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      與黃瓜果實苦味性狀相關的snp標記及其應用的制作方法

      文檔序號:489881閱讀:397來源:國知局
      與黃瓜果實苦味性狀相關的snp標記及其應用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記及其應用,其位于編碼黃瓜轉錄因子Csa5G157230基因(Bt基因)起始密碼子上游第1601bp處(SNP-1601)。此處堿基為G的黃瓜果實苦味表型不穩(wěn)定,易受到外界環(huán)境的影響,在逆境條件(如低溫、干旱等)下,黃瓜果實易變苦;此處堿基為A的黃瓜則不苦。本發(fā)明以控制果實苦味合成的轉錄因子Bt基因為線索,通過遺傳群體分析篩選到與黃瓜果實苦味性狀緊密相關的SNP標記,并借助黃瓜無苦味天然突變體闡釋了SNP-1601與Bt基因、Bi基因、逆境脅迫及果實苦味性狀之間的關系。本發(fā)明進一步揭示了黃瓜果實苦味形成的分子機制,為無苦味黃瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標,利用SNP-1601可加快無苦味黃瓜的育種進程。
      【專利說明】與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記及其應用

      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學領域,具體地說,涉及一種與黃瓜果實苦味性 狀相關的SNP標記及其應用。

      【背景技術】
      [0002] 黃瓜的苦味是由一類稱為葫蘆素C的H聰化合物導致的。黃瓜果實中積累葫蘆素 C會嚴重影響黃瓜的品質。早期的經(jīng)典遺傳試驗發(fā)現(xiàn)黃瓜的苦味有Bi和化兩個基因控制。 Bi基因主要控制葉片苦味,化基因主要控制黃瓜果實苦味。其中隱性M基因對化基因具 有上位效應。通過大規(guī)模重測序W及遺傳分析我們先后克隆了 Bi和化基因,它們分別編 碼氧化角蠻帰環(huán)化酶及bHLH類轉錄因子。Bi基因是苦味合成的關鍵限速酶,在葉片或黃瓜 中參與苦味的合成。化基因在黃瓜果實中特異表達,通過調控Bi基因的表達,控制黃瓜果 實苦味性狀。通過掲示黃瓜苦味合成、調控及馴化的分子遺傳機理,為利用分子標記輔助無 苦味黃瓜育種打下堅實的基礎。


      【發(fā)明內容】

      [0003] 本發(fā)明的目的是提供一種與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記及其應用。
      [0004] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明的一種與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記,其位 于編碼黃瓜轉錄因子Csa5G157230基因起始密碼子上游第16(Ubp處,此處堿基為G的黃瓜 果實表型不穩(wěn)定,易受到外界環(huán)境的影響,在逆境條件下黃瓜果實易變苦,此處堿基為A的 黃瓜則不苦。其中,所述逆境條件包括但不限于低溫、干旱等逆境條件。
      [0005] 本發(fā)明中涉及的黃瓜轉錄因子Csa5G157230的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。 已在CN 103739685A中公開。
      [0006] 本發(fā)明還提供用于檢測所述與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記的引物對,包括 正向引物巧' -TGGTAGGTGTAGCTTAATCATTCTCCTTTG-3' 和反向引物貼' -AAGTTGGTGAAGTAATA GTGTCCAACC-3'。
      [0007] 本發(fā)明還提供所述與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記在鑒定苦味黃瓜品種中 的應用。包括W下步驟:
      [000引 1)提取待測黃瓜的基因組DNA ;
      [000引 2) W待測黃瓜的基因組DNA為模板,利用權利要求2所述引物F和R,進行PCR擴 增反應;
      [0010] 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物。
      [0011] 其中,步驟。中PCR反應使用的擴增體系W 20y 1計為;10-20ng/y 1模板DNA Iy l,10pmol/y 1 引物F和 R各 Iy l,10mmol/L dNTP mix 0. 4y 1,0. 5U/UL Taq DNA聚合 酶0.3 y 1,IOXPCR反應緩沖液2 y 1,余量為水。
      [001引 PCR反應條件為;94 °C 5分鐘;94 °C 20砂,58 °C 20砂,72 °C 30砂,35個循環(huán); 72 C 10分鐘。
      [0013] 本發(fā)明進一步提供所述與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記在黃瓜分子標記輔 助育種中的應用,即根據(jù)基因型進行苦味或不苦黃瓜品種的選育,從而加快無苦味黃瓜的 育種進程。
      [0014] 本發(fā)明首先對115份黃瓜核也種質材料進行重測序分析,并對該115份材料進行 果實苦味表型鑒定。結果發(fā)現(xiàn)一個與黃瓜果實苦味性狀關聯(lián)的SNP位點,位于編碼黃瓜轉 錄因子Csa5G157230基因炬t基因)起始密碼子上游第16(Ubp處(SNP-1601)。115份材 料中,有9份不能合成苦味的M材料,因此果實必然是不苦表型。在剩余106份可W合成 苦味的Bi材料中,有69份在SNP-1601處為G,22份為A,剩余15份材料在該位點為雜合 或是不明確。其中,22份在SNP-1601為A的材料在兩年的田間實驗中均未不苦;而69份 在SNP-1601為G的材料中,大部分的材料(42份)在兩年的田間實驗中出現(xiàn)表型不一致情 況,即不苦和苦的表型都出現(xiàn)過,說明其苦味表型易受外界環(huán)境影響,表型不穩(wěn)定。隨機選 取不同基因型材料的果實進行基因表達分析及苦味含量檢測,發(fā)現(xiàn)在SNP-1601處為A的不 苦黃瓜材料中Bi和化基因表達非常低,而在在SNP-1601處為G的黃瓜果實中Bi和化基 因表達相對較高(圖1)。因此,SNP-1601有可能通過調節(jié)黃瓜果實中的化基因表達,來控 制其Bi基因的表達及苦味的含量。
      [0015] 此外,還發(fā)現(xiàn)了對逆境脅迫不響應的天然突變體han,可W用來進一步解析 SNP-1601與化基因、Bi基因、逆境脅迫及果實苦味表型之間的關系。在正常生長環(huán)境中, 野生型HAN及其突變體ban均為果實不苦的黃瓜,但在逆境條件下,如低溫、干旱等,HAN的 果實變苦,而ban的果實則仍為不苦。通過對該兩種黃瓜進行重測序分析,發(fā)現(xiàn)ban中的突 變就位于SNP-1601,即HAN在SNP-1601中為G;han在SNP-1601中為A。然后構建了一個 由223個單株組成的巧群體,通過鑒定該些單株的基因型和果實表型數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)SNP-1601 與果實苦味表型共分離(圖2)。通過檢測正常環(huán)境下和逆境環(huán)境下,HAN和ban的果實中 Bi和化基因的表達量及苦味含量,發(fā)現(xiàn)逆境脅迫使HAN的果實中化基因的表達升高,從而 導致Bi基因表達也升高,最終使果實中苦味含量升高,黃瓜變苦;突變后該種逆境脅迫則 不能誘導Bi和化基因的表達(圖3)。因此SNP-1601對于栽培黃瓜響應逆境脅迫是不可 或缺的關鍵因素之一。
      [0016] 本發(fā)明可用于大規(guī)模篩選育種材料,大大加快黃瓜的育種進程;也可W用于通過 基因工程改良技術提高黃瓜的品質性狀。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0017] 圖1為本發(fā)明實施例2中用qPCR和HPLC分別檢測不同黃瓜核也種質材料果實中 Bt (A)、Bi基因做的表達情況及苦味物質的含量似。
      [0018] 圖2為本發(fā)明實施例3中223個巧遺傳群體進一步確認SNP-1601與果實苦味表 型共分離。
      [0019] 圖3為本發(fā)明實施例3中用qPCR和HPLC分別檢測HAN及其天然突變體han在正 常和低溫脅迫下,果實中化(A)、Bi基因炬)的表達情況及苦味物質的含量(C)。

      【具體實施方式】
      [0020] W下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明, 實施例均按照常規(guī)實驗條件,如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a 1油oratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
      [0021] 實施例1挖掘與黃瓜果實苦味性狀關聯(lián)的SNP
      [0022] 從世界各地收集了 3000多份黃瓜資源,從其中挑選115份作為黃瓜核也種質資 源,它們代表了 80%的遺傳多樣性。對每份資源進行重測序,產(chǎn)生5G左右的數(shù)據(jù)量,平均覆 蓋10倍黃瓜基因組。同時還對該115份種質資源進行了果實苦味表型鑒定。通過比較不 同材料的化基因,發(fā)現(xiàn)了在其編碼黃瓜轉錄因子Csa5G157230基因炬t基因)起始密碼子 上游第16(Ubp處(SNP-1601)。此處堿基為G的黃瓜果實表型不穩(wěn)定,易受到外界環(huán)境的影 響,在逆境條件下,如低溫、干旱等,黃瓜果實易變苦,此處堿基為A的黃瓜則不苦(表1)。
      [0023] 表1黃瓜核也種質資源中SNP-1601與果實苦味性狀的關系

      【權利要求】
      1. 與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記,其特征在于,其位于編碼黃瓜轉錄因子 Csa5G157230基因起始密碼子上游第1601bp處,此處堿基為G的黃瓜果實表型不穩(wěn)定,易受 到外界環(huán)境的影響,在逆境條件下黃瓜果實易變苦,此處堿基為A的黃瓜則不苦; 其中,所述逆境條件包括但不限于低溫、干旱。
      2. 用于檢測權利要求1所述與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記的引物對,其特征在 于,包括正向引物 F5' -TGGTAGGTGTAGCTTAATCAITCTCCTTTG-3' 和反向引物 R5' -AAGITGGTGA AGTAATAGTGTCCAACC-3'。
      3. 權利要求1所述與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記在鑒定苦味黃瓜品種中的應 用。
      4. 根據(jù)權利要求3所述的應用,其特征在于,包括以下步驟: 1) 提取待測黃瓜的基因組DNA ; 2) 以待測黃瓜的基因組DNA為模板,利用權利要求2所述引物F和R,進行PCR擴增反 應; 3) 檢測PCR擴增產(chǎn)物; 其中,步驟2)中PCR反應使用的擴增體系以20iil計為:10-20ng/iil模板DNAliil, 10pmol/iil 引物F和 R各 liil,10mmol/L dNTP mix0.4iil,0.5U/iiL Taq DNA 聚合酶 0. 3 ill,10 X PCR反應緩沖液2 ill,余量為水; PCR反應條件為:94°C 5分鐘;94°C 20秒,58°C 20秒,72°C 30秒,35個循環(huán);72°C 10分 鐘。
      5. 權利要求1所述與黃瓜果實苦味性狀相關的SNP標記在黃瓜分子標記輔助育種中的 應用。
      【文檔編號】C12Q1/68GK104357441SQ201410529172
      【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權日:2014年10月10日
      【發(fā)明者】黃三文, 尚軼, 陳慧明, 馬永碩, 周倩, 張忠華 申請人:中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所
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