專利名稱：黃瓜中基因地鏈接煙草花葉病毒抗性的標(biāo)記及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記，其基因地鏈接黃瓜植株(Cucumis sativus L.)基因組 中的基因位點(diǎn)，且能鑒別基因位點(diǎn)，該基因組授予對(duì)煙草花葉病毒的通?？剐?，特別是對(duì)兩 個(gè)在商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒有抗性，即，黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果 實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)。本發(fā)明還涉及用于向黃瓜植株(Cucumis sativus L.)、植株部位和果實(shí)提供對(duì)煙 草花葉病毒的抗性，特別是對(duì)兩個(gè)商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒，即，黃瓜綠斑駁花葉病 毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜植株(即，植株學(xué)品種Cucumis sativus的植株)屬于葫蘆科的葫蘆屬家族， 也包括了像甜瓜和南瓜這樣的家族成員。該植株的可食用果實(shí)通常被稱為黃瓜。黃瓜通常是圓柱形、綠色皮的果實(shí)，包括大 約96%的水。已被種植很久的黃瓜植株Cucumis sativus L.是一種世界范圍內(nèi)的重要的 園藝作物。黃瓜一般在未成熟的時(shí)期收獲，且被用在腌菜行業(yè)或新鮮市場(chǎng)中。感染葫蘆科的煙草花葉病毒可分為兩個(gè)亞組亞組I包括在文獻(xiàn)里表示為黃 瓜綠斑駁花葉病毒的株系和隔離群(CGMMV，包括株系CV3，CV4，CGMMV-ff, CGMMV-SH和 CGMMVV-Is)，亞組II包括黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)，Kyuri綠斑駁花葉病毒(KGMMV)， 以及與KGMMV密切相關(guān)并可能被認(rèn)為是它的一個(gè)株系(Antigus，2001年)的CGMMV的Yodo 株系。黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)是一種造成葫蘆科嚴(yán)重疾病的煙草花葉病毒屬的 RNA病毒。CGMMV株系最先由英國(guó)和歐洲報(bào)道(Ainsworth，1935年)。該病毒出現(xiàn)在所有組 織中(Hollings，1975年)，并且該病毒迅速在工人手中、服裝、刀和其他設(shè)備上傳播，且是 種傳的。種子的熱處理一般用來(lái)控制種子的病毒污染(Kim，2003年)。CGMMV還可以通過(guò) 地表水傳播(Drost，1988)。變黃、長(zhǎng)斑、葉片向下卷曲的癥狀已被報(bào)導(dǎo)，但也許最有意義的是中重度的果實(shí)長(zhǎng) 斑和變形的報(bào)道。果實(shí)的這種長(zhǎng)斑和變形能夠迅速使受感染的作物滯銷。黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)也許是感染黃瓜作物的最廣泛和最有名的煙草花 葉病毒。在如荷蘭、西班牙(Celix，1996年)、希臘(Varveri，2002年)和印度(Rashmi, 2005年)的黃瓜生產(chǎn)區(qū)域，CGMMV是一個(gè)全球性的問(wèn)題。產(chǎn)量損失可能為15% (Fletcher, 1962年)。已做了尋找對(duì)CGMMV在黃瓜中的抗性的嘗試(Hsiao，1993年)，并且已發(fā)現(xiàn)一些 來(lái)源亞洲的無(wú)癥狀品種(Kooistra，1968年)。CFMMV是造成黃瓜植株(Cucumis sativus L)重大經(jīng)濟(jì)損失的煙草花葉病毒的另 一個(gè)家族成員。黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)感染通常在一個(gè)相對(duì)在前的生長(zhǎng)階段里， 首先在果實(shí)和頂部葉子上被識(shí)別出。葉子癥狀包括嚴(yán)重的花葉病、脈結(jié)病和黃色斑紋。在某些例子中，充分生長(zhǎng)的植株顯示導(dǎo)致植株倒塌的嚴(yán)重萎蔫癥狀。在溫室里的快速的病毒 傳播可能導(dǎo)致嚴(yán)重的作物損失?？紤]到在黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中由煙草花葉病毒造成的經(jīng)濟(jì)損害，特 別是CGMMV和CFMMV，包括它們的變種，高度期望的是，提供基因地鏈接至煙草花葉病毒的 基因抗性位點(diǎn)，或質(zhì)量性狀位點(diǎn)(QTLs)，并能夠鑒別的基因標(biāo)記，并且把這種煙草花葉病毒 抗性轉(zhuǎn)移到經(jīng)濟(jì)上重要的Cucumis sativus L.品種。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的之一是提供這樣的基因標(biāo)記。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于提供煙草花葉病毒抗性的黃瓜植株 (Cucumis sativus L.)的方法,包括(a)在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中鑒別煙草花葉病毒的抗性基因位占.
^ \\\ (b)將鑒別的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)移進(jìn)第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里，從而向所述第二黃瓜植株(Cucumis sativusL.)授予煙草花葉病毒的抗 性；其中煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的特征在于在一個(gè)分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (AFLP)實(shí)驗(yàn)中，利用分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ IDNo :1和SEQ ID No :2，出 現(xiàn)241到251bp的核酸擴(kuò)增片段。根據(jù)本發(fā)明，引物SEQ ID No 1 包括核酸序列 5-GAC TGC GTA CCA ATTCGT-3‘， 引物 SEQ ID No 2 包括核酸序歹Ij 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACAC-3‘?；虻劓溄硬⒛軌蜩b別本煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的分子擴(kuò)增片段多態(tài)性 (AFLP)標(biāo)記也指定為標(biāo)記E22/M48-F-246(當(dāng)用引物SEQ ID No :1和2時(shí)，核酸AFLP的擴(kuò) 增片段的尺寸241-251bp，優(yōu)選地245-247bp，最優(yōu)選地246bp)。根據(jù)本發(fā)明的第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)可以是任何一個(gè)對(duì)煙草花葉 病毒，尤其是對(duì)CGMMV和CFMMV具有抗性顯型的黃瓜植株(Cucumissativus L.)，該抗性顯 型通過(guò)由如上限定的核酸擴(kuò)增片段(Marker E22/M48-F-246)的出現(xiàn)鑒別的基因位點(diǎn)來(lái)授予。核酸擴(kuò)增片段，或分子AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246，從而授予基因位點(diǎn)的抗性的出 現(xiàn)，可通過(guò)任何適合的分子生物學(xué)技術(shù)，如凝膠電泳，雜交，親和層析，熒光等，利用分析核 酸擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)建立。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施例中，片段利用在現(xiàn)有技術(shù)中指定為分子擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多 態(tài)性(AFLP，Zabeau，1993，and Vos，1995)的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)來(lái)擴(kuò)增和鑒別。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)是一種以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的基因指紋技 術(shù)，是由Keygene于二十世紀(jì)90年代初開(kāi)發(fā)的。AFLP用限制性內(nèi)切酶來(lái)酶切基因DNA，接 著把互補(bǔ)的雙鏈接頭與限制片段末端結(jié)扎。然后限制片段的子集利用補(bǔ)充接頭和限制位置 片段的引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增。片段通過(guò)放射自顯影或熒光方法在聚丙烯酰胺凝膠上被觀測(cè)到。這通常產(chǎn)生了許多不同尺寸的核酸擴(kuò)增片段。通過(guò)比較從例如敏感性植株和抗性 植株獲得的核酸擴(kuò)增片段，區(qū)別核酸擴(kuò)增片段能夠在兩種顯型之間被鑒別，也能夠指定為
5標(biāo)記。在目前情況下，基因地鏈接并能夠鑒別當(dāng)前抗性位點(diǎn)的指定為AFLP標(biāo)記E22/ M48-F-246的特定的AFLP標(biāo)記基因是由241_251bp的核酸擴(kuò)增片段的出現(xiàn)來(lái)鑒別的，優(yōu)選 245-247bp，最優(yōu)選246bp。該標(biāo)記僅出現(xiàn)在抗性個(gè)體中許多未區(qū)別的其他AFLP擴(kuò)增片段 中，但在敏感性個(gè)體中不出現(xiàn)。應(yīng)該注意的是，為了鑒別在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里的煙草花葉病 毒的抗性基因位點(diǎn)，利用AFLP引物SEQ ID No 1和2進(jìn)行的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的AFLP分析，能夠產(chǎn)生與目前的AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246相差2bp的第二核酸擴(kuò)增片 段。根據(jù)本發(fā)明，這個(gè)更大(2bp)的核酸擴(kuò)增片段未基因地鏈接并能夠鑒別當(dāng)前的煙草花 葉病毒的抗性基因位點(diǎn)基因。換言之，當(dāng)利用AFLP和AFLP引物SEQ ID No :1和2分析時(shí)，目前的第一黃瓜植株 (Cucumis sativus L.) 一定產(chǎn)生標(biāo)定尺寸的AFLP E22/M48-F-246標(biāo)記，但另外也產(chǎn)生了較 大尺寸(2bp)的第二核酸擴(kuò)增片段。只產(chǎn)生AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246或產(chǎn)生AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246，和附加地第二 略大(2bp)的片段的兩種第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)都包含在本發(fā)明中。然而， 只產(chǎn)生第二略大(2bp)的片段的第一黃瓜植株(Cucumissativus L.)未包含在本發(fā)明中?？紤]到上述情況，第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的當(dāng)前選擇本身包括了利 用分子生物學(xué)技術(shù)在該植株中檢測(cè)煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)。這是因?yàn)榛虻劓溄?AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246的當(dāng)前的煙草花葉病毒的抗性位點(diǎn)不能只利用對(duì)傳統(tǒng)育種技術(shù) 普遍的以顯型為基礎(chǔ)的選擇來(lái)建立。換言之，在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里鑒別煙草花葉病毒的抗性基因 位點(diǎn)不涉及利用單一的傳統(tǒng)選擇工藝。在根據(jù)本發(fā)明在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里鑒別煙草花葉病毒的抗 性基因位點(diǎn)之后，基因位點(diǎn)被轉(zhuǎn)移進(jìn)第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里，從而向所述 第二個(gè)黃瓜植株(Cucumis sativus L.)授予煙草花葉病毒抗性。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移當(dāng)前的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)包括諸如傳統(tǒng)的把第一黃瓜植 株(Cucumis sativus L.)與第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)雜交、接下來(lái)一個(gè)或多 個(gè)子代與第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)回交的傳統(tǒng)育種方法。然而，這種傳統(tǒng)育種 方法優(yōu)選地與分子生物學(xué)技術(shù)共同協(xié)作，以便在第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里建 立當(dāng)前抗性基因位點(diǎn)的保持。相對(duì)于傳統(tǒng)育種技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前的AFLP標(biāo)記E22/M48-F-246的提供允許在 每次回交步驟后合適的煙草花葉病毒的抗性子代的迅速選擇，從而避免了繁瑣和昂貴的篩 選方法，例如在每代上病毒感染和建立一個(gè)抗性顯型，以便鑒別合適的煙草花葉病毒的抗 性子代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)是煙草花葉病毒 敏感性的商業(yè)品種。通過(guò)轉(zhuǎn)移當(dāng)前的抗性基因位點(diǎn)進(jìn)該植株，而保持其他的商業(yè)上有價(jià) 值的高品質(zhì)的基因型和顯型特征，從而提供了一個(gè)有更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的黃瓜植株(Cucumis sativus L)ο在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)前的方法提供了一種具有含有第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的第二黃瓜植株(Cucumissativus L.)的基因型的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)。因此，根據(jù)第二方面，本發(fā)明還涉及包 括含有煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的煙草花葉病毒敏感性黃瓜植株(Cucumis sativus L.)品種的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)，其中煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的特征在 于在一個(gè)分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性實(shí)驗(yàn)里，利用分子擴(kuò)增片段多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1禾口 SEQ ID No 2擴(kuò)增，出現(xiàn)241_251bp、優(yōu)選245_247bp、最優(yōu)選246bp的核酸擴(kuò)增片 段。。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例里，煙草花葉病毒抗性，從而根據(jù)本發(fā)明的煙草花葉病毒抗性 基因位點(diǎn)，至少授予對(duì)黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的 抗性。根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及用于提供煙草花葉病毒的抗性黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的用途，其中煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn) 特征如上所限定的。根據(jù)本發(fā)明的該第三方面，煙草花葉病毒的抗性包括黃瓜綠斑駁花葉病毒 (CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。根據(jù)第四方面，本發(fā)明涉及煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其特征在于在分子擴(kuò) 增長(zhǎng)度多態(tài)性實(shí)驗(yàn)中，利用核酸擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(ADLP)引物SEQID No :1和SEQ ID No 2的241-251bp核酸擴(kuò)增片段。優(yōu)選地，當(dāng)前的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的特征是一個(gè)245_247bp的AFLP核 酸擴(kuò)增片段。最優(yōu)選地，當(dāng)前的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)是一個(gè)246bp的AFLP核酸擴(kuò)增片 段。應(yīng)當(dāng)注意的是，僅利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2、表示為AFLP核酸擴(kuò)增片段的基因位點(diǎn)比上述片段略大(2bp)，不包含在本發(fā)明中。根據(jù)本發(fā)明的該第四方面，煙草花葉病毒的抗性優(yōu)選地包括黃瓜綠斑駁花葉病毒 (CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將在下述實(shí)施例中被進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1 敏感性和抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的鑒別介紹以下的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃用來(lái)將黃瓜植株(Cucumis sativus L.)分類為對(duì)黃瓜綠斑駁花 葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)感染有敏感性或抗性。至少在荷蘭，實(shí) 施分析的最佳時(shí)間是從9月到4月。植株原料被測(cè)試的植株(Cucumis sativus L.)，包括抗性植株與敏感性植株，被播種在中 等尺寸的蛭石里，且在24°C下生長(zhǎng)，覆蓋小尺寸的蛭石。在4到5天后(子葉剛展開(kāi))，幼 苗被轉(zhuǎn)移到石棉塊上，且在2天后，植株被轉(zhuǎn)移到隔離的溫室里。在40個(gè)個(gè)體的每個(gè)塊之后，優(yōu)選地在將其放進(jìn)隔離的溫室4天后，敏感性控制 Tyria Fl (Enza Zaden的商業(yè)Fl黃瓜品種，荷蘭)作為敏感性控制，并且幼苗被嫁接在子葉
7上。病原CGMMV和CFMMV的隔離種群被準(zhǔn)備。簡(jiǎn)單的說(shuō)，準(zhǔn)備接種體(inoculi)，新鮮的磷 酸鹽緩沖液(0. IM磷酸鹽溶液，pH值為7. 7)。從癥狀最近發(fā)展的感染的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)上摘取葉子原料。帶清楚癥狀的無(wú)莖的嫩葉子組織被采用。近1克的葉子原 料被用于5毫升的緩沖液。葉子原料被研磨，從而獲得病毒隔離種群。對(duì)于感染，當(dāng)出現(xiàn)晴朗天氣時(shí)，如上生長(zhǎng)的植株在感染一天前用覆蓋物遮蔭。在感 染一天后，移去覆蓋物。但是，在高的光強(qiáng)度的情況下，覆蓋物應(yīng)該再保留一天。在低濕度的 情況下，在感染后濕度能通過(guò)直接澆濕底盤(pán)來(lái)增加，以便防止子葉由于感染的傷害而枯萎。 溫度的要求是夜里18-20°C，白天22-25°C。植株通過(guò)雙粗棉布被金剛砂輕輕研磨。海棉被浸到接種體(inoculi)中，在整個(gè) 子葉的表面擦拭兩次。雖然病毒是穩(wěn)定的，感染時(shí)間應(yīng)該少于1小時(shí)。評(píng)估黃瓜植株的最先的兩個(gè)葉子沒(méi)有顯示癥狀(敏感性植株與抗性植株一樣)。從第 三到第四個(gè)葉子的階段，癥狀將很容易評(píng)價(jià)敏感性或抗性。實(shí)施例2 鑒別一個(gè)煙草花葉病毒抗性QTL的AFLP標(biāo)記的鑒別介紹在這個(gè)例子里，利用由Keygene N.V(瓦黑寧恩，荷蘭)實(shí)施的一個(gè)巨量QTL分析 (BQA)，在抗性黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中鑒別質(zhì)量性狀位點(diǎn)(QTL)。98個(gè)個(gè)體的 群體作為煙草花葉病毒抗性的標(biāo)記研發(fā)被選擇?？偣?6個(gè)的AFLP引物組合在包含顯示對(duì) 煙草花葉病毒抗性的“極端顯型”的個(gè)體的兩個(gè)庫(kù)里被篩選。隨后，5個(gè)候選標(biāo)記在12個(gè)抗 性和12個(gè)敏感性個(gè)體上被驗(yàn)證。標(biāo)記鑒定和驗(yàn)證獲得130個(gè)植株的葉子原料98個(gè)個(gè)體的Cuc 1879-01 X 0K561群體為測(cè)試提供群 體，30個(gè)供方親體Cucl879-01的自交系和群體的父本系。DNA被分離，EcoRI/Msel模板被 生成。用引物組合E14/M59的130個(gè)植株的測(cè)試指紋被生成。在個(gè)體上的BQA和驗(yàn)證通過(guò)在一個(gè)包含十個(gè)“極端抗性”個(gè)體的庫(kù)和一個(gè)包含十個(gè)“極端敏感性”個(gè)體的 庫(kù)上篩選總共96個(gè)引物組合來(lái)實(shí)施BQA。這個(gè)篩選產(chǎn)生下述候選標(biāo)記的鑒別-E14/M58-F-169-P2-E22/M48-F-248/246 (雙等位基因)這些標(biāo)記隨后在24個(gè)個(gè)體(12個(gè)抗性個(gè)體和12個(gè)敏感性個(gè)體)上被驗(yàn)證。依據(jù) 這個(gè)驗(yàn)證，被鑒別的候選標(biāo)記被證實(shí)為鏈接煙草花葉病毒的抗性。在群體上候選標(biāo)記的驗(yàn)證在篩選96個(gè)引物組合和隨后的標(biāo)記確認(rèn)之后，一個(gè)推定的QTL能被鑒別。為了判 斷被鑒別的QTL是否真正是一個(gè)分離的QTL，執(zhí)行連鎖分析。標(biāo)記(E14/M58-F-169-P2和雙等位基因標(biāo)記E22/M48-F-248/246)在來(lái)自98個(gè)個(gè) 體的群體的46個(gè)額外的個(gè)體上被篩選。標(biāo)記數(shù)據(jù)集被生成，并與在24個(gè)體上的驗(yàn)證的標(biāo)記數(shù)據(jù)集合并。根據(jù)這一分析，能斷定4個(gè)標(biāo)記真正地鏈接一個(gè)QTL。用WinQTL制圖進(jìn)行標(biāo)記分析為了確定顯型和基因型之間的相關(guān)性，用WinQTL制圖軟件包分析標(biāo)記數(shù)據(jù)集。對(duì) 于單個(gè)標(biāo)記分析(SMA)，12個(gè)中的一個(gè)LOD的值被計(jì)算。對(duì)于區(qū)間映射(IM)，通過(guò)在顯型數(shù) 據(jù)上實(shí)施1000置換，95%的可靠閾值被計(jì)算，并確定為L(zhǎng)0D0. 9。解釋差異的LOD值和百分 比被計(jì)算用于該 QTL (L0D 9 ；Exp. Var. 49. 5)。結(jié)論為了鑒別對(duì)煙草花葉病毒的抗性的QTL，一個(gè)BQA被實(shí)施。總共96個(gè)引物組合在 一個(gè)有十個(gè)“極端抗性”個(gè)體的巨量和一個(gè)有十個(gè)“極端敏感性”個(gè)體的巨量上被篩選。其 中之一是雙等位基因的候選標(biāo)記在12個(gè)極端抗性和12個(gè)極端敏感性個(gè)體上以及在群體中 的48個(gè)其它個(gè)體上被驗(yàn)證。通過(guò)使用一個(gè)BQA途徑鑒別了一個(gè)QTL區(qū)域。該QTL解釋了 50%的差異?；赥estPC ( 5個(gè)標(biāo)記)，在30個(gè)抗性供體Cuc 1879-01的自交系里沒(méi)有異 質(zhì)性被鑒定出。實(shí)施例3 分子標(biāo)記輔助的煙草花葉病毒抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.) 的鑒別分子分析用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，從敏感性和抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)中分離基 因原料，敏感性即顯示如上所述的一個(gè)或多個(gè)病毒感染癥狀。接下來(lái)，這個(gè)基因原料用適當(dāng)?shù)南拗泼?EcoRI/Msel)消化，再結(jié)扎接頭之后，用 引物對(duì) SEQNo :1 5-GAC TGC GTA CCA ATT CGT-3‘和 SEQIDNo 2 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3'或引物對(duì) SEQID No 3 5' -GACTGC GTA CCA ATT CAT-3‘和 SEQID No 4 5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACGT-3‘來(lái)進(jìn)行 AFLP 核酸擴(kuò)增。產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)電泳確定大小。在獨(dú)立黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的 基因中的AFLP標(biāo)記的出現(xiàn)可被檢測(cè)出是不存在㈠或存在(+)。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)AFLP標(biāo)記E14/M58-F-169 (不包含在本發(fā)明中，SEQ ID Nos 3和4) 出現(xiàn)時(shí)，一個(gè)約169bp的條帶被觀察到；當(dāng)AFLP標(biāo)記E22/M48-F-248 (不包含在本發(fā)明中， 引物SEQ ID No:3和4)出現(xiàn)時(shí)，約248bp的條帶被觀察到。具有約246bp估計(jì)尺寸的AFLP 標(biāo)記E14/M48-F-246(包括在本發(fā)明中，引物SEQ ID No 3和4)，基因地與抗性顯型相關(guān)。結(jié)果被總結(jié)在下述的表1中。表1 在 AFLP 標(biāo)記 E14/M58-F-169、E22/M48-F-246、E22/M48-F-248 和煙草花葉病 毒抗性顯型之間的相關(guān)性
權(quán)利要求
用于提供一種煙草花葉病毒抗性的黃瓜植株(Cucumis sativus L.)的方法，包括(a)在第一黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里鑒別一個(gè)煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)；(b)轉(zhuǎn)移鑒別的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)到第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)里，從而向所述第二黃瓜植株(Cucumis sativus L.)授予煙草花葉病毒的抗性；其中煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的特征在于在一個(gè)分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)實(shí)驗(yàn)中，利用分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No1和SEQ ID No2，出現(xiàn)241bp到251bp的核酸擴(kuò)增片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸擴(kuò)增片段是245到247bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中核酸擴(kuò)增片段是246bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述煙草病毒的抗性包括黃瓜綠斑 駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述煙草花葉病毒抗性包括一個(gè)或 多個(gè)亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
6.用于提供煙草花葉病毒抗性黃瓜植株(Cucumissativus L.)的煙草花葉病毒抗性 基因位點(diǎn)的用途，其中煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)的特征在于在一個(gè)分子擴(kuò)增片段長(zhǎng) 度多態(tài)性(AFLP)實(shí)驗(yàn)中，利用分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No :1和SEQ ID No :2，出現(xiàn)241到251bp的核酸擴(kuò)增片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中核酸擴(kuò)增片段是245到247bp。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用途，其中核酸擴(kuò)增片段是246bp。
9.根據(jù)權(quán)利6到8中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括黃瓜綠斑 駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求6到8中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括一個(gè) 或多個(gè)亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
11.煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其特征在于在一個(gè)分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (AFLP)實(shí)驗(yàn)中，利用分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ IDNo :1和SEQ ID No :2，出 現(xiàn)241到251bp的核酸擴(kuò)增片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其中核酸擴(kuò)增片段是245 到 247bp。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其中核酸擴(kuò)增片段是 246bp。
14.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其中所述 煙草花葉病毒的抗性包括黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV) 的抗性。
15.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)所述的煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其中所述煙 草花葉病毒的抗性包括一個(gè)或多個(gè)亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
16.一種黃瓜植株(Cucumis sativus L.)，包括煙草花葉病毒敏感性的黃瓜植株 (Cucumis sativus L.)品種的基因型，含有煙草花葉病毒的抗性基因位點(diǎn)，其中煙草花葉 病毒的抗性基因位點(diǎn)的特征在于在一個(gè)分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)實(shí)驗(yàn)中，利用分子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)引物SEQ ID No 1和SEQ ID No :2，出現(xiàn)241到251bp的核 酸擴(kuò)增片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植株，其中核酸擴(kuò)增片段是245到247bp.
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的植株，其中核酸擴(kuò)增片段是246bp.
19.根據(jù)權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)所述的植株，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括黃 瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)的抗性。
20.根據(jù)權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)所述的植株，其中所述煙草花葉病毒的抗性包括一 個(gè)或多個(gè)亞組1和2的煙草花葉病毒的抗性。
21.根據(jù)權(quán)利要求16到20的任一項(xiàng)所述的植株的種子、植株部位或果實(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記，其基因地鏈接黃瓜植株(Cucumis sativus L.)基因組中的基因位點(diǎn)，且能鑒別基因位點(diǎn)，該基因組授予對(duì)煙草花葉病毒的通?？剐裕貏e是對(duì)兩個(gè)在商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒有抗性，即，黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)。本發(fā)明還涉及用于向黃瓜植株(Cucumis sativus L.)、植株、植株部位和果實(shí)提供對(duì)煙草花葉病毒，特別是對(duì)兩個(gè)商業(yè)上重要的致病煙草花葉病毒，即黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)和黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒(CFMMV)，的抗性的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101939447SQ200880124547
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者亞普·馬澤雷羅烏, 南內(nèi)·法貝爾, 布賴特·范·坎彭, 羅納爾多·威爾特丁克 申請(qǐng)人:安莎種子公司