得產(chǎn)物為 20 (S) -Rg3和20 (R) -Rg3的混合物，產(chǎn)品后期的分離耗時(shí)且成本較高。生物轉(zhuǎn)化法主要有微 生物轉(zhuǎn)化法和酶法轉(zhuǎn)化，微生物通過培養(yǎng)可以產(chǎn)生糖苷水解酶用于稀有人參皂苷的制備， 但微生物產(chǎn)的酶種類復(fù)雜，各自專一性都有差異，使得微生物轉(zhuǎn)化所得產(chǎn)物品質(zhì)難以控制， 對產(chǎn)品的純度有一定影響。酶法轉(zhuǎn)化能避免微生物轉(zhuǎn)化法的缺陷，通過專一性的降解獲得 單一的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。但是目前還沒有用于生產(chǎn)人參皂苷20 (S) -Rg3的糖苷水解酶被報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1 所示。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的0-葡萄糖苷酶，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供本發(fā)明所述的0 -葡萄糖苷酶的制備方法，為獲得 本發(fā)明所述的0 -葡萄糖苷酶的DNA分子，將該DNA分子插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化即得。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶的制備方法，具體包括如下步 驟：
[0010]1)、以提取的ThermotogapetrophilaDSM13995 基因組DNA為模板，用具有SEQ IDN0:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDN0:4所示的核苷酸序列的下游引物 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的0 -葡萄糖苷酶的DNA分子；
[0011] 2)、將得到的本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶的基因和pET-20b分別用NdeI和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接得到含有本發(fā)明所述的0 -葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì)粒；
[0012]3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌JM109(DE3)，IPTG誘導(dǎo)本發(fā)明所述 的@ -葡萄糖苷酶表達(dá)，離心收集菌體，破碎菌體后經(jīng)Ni親和層析柱純化即得。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明所述的P_葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì)粒。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述的重組質(zhì)粒其核苷酸序列如SEQIDN0. 5所示。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供本發(fā)明所述葡萄糖苷酶在制備人參皂苷 20(S)-Rg3中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備人參阜苷20(S)_Rg3的方法，本發(fā)明所 述葡萄糖苷酶在下pH5.0,90°C條件下專一性酶解人參皂苷Rbl制備得到人參皂苷 20 (S)-Rg3〇
[0017] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述制備人參皂苷20(S)_Rg3的方法中，所述酶解時(shí) 間 > 5min。
[0018] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述制備人參皂苷20(S)_Rg3的方法中，所述酶 解時(shí)間> 60min。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果之一：
[0020] (1)本發(fā)明所述0 -葡萄糖苷酶能耐受高溫，在70°C下保溫3h酶活力幾乎不變；
[0021] (2)本發(fā)明所述葡萄糖苷酶對人參皂苷Rbl的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，本發(fā)明所述葡 萄糖苷酶與人參皂苷Rbl孵育60min，人參皂苷Rbl幾乎完全轉(zhuǎn)化為人參皂苷20 (S) -Rg3 ;
[0022] (3)本發(fā)明所述制備人參皂苷20⑶-Rg3的方法酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)中間產(chǎn)物少，轉(zhuǎn)化 后產(chǎn)物人參皂苷20 (S) -Rg3純度高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0024] 圖1示本發(fā)明所述P_葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl生成人參皂苷20 (S)_Rg3的 水解線路圖；
[0025] 圖2示實(shí)施例2純化的葡萄糖苷酶的純度鑒定結(jié)果圖；其中泳道M為蛋白 Marker(購自Thermoscientific公司，貨號(hào)2661)，泳道1為純化的葡萄糖苷蛋白，泳 道2為誘導(dǎo)表達(dá)后全細(xì)胞裂解液，泳道3為PET-20b轉(zhuǎn)化宿主菌空白對照的全細(xì)胞裂解液；
[0026] 圖3示實(shí)施例3本發(fā)明所述述0_葡萄糖苷酶的定性測定結(jié)果圖，其中圖a為最適 反應(yīng)溫度的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為溫度，單位攝氏度（°C)，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％; 圖b為最適反應(yīng)pH的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為pH,縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％ ;圖c為溫 度穩(wěn)定性的測定結(jié)果圖,其中一?一為在90°C下保溫不同時(shí)間的相對酶活結(jié)果圖，--為在 80°C下保溫不同時(shí)間的相對酶活結(jié)果圖，+為在70°C下保溫不同時(shí)間的相對酶活結(jié)果 圖，橫坐標(biāo)為保溫時(shí)間，單位小時(shí)（hour)，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％ ;圖d為pH穩(wěn)定性 的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為PH，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％。

【具體實(shí)施方式】 [0027]
[0028] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 本發(fā)明提供了一種葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，命名為 TPEBGL3。
[0030] 本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述0-葡萄糖苷酶的DNA分子。由于密碼子的簡并 性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼所述的P-葡萄糖苷酶TPEBGL3的DNA 分子，其核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0032] 為了制備本發(fā)明所述蝎活性多肽，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶 的制備方法
[0033] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶的制備方法，為獲得本發(fā)明所 述的3-葡萄糖苷酶的DNA分子，將該DNA分子插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化表達(dá)宿主菌，誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化即得。
[0034]目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA分子的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶 切具有編碼所述葡萄糖苷酶DNA分子的載體或以具有編碼所述葡萄糖苷酶DNA分 子的cDNA為模板PCR擴(kuò)增。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以提取的ThermotogapetrophilaDSM13995基 因組DNA為模板PCR擴(kuò)增獲取具有編碼本發(fā)明所述的0-葡萄糖苷酶的DNA分子。
[0036] 本發(fā)明所述0-葡萄糖苷酶的制備方法在獲得具有編碼本發(fā)明所述的0-葡萄糖 苷酶的DNA分子后，將其插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒。具體操作為所得DNA分子通過凝膠 電泳回收，然后將所得DNA分子和表達(dá)載體分別雙酶切后連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性 克隆，提取重組質(zhì)粒。
[0037] 其中，本發(fā)明所述表達(dá)載體包括pGEX系列、pET系列、pQE系列和pMAL系列。在一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體為PET系列中的pET-20b。
[0038] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，包括DH5a菌株、T0P10菌 株、JM109系列菌株和BL21系列菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，感受態(tài)細(xì)胞為JM109感受 態(tài)細(xì)胞。
[0039] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述0-葡萄糖苷酶的制備方法還包括對篩選的陽性克隆進(jìn)行序 列鑒定的步驟。
[0040] 本發(fā)明同時(shí)還提供了一種包含本發(fā)明所述的0-葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì) 粒。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，所述的重組質(zhì)粒為PET-TPEBGL3,其核苷酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0042]本發(fā)明所述3 _葡萄糖苷酶的制備方法在獲得重組質(zhì)粒后將其轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌， 誘導(dǎo)表達(dá)分離純化即得。
[0043] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌為大腸桿菌表達(dá)菌株，包括Rosetta系列和BL21、 JM109系列菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為JM109(DE3)菌株。
[0044] 本發(fā)明所述0 -葡萄糖苷酶的制備方法所述誘導(dǎo)表達(dá)分離純化具體為IPTG誘導(dǎo) 培養(yǎng)含重組質(zhì)粒的表達(dá)宿主菌，收集菌體超聲波破碎，取上清親和層析得到融合蛋白。
[0045] 其中，所述親和層析的層析介質(zhì)為根據(jù)表達(dá)載體的選擇性標(biāo)簽選擇的與之相匹配 的層析介質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體為pET-20b，采用Ni親和層析柱純化。
[0046] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶的制備方法，具體包括如 下步驟：
[0047]1)、以提取的ThermotogapetrophilaDSM13995 基因組DNA為模板，用具有SEQ IDN0. 3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDN0. 4所示的核苷酸序列的下游引物 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明所述的0 -葡萄糖苷酶的DNA分子；
[0048]2)、將得到的本發(fā)明所述的0 -葡萄糖苷酶的基因和pET_20b分別用NdeI和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接得到含有本發(fā)明所述的0 -葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì)粒；
[0049] 3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌JM109(DE3)，IPTG誘導(dǎo)本發(fā)明所述 的@ -葡萄糖苷酶表達(dá)，離心收集菌體，破碎菌體后經(jīng)Ni親和層析柱純化即得。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明分別在不同條件下測定制備得到的葡萄糖苷酶 TPEBGL3的酶活以對制備得到的0 -葡萄糖苷酶TPEBGL3的性質(zhì)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示本發(fā) 明所述葡萄糖苷酶TPEBGL3最適pH為5.0,最適反應(yīng)溫度為90°C。本發(fā)明所述葡 萄糖苷酶TPEBGL3在pH5. 0-7. 0條件下70°C保溫lh后仍能具有80% - 96%的殘余酶活 力，在70°C下保溫3h酶活力幾乎不變，在90°C保溫3h仍具有50%以上的殘余酶活力。
[0051] 本發(fā)明還提供了一種制備人參皂苷20(S)-Rg3的方法，具體為本發(fā)明所述葡 萄糖苷酶在下pH5. 0，90°C條件下專一性酶解人參皂苷Rb1制備得到人參皂苷20 (S) -Rg3。
[0052] 其中，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述制備人參皂苷20 (S)_Rg3的方法中，所述酶 解時(shí)間彡5min。
[0053] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述制備人參皂苷20(S)_Rg3的方法中，所述酶 解時(shí)間> 60min。
[0054] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述制備人參皂苷20 (S) -Rg3的方法中，本發(fā)明所述0 -葡萄糖 苷酶的添加量為〇. 009iig/iiL。
[0055] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述葡萄糖苷酶可以專一性酶解人參皂苷Rbl制備得到人 參皂苷20 (S) -Rg3。在反應(yīng)5min后即有人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為人參皂苷20 (S) -Rg3,且隨著 反應(yīng)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化率提高。在反應(yīng)60min后，人參皂苷Rbl幾乎完全轉(zhuǎn)化為人參皂苷 2〇6)-1^3，人參皂苷2〇(5)-1^3得率約為96%。因此本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述0-葡萄 糖苷酶在制備人參皂苷20 (S) -Rg3中的應(yīng)用。
[0056] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，其中，如無特殊 說明，實(shí)施例中涉及的各種反應(yīng)試劑均可以通過商業(yè)渠道購買得到；如無特殊說明，實(shí)施例 中涉及的具體操作參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》。
[0057] 實(shí)施例1:本發(fā)明所述0 -葡萄糖苷酶基因的獲得及重組質(zhì)粒PET-TPEBGL3的構(gòu) 建
[0058] 1.IThermotogapetrophilaDSM13995 的培養(yǎng)
[0059]ThermotogapetrophilaDSM13995 購于DSMZ菌種保藏中心（www.dsmz.de)編 號(hào)為13995,其培養(yǎng)基配方為：10g/L淀粉、5g/L胰蛋白胨、3g/L酵母提取物、5g/L肉浸液、 10g/L2-馬啉乙磺酸、10mg/L七水合硫酸鐵、lmg/L刃天青，調(diào)整pH為7. 2。用注射器按 照〇. 5 %接種量接種，85°C靜止培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。
[0060] 1. 2基因組DNA的提取
[0061] (1)靜置培養(yǎng)ThermotogapetrophilaDSM13995 約 24 小時(shí)，取 30mL菌液 4, 000g 離心10min收集細(xì)胞。
[0062] (2)用9.51^了￡緩沖液重懸菌體，加入0.511^10%十二烷基硫酸鈉（505)和 50UL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均勻，37 °C保溫lh。
[0063] (3)加入 1.8mL5mol/LNaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化銨（CTAB)/NaCl，混勻， 65°C溫育 20min。
[0064] (4)加入等體積氯仿/異戊醇，混勻，6, 000g離心10min。
[0065] (5)為防止剪切力造成基因組DNA斷裂，用粗口吸管將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，力口 入等體積酚/氯仿/異戊醇混勻，6, 000g離心10min。
[0066] (6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動(dòng)至白色絲狀DNA沉淀清晰可 見。
[0067] (7)用吸管將DNA纏繞其上，在70%酒精中清洗。
[0068] (8)用無菌牙簽將DNA從吸管上刮下，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中。
[0069] (9)室溫下風(fēng)干，加500iiLTE緩沖液溶解。
[0070] (10)取50iiL用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。
[0071] 1. 3重組質(zhì)粒pET-BGL的構(gòu)建
[0072] 按照已知的ThermotogapetrophilaDSM13995耐高糖0 -葡萄糖苷酶基因（登 錄號(hào)：YP_001244492. 1)設(shè)計(jì)引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種0 -葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的P _葡萄糖苷酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種權(quán)利要求1所述P -葡萄糖苷酶的制備方法，為獲得權(quán)利要求1所述的P -葡 萄糖苷酶的DNA分子，將該DNA分子插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主 菌誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化即得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，具體包括如下步驟： 1) 、以提取的 Thermotoga petrophila DSM 13995 基因組 DNA 為模板，用具有 SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò) 增，PCR擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的0 -葡萄糖苷酶的DNA分子； 2) 、將得到的權(quán)利要求1所述的P -葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用Nde I和 Xho I進(jìn)行雙酶切，連接得到含有權(quán)利要求1所述的0 -葡萄糖苷酶的基因的重組質(zhì)粒； 3) 、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌JM109 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)權(quán)利要求1所述 的@ -葡萄糖苷酶表達(dá)，離心收集菌體，破碎菌體后經(jīng)Ni親和層析柱純化即得。
5. 包含權(quán)利要求1所述的P -葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
7. 權(quán)利要求1所述P -葡萄糖苷酶在制備人參皂苷20 (S)-Rg3中的應(yīng)用。
8. -種制備人參皂苷20 (S) -Rg3的方法，權(quán)利要求1所述0 -葡萄糖苷酶在pH 5. 0， 90°C條件下專一性酶解人參皂苷Rb 1制備得到人參皂苷20 (S)-Rg3。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述酶解時(shí)間> 5min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶解時(shí)間> 60min。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104328098SQ201410510836
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】趙林果, 蕭偉, 裴建軍, 丁崗, 解靜聰, 王振中 申請人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司, 南京林業(yè)大學(xué)