一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的植物內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從天南星科(Araceae)年復(fù)鳳? PinelIiaTenore)植物植株中分離篩選出一株高產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的內(nèi)生真菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]0-葡萄糖苷酶(01111(:0&(1&%403.2.1.21)，又稱β _D_葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基，它也是纖維素酶復(fù)合酶系發(fā)揮協(xié)同作用的關(guān)鍵酶。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)，后來的研宄發(fā)現(xiàn)，β -葡萄糖苷酶存在于自然界中許多植物、昆蟲、酵母、曲霉、木霉和細(xì)菌體內(nèi)。它參與生物體的糖酵解，對維持生物體正常生理功能起著重要的作用。
[0003]葡萄糖苷酶是纖維素酶的一個重要組成部分，在醫(yī)療、食品、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中有重要的應(yīng)用價值，它將果、蔬、茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)。近年來國內(nèi)對葡萄糖苷酶的研宄已經(jīng)成為熱點(diǎn)，已由過去的研宄從大豆、蠶豆、茶葉、香菇、微生物等材料中簡單提取葡萄糖苷酶到現(xiàn)在微生物的培養(yǎng)條件優(yōu)化、酶基因的克隆以及粗酶液的純化。葡萄糖苷酶基因的克隆表達(dá)已經(jīng)得到實(shí)現(xiàn)，新構(gòu)建的工程菌已經(jīng)應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，國內(nèi)已有利用葡萄糖苷酶工程菌制備葡萄糖苷酶的報道，但工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本過高嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。所以篩選、鑒定、培養(yǎng)高產(chǎn)葡萄糖苷酶微生物，并從培養(yǎng)基或微生物中提取葡萄糖苷酶依然是目前解決葡萄糖苷酶來源的主要途徑。
[0004]梔子藍(lán)色素是以梔子苷為原料，采用生物技術(shù)制得的一種安全無毒的食用天然色素，我國于1999年在制定新增食品添加劑的使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時已將其列入其中。目前，梔子藍(lán)色素的制備主要有微生物發(fā)酵法和β -葡萄糖苷酶水解轉(zhuǎn)化法。專利CN101016421A和專利CN102559796A分別用黑曲霉和酵母菌發(fā)酵制備梔子藍(lán)，但這兩種微生物對梔子苷的生物轉(zhuǎn)化率較低，使得制備的梔子藍(lán)色素色價不高。專利CN102021202A、CN102732050A、CN201310504179.X采用市售的纖維素酶、果膠酶和β -葡萄糖苷酶，其水解專一性較差或活力較低，使梔子苷轉(zhuǎn)化率和所產(chǎn)梔子藍(lán)色素色價都較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1、菌種篩選:
取新鮮天南星科(Araceae)年夏麗? PinelIia Tfeflore)植物植株，用無菌水沖洗干凈，切成0.5cmX0.5cm的小塊，經(jīng)過紫外消毒，75%乙醇消毒lmin，2.5%次氯酸鈉消毒lOmin，再用75%乙醇消毒lmin，無菌水沖洗2?3次，接入已倒好的PDA固體平板培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿置于28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3?7天。待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用菌絲頂端純化法逐步純化得到3株植物內(nèi)生真菌分別命名為ZZG-1、ZZG-2、ZZGUf他們分別添加到含β-葡萄糖苷酶水解底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中:β-葡萄糖苷酶水解底物為梔子苷、水楊苷、大豆異黃酮中的一種，含量為1%-10% ;氮源為NaN03、KN03、NH4N03，濃度為 0.1%-1% ;緩沖鹽為 K2HP04、KH2P04、Na2HP04、NaH2P04，濃度為 0.5%-2% ；PH為6-9 ;搖床轉(zhuǎn)速為100-200rpm/min，培養(yǎng)10-100小時后，測定底物轉(zhuǎn)化率ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3中底物梔子苷轉(zhuǎn)化率分別為96.7%,47.8%,35.6%，選擇底物轉(zhuǎn)化率最高的菌種ZZG-1作為菌種鑒定的對象。
[0006]2、菌種鑒定
將菌種用PDA固體培養(yǎng)基活化后，從培養(yǎng)基上挑取菌絲至顯微鏡下觀察:菌株氣生菌絲較發(fā)達(dá)，菌叢具條紋，密厚；小孢子產(chǎn)生早而多，大孢子產(chǎn)生于多分枝的分生孢子梗上白色，后期培養(yǎng)皿反面變?yōu)樗{(lán)綠色。
[0007]該菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基中活化后，再轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基中，離心后取菌絲，參照真菌提取試劑盒附帶提取方法操作提取菌種基因組DNA，配制好PCR擴(kuò)增體系，然后在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，完成后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍攝結(jié)果。將得到的菌株ITS序列用GenBanK中的Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的其它菌株進(jìn)行分析，結(jié)果其與腐皮鐮孢菌iFusarium solani (Mart.))屬菌種相似性達(dá)100%，故判斷其為腐皮鐮孢菌iFusariumsolani (Mart.))。本菌株已于2014年9月I日起，保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC N0.9580。
[0008]3、菌種培養(yǎng)
從保藏培養(yǎng)基(PDA)中挑取腐皮鐮孢菌QFusarium solani (Mart.))菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余為水，自然pH值)中，于25_35°C培養(yǎng)72-120h，挑取PDA固體培養(yǎng)基中的菌絲接種與PDA液體培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基中加瓊脂20g/L)中活化培養(yǎng)48-72h，按體積比3-10%接種量，轉(zhuǎn)接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(50%梔子苷20g/L，NaN033g/L，KH2P0440g/L 其余為水，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.5)，25_35°C下，培養(yǎng) 72-120h0
[0009]4、酶學(xué)特性
產(chǎn)酶培養(yǎng)基離心去除菌絲后，測得培養(yǎng)液β -葡萄糖苷酶酶活達(dá)77.83±0.42 U/mL，鹽析收集沉淀、透析除鹽后用聚乙二醇-6000包埋濃縮備用。
[0010]對該酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性、最適pH及PH穩(wěn)定性、反應(yīng)時間對酶活性的影響、金屬離子和有機(jī)溶劑對酶活性的影響進(jìn)行檢測:該酶最適反應(yīng)溫度在45-50°C之間，最適pH在7-8之間；在溫度5-40°C，pH為6_9條件下，酶可以保持較高活力，最適反應(yīng)時間為40min，金屬離子和有機(jī)溶劑都對酶活性影響都很大。
【附圖說明】
[0011]附圖1梔子藍(lán)色素掃描光譜。
[0012]附圖2腐皮鐮孢菌系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0013]附圖3酶學(xué)特性。
[0014]附圖4發(fā)酵前后培養(yǎng)基中梔子苷的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)例I菌種篩選
取新鮮盾葉半夏植株，用無菌水沖洗干凈，切成0.5cmX 0.5cm的小塊，經(jīng)過紫外消毒，75%乙醇消毒lmin，2.5%次氯酸鈉消毒lOmin，再用75%乙醇消毒lmin，無菌水沖洗2?3次，接入已倒好的PDA固體平板培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿置于28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3?7天。待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用菌絲頂端純化法逐步純化得到3株植物內(nèi)生真菌分別命名為ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3，將他們分別添加到梔子苷粗提物培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中:梔子苷含量為2%、氮源為NaNO3、濃度為0.3%、緩沖鹽為Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04、濃度為0.5% ;pH為7.5 ;搖床轉(zhuǎn)速為150rpm/min，培養(yǎng)100小時后，檢測其最大吸收波長為594nm(其掃描光譜見附圖1)，在594nm波長下檢測各組培養(yǎng)液吸光值，選擇吸光值最大培養(yǎng)液中添加的菌種ZZGl作為菌種鑒定的對象。
[0016]實(shí)例2菌種鑒定
將菌種用PDA固體培養(yǎng)基活化后，從培養(yǎng)基上挑取菌絲至顯微鏡下觀察:菌株氣生菌絲較發(fā)達(dá)，菌叢具條紋，密厚；小孢子產(chǎn)生早而多，大孢子產(chǎn)生于多分枝的分生孢子梗上白色，后期培養(yǎng)皿反面變?yōu)樗{(lán)綠色。
[0017]該菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基中活化后，再轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基中，離心后取菌絲，參照真菌提取試劑盒附帶提取方法操作提取菌種基因組DNA，配制好PCR擴(kuò)增體系，然后在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，完成后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍攝結(jié)果。測得片段長度為554bp (見核苷酸序列附加文件)將該序列提交Gene Bank進(jìn)行Blast同源序列分析，親緣關(guān)系相近的序列大部分為腐皮鐮孢菌solani(Mart.))屬的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖2)，該菌種與它們都具有100%的同源性，該菌種為腐皮鐮孢菌 iFusarium solani (Mart.))。
[0018]實(shí)例3產(chǎn)酶菌種培養(yǎng)
從保藏培養(yǎng)基(PDA)中挑取腐皮鐮孢菌solani (Mart.))菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余為水，自然pH值)中，于28°C培養(yǎng)72h，挑取PDA固體培養(yǎng)基中的菌絲接種與PDA液體培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基中加瓊脂20g/L)中活化培養(yǎng)72h，按體積比3%接種量，轉(zhuǎn)接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(50%梔子苷20g/L，NaN033g/L，KH2PO4 40g/L其余為水，用NaOH調(diào)pH至7.5)，32°C下，培養(yǎng)120 h。在試管中取0.1 m L培養(yǎng)液，加入0.9 mLpH 6.2的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液，于45 V水浴預(yù)熱1min ;加入已預(yù)熱10 min的ImL 5mmol/L梔子苷溶液，反應(yīng)1min后立即用沸水浴終止反應(yīng)，冷水沖淋后，室溫放置5min，HPLC測定發(fā)酵液中梔子苷含量，同時檢測發(fā)酵液中葡萄糖苷酶酶活力達(dá)77.83±0.42 U/mL。
[0019]實(shí)例4酶學(xué)特性
1、酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性
在 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C和 70°C 的不同溫度下，測定酶活力，確定溫度對酶活力的影響；在4°C和上述各溫度下各保溫1h后，在最適反應(yīng)溫度下測酶活，確定酶的熱穩(wěn)定性。該酶的最適反應(yīng)溫度在45-50°C之間，當(dāng)溫度超過60°C時