梨小食心蟲熒光pcr檢測方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，包括以下步驟：①、待鑒定樣品基因組DNA的提??；②、實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置：以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測；③、擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷。探針為：Probe：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。本發(fā)明能用于有效地從蛀果性害蟲(包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟等)中區(qū)分出梨小食心蟲。
【專利說明】梨小食心蟲熒光PCR檢測方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種梨小食心蟲污染的分子檢測方法，具體地說，涉及一種梨小食心 蟲熒光PCR檢測方法，其屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 梨小食心蟲（Grapholitha molesta(Busck))屬鱗翅目卷蛾科，簡稱梨小，又名東 方果蠹蛾、梨姬食心蟲、桃折梢蟲、小食心蟲、桃折心蟲，俗稱蛀蟲、黑膏藥，廣泛分布于世界 各地，國內(nèi)遍布個省區(qū)，是梨樹的重要害蟲，在梨、桃樹混栽的果園為害尤為嚴(yán)重。幼蟲蛀果 多從萼洼處蛀入，直接蛀到果心，在蛀孔處有蟲糞排出，被害果上有幼蟲脫出的脫果孔。幼 蟲蛀害嫩梢時，多從嫩梢頂端第三葉葉柄基部蛀入，直至髓部，向下蛀食。蛀孔處有少量蟲 糞排出，蛀孔以上部分易萎蔫千枯。主要寄主除桃和梨外，還有李、杏、蘋果、山楂等，既危害 果實(shí)，也危害新梢，嚴(yán)重影響果品產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來其發(fā)生出現(xiàn)上升趨勢，是世界性的主 要蛀果害蟲之一，為出口檢疫對象。
[0003] 梨小食心蟲的形態(tài)特征，成蟲：體長5- 7毫米，翅展9一 15毫米，全身灰褐色無光 澤，觸角絲狀，下唇須灰褐上翹；前翅灰黑，前緣有7-10組白色短針紋，在翅的中部有一小 白點(diǎn)，近外緣處有10個小黑斑點(diǎn)，是其顯著特征。幼蟲：末齡幼蟲體長10?13毫米。全體 非骨化部分淡黃白色或粉紅色，腹部橙黃，頭黃褐色，前胸背板黃白色，透明，體背桃紅色。 腹足趾鉤 3〇?40個。蛹：體長6-_7毫米，紡錘形，黃褐色，腹部3?7節(jié)背面各具兩排短 刺，排列整齊， 8?10節(jié)各生一排稍大刺，腹未有8根鉤狀臀棘。繭絲質(zhì)白色，長橢圓形，稍 扁平，長約1〇_。卵：黃白色，扁橢圓形，中央隆起，周緣扁平，直徑0.5?0.8_，半透明。 [000 4] 梨小食心蟲的發(fā)生特點(diǎn)：發(fā)生世代多，各代發(fā)生時期不整，各代發(fā)生期很長，世代 明顯重疊。遼寧、河北、新疆地區(qū)1年發(fā)生3?4代，河南、安徽、江蘇、陜西、山東地區(qū)為4? 5代，四川 5?6代，江西和廣西分別為6和7代。以老熟幼蟲在果樹枝干和根頸裂縫處及 土中結(jié)成灰白色薄繭越冬，華北第4代多為不完全世代，以3代和部分4代幼蟲越冬。翌年 春季4月上中旬開始化蛹，越冬部位較分散，樹干、主枝分杈、根頸部的粗裂、翹皮下，樹下 落葉里、草根上和土里都有分布。
[0005]蘋果蠹蛾（Cydia pomonella L·),香梨優(yōu)斑螟（Euzophera pyriella Yang)和梨 小食心蟲為我國常見的蛀果性害蟲，此三種害蟲的低齡幼蟲在外部形態(tài)上非常相似，沒有 顯著差異，目前，我國檢疫部門對梨小食心蟲的分類鑒定主要是以老熟幼蟲或成蟲的外部 形態(tài)特征為依據(jù)，在果品出口、運(yùn)輸和實(shí)施檢疫控制前準(zhǔn)確地區(qū)分檢疫性害蟲是相當(dāng)必要 的，目前大多憑借形態(tài)學(xué)特征只能區(qū)分成蟲、晚齡期害蟲，大多數(shù)的檢疫性有害生物較短暫 的幼蟲階段很難依靠形態(tài)學(xué)特征精確區(qū)分，但蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟和梨小食心蟲等有害 生物的幼蟲基本是在水果采收時大量出現(xiàn)，同時中、外雙方截獲的食心蟲形態(tài)特點(diǎn)都不明 顯，有時以殘?bào)w形式出現(xiàn)，給種類的鑒定帶來很大困難。國外在截獲有害生物時，截獲檢疫 性有害生物和截獲一般有害生物，對貨物處理，產(chǎn)地的制裁，出口的限制有很大的區(qū)別。從 收到的國外通報(bào)看，對方國對截獲有害生物的鑒定結(jié)果五花八門，我方想對對方結(jié)果進(jìn)行 質(zhì)疑，缺乏有力的證據(jù)和方法。檢驗(yàn)方法的不成熟和低分辨率依然會造成進(jìn)口國在截獲檢 疫性有害生物時采取嚴(yán)厲制裁措施的風(fēng)險(xiǎn)。帶來過多的技術(shù)糾紛，增加禁止出口的風(fēng)險(xiǎn)，增 加檢疫性處理或者退貨會產(chǎn)生較大的費(fèi)用消耗。因此，建立一種梨小食心蟲快速、靈敏、準(zhǔn) 確的分子生物學(xué)檢測方法是十分必要和緊迫的，對口岸檢疫和防治監(jiān)測都有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，本發(fā)明 具體給出了用于梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測的特異性引物和Taqman探針，本發(fā)明能用于 有效地從蛀果性害蟲（包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟等）中區(qū)分出梨小食心蟲。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，檢 測中所用特異性引物和探針的核苷酸分別為：
[0008] 特異性引物為：
[0009] F-Primer: 5，-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3 '
[0010] R-Primer:5' -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3' ；
[0011] 探針為：
[0012] Probe : 5 ' _ (FAM) CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG (TAMRA) -3 '。
[0013] g卩，本發(fā)明首先提供了一種梨小食心蟲的鑒定引物，其核酸序列如SEQ ID No. 1和 2所示，其中，SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列為正向引物，SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列 為反向引物。
[0014] LX-FP :5' -CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3'（SEQ ID No. 1)或其互補(bǔ)鏈；
[0015] LX-RP :5, -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3,（SEQ ID No. 2)或其互補(bǔ)鏈；
[0016] 本發(fā)明用于梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測的Taqman探針，該探針針對上述引物的 擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，即本發(fā)明所述的Taqman探針為：5'-(FAM) CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)_3'（SEQ ID Νο·3)或其互補(bǔ)鏈。
[0017] 本發(fā)明所述的特異性引物和Taqman探針由Takara(大連，中國）公司委托合成及 記。
[0018] 特別地，本發(fā)明利用通用引物對不同地區(qū)的31次采樣的近500只梨小食心蟲、蘋 果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化、克隆、測序后，分別得到517bp、 5〇4bp 和527bp的序列，各物種的C0I基因長片段用CLUSTAL 2. 1和DNA-star等軟件進(jìn)行比對 分析，篩選出差異位點(diǎn)較多的區(qū)段，進(jìn)而在該區(qū)段使用Primer premier 5.0和ABI Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，并用BLAST程序驗(yàn)證引物特異性。該引物/ 探針組合具有較高的檢測靈敏度和擴(kuò)增特異性，能高效的將梨小食心蟲與其他相似的檢驗(yàn) 檢疫性害蟲區(qū)分開。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種使用上述梨小食心蟲特異性引物和Taqman探針鑒定梨小食 心蟲的方法，包括以下步驟：
[0020] ①、待鑒定樣品基因組DNA的提??；
[0021] ②、實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置：
[0022]以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用上述弓I物和探針（Taqman探針），進(jìn)行實(shí)時熒光PCR 檢測；
[0023] ③、擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷：
[0024] 根據(jù)實(shí)時熒光擴(kuò)增曲線判定樣品檢測結(jié)果。
[0025] 作為本發(fā)明的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法的改進(jìn)：
[0026] 探針的5,端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，根據(jù)所采用的實(shí)時熒光PCR儀的配置而定，所 述報(bào)告熒光染料為FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、CY3或CY5,探針的3'端標(biāo)記有淬滅熒光 染料，所述萍滅突光染料為TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ或ECLIPSE。
[0027] 在本發(fā)明中：
[0028] 步驟①提取樣品基因組DNA的具體步驟為：將待鑒定樣品放入研缽內(nèi)，導(dǎo)入液氮， 充分研磨后，加入裂解液，待溶化后用移液器轉(zhuǎn)移至 L 5mL離心管內(nèi)，采用試劑盒離心柱法 提取基因組DNA，試劑盒共采用了北京全式金（EE111)、天根（DP304)、北京鼎國（NEP001)、 Qiagen(69504)等4種植物DNA提取試劑盒。DNA濃度及純度通過ND-2000C核酸蛋白分析 儀檢測。
[0029] 所述樣品為梨小食心蟲成蟲，老熟幼蟲，小齡幼蟲，蛹和殘?bào)w，或經(jīng)糖醋液捕捉到 的蟲體。
[0030] 步驟②所用檢測體系的具體組成如下：25 μ L總體積中含有10 XPCR Buffer (含 Mg2+)2. 5μ L，dNTP(2. 5mM，each)2p L,上下游引物（1〇μΜ)各 0· 5μ L,探針（10μΜ)0· 5μ L， 500U Taq DNA聚合酶0.25 μ L和DNA模板（由步驟①提取得到的溶液）2 μ L,補(bǔ)水至25 μ L。
[0031] 在本發(fā)明中，同時設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陽性對照、陰性對照以及空白對照實(shí)驗(yàn)，陽性對 照由經(jīng)形態(tài)學(xué)專家驗(yàn)證的梨小食心蟲體提取的DNA為模板，可確保核酸提取和擴(kuò)增反應(yīng)的 有效性；空白對照中不加模板DNA,而以滅菌蒸餾水代替，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染和較 高的引物二聚體污染；陰性對照為蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟提取的DNA為模板，避免出現(xiàn)假陰 性結(jié)果；設(shè)置三個重復(fù)確保數(shù)據(jù)可靠準(zhǔn)確。
[0032] 步驟②所述的實(shí)時熒光PCR檢測時的反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)處理15s，再以95°C變性 5s，60°C退火/延伸34s，進(jìn)行40個循環(huán)，在每個循環(huán)的60°C退火/延伸階段收集熒光信號。 [0033] 步驟③中檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)樣品擴(kuò)增出具有指數(shù)增長型的熒光擴(kuò)增曲 線，當(dāng)其Ct值小于35,且陰性對照和空白對照無熒光信號，說明該樣品受到梨小食心蟲污 染，否則不是梨小食心蟲污染。當(dāng)檢測樣品Ct值小于35,但陰性對照/空白對照有熒光信 號，說明該檢測結(jié)果不可信，整個檢測過程需要重新做。
[0034] 本發(fā)明中所述的水均為無核酸酶污染的雙蒸水。
[0035] 本發(fā)明中還可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物和探針的擴(kuò)增效率以及對建立的 熒光PCR反應(yīng)進(jìn)行重復(fù)性和靈敏性分析。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是以前述的DNA擴(kuò)增模板的連續(xù)的 5個濃度梯度為樣品，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，擴(kuò)增得到的平均 Ct值為縱坐標(biāo)，模板起始濃 度為橫坐標(biāo)的關(guān)系曲線。
[0036] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0037]特異性高：本發(fā)明利用梨小食心蟲C0I基因中的差異性序列設(shè)計(jì)特異性引物，用 該引物擴(kuò)增蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟和梨小食心蟲，1 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果僅有梨小食心蟲 樣本中出現(xiàn)一條114bp的清晰條帶，其它對照樣品均無條帶產(chǎn)生。此外，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一 條特異性熒光探針，在實(shí)時熒光檢測過程中對靶片段進(jìn)行雙重質(zhì)控，利用上述的引物和探 針序列進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，僅有梨小食心蟲樣品出現(xiàn)了指數(shù)型的擴(kuò)增曲線，其余 對照樣品無熒光信號，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針可以保證擴(kuò)增的特異性，避免假陽性檢測 結(jié)果。
[0038]重復(fù)性好：本發(fā)明使用DNA擴(kuò)增模板的連續(xù)5個濃度梯度樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個 樣品設(shè)置三個重復(fù)，這三個重復(fù)之間的變異系數(shù)在〇. 243-0. 978之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為 0· 9900,試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有良好的線性關(guān)系，重復(fù)性較好。
[0039] 靈敏度高：本發(fā)明梨小食心蟲COI基因擴(kuò)增效率為96. 74%，在可接受的PCR擴(kuò)增 效率范圍內(nèi)（90-110%)。DNA溶液在4·75Χ1(Γ3?47.52ng/uL的檢測范圍內(nèi)熒光定量 PCR起始模板濃度和Ct值之間具有較好的線性關(guān)系，本發(fā)明建立的分子檢測體系靈敏度較 高，最低檢出限在4. 75 X l(T3ng/ μ L，即4· 75pg/ μ L，滿足檢驗(yàn)檢疫日常檢測需求。
[0040]本發(fā)明所涉及的操作方法簡單，易行，能夠在較短時間內(nèi)（約3小時）完成梨小食 心蟲的鑒定，一次可檢測多個樣品，特別適合于大批量的抽樣檢查，可應(yīng)用到實(shí)際檢疫工作 中，不僅能大大縮短進(jìn)出口物品的通關(guān)時間，而且還能降低檢疫人員的工作強(qiáng)度，為進(jìn)出口 安全提供了技術(shù)保障。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0042]圖1為使用本發(fā)明特異性引物和探針實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增待檢樣本，陽性對照，陰性 對照等成蟲以及空白對照的擴(kuò)增曲線圖譜；
[0043] 1.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為梨小食心蟲成蟲的樣本為陽性對照；
[0044] 2.疑似梨小食心蟲成蟲的待檢樣本；
[0045] 3.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為蘋果蠢蛾成蟲的樣本為陰性對照；
[0046] 4.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為香梨優(yōu)斑螟成蟲的樣本為陰性對照；
[0047] 5.以滅菌蒸餾水為模板的空白對照。
[0048]圖2為使用本發(fā)明特異性引物和探針實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增待檢樣本，陽性對照，陰性 對照等幼蟲以及空白對照的擴(kuò)増曲線圖譜；
[0049] 1.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為梨小食心蟲幼蟲的樣本為陽性對照；
[0050] 2.疑似梨小食心蟲幼蟲的待檢樣本；
[0051] 3.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為蘋果蠢蛾幼蟲的樣本為陰性對照；
[0052] 4.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為香梨優(yōu)斑螟幼蟲的樣本為陰性對照；
[0053] 5.以滅菌蒸餾水為模板的空白對照。
[0054]圖3為使用10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時熒光PCR體系中擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜。 [0055]圖4為使用本發(fā)明特異性引物和探針實(shí)時熒光PCR進(jìn)行盲樣測試的擴(kuò)增曲線圖 譜；
[0056] 1.通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為梨小食心蟲成蟲的樣本為陽性對照； t〇〇57] 2.盲 1(成蟲）
[0058] 3.盲 2(成蟲）
[0059] 4.盲 3(幼蟲）
[0060] 5.盲 4(幼蟲）
[0061] 6.盲 5(幼蟲）
[0062] 7·通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為蘋果蠹蛾成蟲的樣本為陰性對照；
[0063] 8·通過形態(tài)學(xué)專家鑒定為香梨優(yōu)斑螟成蟲的樣本為陰性對照；
[0064] 9.以滅菌蒸餾水為模板的空白對照。
[0065] 圖5為序列表1的比對。
[0066] 圖6為序列表2的比對。

【具體實(shí)施方式】
[0067]本發(fā)明基于目前的分子生物學(xué)技術(shù)手段，從待鑒定樣品的DNA模板提取，特異性 引物和探針設(shè)計(jì)和實(shí)時熒光PCR反應(yīng)及結(jié)果判斷等入手，通過開發(fā)新的方法以達(dá)到準(zhǔn)確、 快速檢測梨小食心蟲的目的。下面實(shí)施例用于本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明 的范圍。
[0068] 備注說明：以下幼蟲均指老熟幼蟲。
[0069] 實(shí)施例1、引物和探針的設(shè)計(jì)與合成
[0070] 通過采集新疆巴州不同地區(qū)的梨小食心蟲成蟲及幼蟲樣本，以C0I通用引物：正 向引物：5 ' -GGWGGATTTGGAAATTGAYTAGTWCC-3 '、反向引物：5，-CCHGGTAAAATTAAAATATAMCTT C-3'經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序得到梨小食心蟲C0I基因片段序列。通過NCBI中的BLAST比 對梨小食心蟲C0I特征序列，序列同源性達(dá)99% (AB603521. 1、HQ538466. 1、JF733841. 1), 即C0I區(qū)域的保守性較高，保證了引物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。此外，我們還將梨小食心蟲與蘋果蠹 蛾、香梨優(yōu)斑螟的C0I序列進(jìn)行比對分析，尋找到他們之間的差異位點(diǎn)，在差異性序列區(qū)域 設(shè)計(jì)種屬特異性的引物和探針，并委托Takara(大連，中國）公司合成和標(biāo)記。
[0071] 上游引物 LX-FP : 5 ' -CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3，
[0072] 下游引物 LX-RP : 5 ' -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3，
[0073] 探針 LX-P : 5 ' -CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG-3，
[0074] 該探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TRAMA。
[0075] 備注說明：梨小食心蟲特異性引物和探針的設(shè)計(jì)是本發(fā)明的關(guān)鍵，為了保證設(shè)計(jì) 的準(zhǔn)確性，我們開展了以下研究：
[0076] 1.梨小食心蟲種內(nèi)C0I基因保守性研究：將采集到的梨小食心蟲成蟲、幼蟲及殘 骸標(biāo)本，DNA提取后，以C0I通用引物擴(kuò)增，經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增和測序得到梨小食心蟲線粒體 基因 C0I片段序列。同時，我們從NCBI上下載了 4條梨小食心蟲的相關(guān)序列（KJ027508、 AB6〇3521. UHQ538466. 1、JF733841. 1)。用 CLUSTAL 2. 1 軟件對上述的 C0I 序列進(jìn)行比對 分析（見圖5所述的序列表1)，同源性達(dá)99%，表明不同來源的梨小食心蟲在C0I區(qū)域的 保守性很高，保證了引物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。
[0077] 2.香梨優(yōu)斑螟、蘋果蠹蛾種內(nèi)C0I基因保守性研究：將采集到的蘋果蠹蛾和香梨 優(yōu)斑螟的成蟲、幼蟲及殘骸標(biāo)本，DNA提取后，以C0I通用引物擴(kuò)增，經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增和測 序得到香梨優(yōu)斑螟、蘋果蠹蛾種內(nèi)C0I基因片段。同時，我們從NCBI上下載了 3條蘋果 蠹蛾的相關(guān)序列（FJ217755. 2、FJ217756. 2、FJ2177M· 2)和3條香梨優(yōu)斑螟的相關(guān)序列 (KC215198. 1、KC442311. 1、KC442309. 1)。用 CLUSTAL 2. 1 軟件對上述的 C0I 序列進(jìn)行比對 分析，同源性分別達(dá)99%和97%，表明蘋果蠢蛾和香梨優(yōu)斑螟的C0I區(qū)域的均具有較高的 保守性。
[0078] 3·梨小食心蟲與其他兩種害蟲的C0I序列比對：為了設(shè)計(jì)出針對梨小食心蟲的特 異性引物和探針，我們對梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟的C0I序列進(jìn)行了比對分析 (見圖6所述的序列表 2)，尋找出種間變異區(qū)，該區(qū)域的序列差異較大，而在種內(nèi)又相當(dāng)保 守，因此選定該區(qū)域作為梨小食心蟲引物和探針設(shè)計(jì)的靶序列。
[0079] 4.通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證梨小食心蟲引物和探針的特異性（見實(shí)施例4)。
[0080] 綜上所述，本發(fā)明利用梨小食心蟲與蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟的序列差異，設(shè)計(jì)出 了針對梨小食心蟲特異的引物和探針，開發(fā)出了一種基于該引物和探針的實(shí)時熒光定量 PCR鑒別梨小食心蟲的快速檢測方法。
[0081] 實(shí)施例2總DNA的提取
[0082] 取梨小食心蟲及蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟等陰性對照樣本，放入研缽中，加液氮充 分研磨，用DNeasy blood kit(Qiagen公司）提取樣品DNA，按照試劑盒說明書操作。樣 品提取時所用的肌肉組織星：平果蠢蛾：單頭2. 5-5· Omg，多頭（4-5只）15-20mg ;梨小食 心蟲：單頭〇· 8-1· 2mg，多頭（12-13只）12-16mg ;香梨優(yōu)斑螟：單頭1· 8-2. 2mg，多頭（3-5 只）8-12mg;地老虎：單頭8-12mg;單頭加30yL TE緩沖液進(jìn)行洗脫，多頭加60μ? TE緩 沖液洗脫。DNA溶液于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0083] 提取得到的DNA溶液經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，0D260/280大于1. 5, 0D260/230大 于1.0,提取效果均良好，濃度在30-200ng/yL(未經(jīng)RNase降解），經(jīng)10-100倍稀釋后可 用于實(shí)時熒光PCR檢測。
[0084] 備注說明：以下實(shí)施例3?實(shí)施例5采用的是單頭所得的DNA。
[0085] 實(shí)施例3實(shí)時熒光PCR檢測
[0086] 25μL實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系中包括：滅菌蒸餾水16.75μL，10XPCRBuffer(含 Mg2+) 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mM，each) 2 μ L，上下游引物（10 μ M)各 0. 5 μ L,探針（1〇 μ M) 0. 5 μ L， 500U Taq DNA聚合酶0· 25 μ L和DNA模板（實(shí)施例2提取得到的DNA溶液）2 μ L。反應(yīng)混 合液在ABI 7500實(shí)時定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件設(shè)置為95°C預(yù)處理15s，再以95? 變性5s, 6〇°C退火/延伸34s，進(jìn)行40個循環(huán)。同時設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陽性對照、陰性對照以 及空白對照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用ABI 7500software ν2.0·1進(jìn)行分析處理。
[0087] 實(shí)施例4實(shí)時熒光PCR檢測特異性試驗(yàn)
[0088] 將通過形態(tài)學(xué)鑒定的梨小食心蟲，香梨優(yōu)斑螟，蘋果蠹蛾的成蟲和幼蟲的樣本分 別按照實(shí)施例2所述方法進(jìn)行DNA的提取，分別以上述DNA為模板，以通過形態(tài)學(xué)鑒定的梨 小食心蟲為陽性對照，以香梨優(yōu)斑螟、蘋果蠹蛾為陰性對照，以滅菌蒸餾水為空白對照，以 待測蟲體作為待測樣本；進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件及設(shè)置同實(shí)施例 3,目的是驗(yàn)證 梨小食心蟲C0I基因引物和探針的特異性。結(jié)果如圖1和圖2所示。結(jié)果顯示：只有以梨 小食心蟲成蟲和幼蟲的DNA為模板的反應(yīng)管中顯示了指數(shù)型擴(kuò)增曲線，其他蟲體樣本均無 信號，證明梨小食心蟲C0I基因引物和探針具有特異性。
[0089] 表1各檢測樣本（成蟲）實(shí)時熒光PCR反應(yīng)的Ct值分析表 檢測樣本(1丫1頭成 蟲） 龜值；iCt_平均値 _^偏_ _某判 ;定 陽性對照 ：-"?4.13 15.11 14.?~ 14崩 〇.；19| + 蘋 Μ蛾 ^~>40 >40 ： >40 - 香梨優(yōu)斑螺^ S"""?40 ># ^ ?40 - 待檢樣木 15.03： 15.：16 15 26 15.16 0.105 + 空白 _i >40 ?40 >40 >40 -
[0090] 表2各檢測樣本（幼蟲）實(shí)時熒光PCR反應(yīng)的Ct值分析表
[0091] 檢測樣本(單頭幼 m Ct僵 Ct平均位 標(biāo)準(zhǔn)犏差 _集判記 陽性對照 18.92 19.?4 liJl 19.09 0l0§ + 蘋果蠹蛾 > >4〇 M0 - 香梨優(yōu)廳螟.. >40 .靖?>Ψ〇 >40 - 待檢樣本 21.Q5 20.51 21.20 20.92 036? + 空白對照 >40 >40 >40 >40 -
[0092] 實(shí)施例5實(shí)時熒光PCR檢測重復(fù)性和靈敏性試驗(yàn)
[0093] 提取梨小食心蟲樣本的基因組DNA，將測定好濃度的基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn) 行10倍梯度稀釋，共設(shè)置5個梯度，分別為47. 52ng/y L、4. 752ng/y L、0. 4752ng/y L、 0. 〇4752ng/ 和0· 0〇4752ng/ μ L，稀釋介質(zhì)為基因組DNA提取時所用的洗脫液（即實(shí)施 例2中的TE緩沖液）。對5個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時熒光 PCR反應(yīng)，每個梯度設(shè)置3 個重復(fù)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3)，其R2 為0· "0。對Ct值統(tǒng)計(jì)分析（表3)，同一參照樣品重復(fù)間Ct值變異較小，梨小食心蟲⑶I 基因 Ct值變化范圍在19. 01-Μ. 39之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0. 243_0· 978之間，表明該方法亙有 較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 ~
[0094] 表3梨小食心蟲濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品Ct值分析表
[0095] _品旗量_度 (ngVL) Ct值 Ct平均值 標(biāo)準(zhǔn)偏犛 47.5200 19 63~11.01 ~1 讀 !： 19；54 〇_ ^ 4^520 23 89 24 38 24 14 i PIP #·24| _52 WM 28.03-%6M 27.45 ?·576 _752 2$M 30.33 29.79 WM 0362~' *~~0,004752 32.54 3：4.3f 34.03 ：： 33,65 ______〇# 孫
[0096] 由表3可示，在最高稀釋度的樣品中，梨小食心蟲COI基因得到擴(kuò)增，Ct值 為34. 39,接近檢測臨界限（Ct = 35)，結(jié)果表明梨小食心蟲C0I基因在模板濃度為 〇· 004752ng/u L時為有效擴(kuò)增，即確定該濃度為最低定量限，最低檢測限為〇· 〇〇4752ng/ U L，即 4. 752pg/ μ L。
[0097] 實(shí)施例6、單多頭DNA樣本和DNA混合樣本檢測
[0098] 將梨小食心蟲的單（包括僅剩余頭部或腹部的殘?bào)w樣本）、多頭DNA樣品以及蘋果 蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟和梨小食心蟲混合DNA樣品分別用梨小食心蟲的特異性引物和探針進(jìn)行 擴(kuò)增，檢驗(yàn)單多頭取樣和混合樣本提取的模板DNA對后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)以及對引物探針特異性 的影響。結(jié)果顯示只有梨小食心蟲存在的樣本才能得到擴(kuò)增，其他樣本無信號。各個反應(yīng) 的PCR擴(kuò)增C t值匯總?cè)绫?所示。
[0099] 表4單多頭DNA樣本和DNA混合樣本熒光定量PCR檢測結(jié)果
[0100] 蘋果蠹蛾 香梨優(yōu)斑螟 梨小食心蟲 3種害蟲混 樣品名稱 單頭|多頭：單頭|多頭?·頭 多頭 #"：Dm LX引輸和探針擴(kuò)増 ' 1? UJI >4? >40 ^40 >4?' ... Ct(SD) (±0,134) (±&415) (±0 325) 鐵果判 R ： _ ： 4 + -(-
[01 01 ] 由表4可示，在蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟的單、多頭DNA樣本中，所得到擴(kuò)增曲線的Ct 值均大于40,為陰性，即無梨小食心蟲存在。而在梨小食心蟲單頭、多頭和3種害蟲混合樣 本中，所得到擴(kuò)增曲線的Ct值分別為I7· 45、I6· 71和18. 29,為陽性，即有梨小食心蟲存在。 [0102] 實(shí)施例7盲樣測試
[0103] 將上述所建立的熒光定量PCR檢測體系應(yīng)用于梨小食心蟲的日常檢測。項(xiàng)目組形 態(tài)學(xué)專家制作了成蟲和幼蟲盲樣，分別以盲1?盲5標(biāo)記，使用本發(fā)明研究確立的引物探針 以及實(shí)時熒光定量PCR體系方法檢測鑒定是否是梨小食心蟲，見表5和圖4,結(jié)果表明用本 發(fā)明建立的分子檢測方法鑒定的結(jié)果同形態(tài)學(xué)專家鑒定的一致。
[0104] 表5盲樣測試結(jié)果表
[0105]

【權(quán)利要求】
1. 梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是： 檢測中所用特異性引物和探針的核苷酸分別為： 特異性引物為： F-Primer:5 ' -CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3 ' R-Primer:5' -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3' ； 探針為： Probe :5' -(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是包括以下步 驟： ① 、待鑒定樣品基因組DNA的提?。? ② 、實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置： 以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用上述特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測； ③ 、擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是： 探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，根據(jù)所采用的實(shí)時熒光PCR儀的配置而定，所述報(bào) 告熒光染料為FAM、HEX、J0E、VIC、NED、FITC、CY3或CY5,探針的3'端標(biāo)記有淬滅熒光染料， 所述淬滅熒光染料為TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ或ECLIPSE。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是： 所述步驟②實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置為： 25 4 1^總體積中含有10父？〇?81^€612.5 4 1^，（1階13(2.51111，63(*)2 4 1^上下游引物 (10 μ M)各 0· 5 μ L，探針（10 μ M) 0· 5 μ L，500U Taq DNA 聚合酶 0· 25 μ L 和 DNA 模板 2 μ L， 補(bǔ)水至25 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是： 實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)處理15s，再以95°C變性5s，60°C退火/延伸34s，進(jìn) 行40個循環(huán)，在每個循環(huán)的60°C退火/延伸階段收集熒光信號。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是： 所述步驟④的擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷為：根據(jù)樣品擴(kuò)增出具有指數(shù)增長型的熒光擴(kuò) 增曲線，當(dāng)其Ct值小于35,且陰性對照和空白對照無熒光信號，說明該樣品受到梨小食心 蟲污染，否則不是梨小食心蟲污染；當(dāng)檢測樣品Ct值小于35,但陰性對照/空白對照有熒 光信號，說明該檢測結(jié)果不可信，整個檢測過程需要重新做。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的梨小食心蟲實(shí)時熒光PCR檢測方法，其特征是： 所述步驟①的梨小食心蟲待檢樣品的DNA的提取可采用CTAB法、SDS法、高鹽低pH法 或試劑盒法進(jìn)行提取。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232785SQ201410536526
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】王鳳軍, 馮俊麗, 華鵬, 張祥林, 張偉, 郭鐵群, 劉永杰, 王鵬舉 申請人:中華人民共和國庫爾勒出入境檢驗(yàn)檢疫局