稻瘟病菌無(wú)毒基因AvrPib特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種稻瘟病菌無(wú)毒基因AvrPib特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用。所述分子標(biāo)記的序列如SEQIDNO：1～4所示。利用所述分子標(biāo)記可以建立稻瘟病菌自然群體致病性變異的分子檢測(cè)體系，了解和把握所述基因在田間自然群體中的分布及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以此來(lái)指導(dǎo)各個(gè)地區(qū)水稻稻瘟病抗病育種以及品種合理布局和輪換，以便提高育種效率，更有效地控制稻瘟病的發(fā)生，以此來(lái)設(shè)計(jì)稻瘟病綜合防治的新策略。
【專(zhuān)利說(shuō)明】稻瘟病菌無(wú)毒基因特異性分子標(biāo)記及其方法與應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種稻瘟病菌無(wú)毒基因特異性 分子標(biāo)記及其方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻Z.)是全世界數(shù)十億人口賴(lài)以生存的重要糧食作物和重要的 工業(yè)原料，同時(shí)也是多種病蟲(chóng)害的宿主。由病原真菌從e 引起的稻癌病是 世界水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，每年都造成10?30%的水稻產(chǎn)量損失。而且該菌 還能夠侵染麥類(lèi)、谷類(lèi)等50多種禾本科植物。
[0003] 從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的觀點(diǎn)來(lái)看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病 最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群體的多樣性及易變性，使得抗病品種的抗性不穩(wěn) 定，以致抗病品種的感病化問(wèn)題一直沒(méi)有得到解決。傳統(tǒng)的稻瘟病菌生理小種及其群體結(jié) 構(gòu)是通過(guò)基于鑒別品種的致病型鑒定而決定的。但是，這種方法劃分的生理小種常因使用 的鑒別品種不同而異，且工作量大，結(jié)果易受季節(jié)限制以及環(huán)境條件的影響，難以客觀、真 實(shí)地反映稻瘟病菌的生理小種及其群體結(jié)構(gòu)。
[0004] 隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA水平上的分子指紋技術(shù)為研究在稻瘟 病菌群體中無(wú)毒基因的遺傳多樣性提供了高效、快速的方法，避免了通過(guò)鑒別品種的致病 型鑒定的大量工作，因此國(guó)內(nèi)外都非常重視基于稻瘟病菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其 應(yīng)用工作。目前利用DNA分子標(biāo)記已初步鑒定了40多個(gè)稻瘟病菌的無(wú)毒基因，并已經(jīng)克隆 了其中9個(gè)無(wú)毒基因，這為通過(guò)開(kāi)發(fā)無(wú)毒基因的特異性分子標(biāo)記來(lái)監(jiān)測(cè)田間稻瘟病菌群體 的生理小種及其群體結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化創(chuàng)造了條件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)稻瘟病無(wú)毒基因分子標(biāo)記研究 的缺陷，提供一種稻瘟病菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供利用上述分子標(biāo)記快速、準(zhǔn)確檢測(cè)稻瘟病菌無(wú)毒基因 辦的方法。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述稻瘟病菌無(wú)毒基因分子標(biāo)記在稻瘟病菌 群體檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 稻瘟病菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記由引物對(duì)Jkt/HFI/RI和組成，所述引物序列如SEQIDN0 :1所示Jkt/URI 序列如SEQIDNO:2所示 序列如SEQIDNO:3所示，序列如SEQID NO:4所示。
[0009] 申請(qǐng)人:在前期研究中通過(guò)圖位克隆的方法克隆獲得稻瘟病菌無(wú)毒基因通 過(guò)對(duì)所述無(wú)毒基因兩旁的基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)其兩旁的基因組序列特異性高 且變異性大，因此， 申請(qǐng)人:在所述無(wú)毒基因的編碼區(qū)及其兩側(cè)設(shè)計(jì)2對(duì)引物UKr_ft4Fl/Rl; JKrftT7F2/R2)，作為其特異性分子標(biāo)記。
[0010] 由上述稻瘟病菌無(wú)毒基因的核苷酸序列產(chǎn)生的特異性的分子標(biāo)記包括但 不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP(限制性?xún)?nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài))、 CAPS(切割擴(kuò)增片段多態(tài))。
[0011] 上述分子標(biāo)記在稻瘟病菌群體監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。用這些標(biāo)記可監(jiān)測(cè)田間稻瘟病菌群 體的生理小種及其遺傳結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，以及該無(wú)毒基因在田間自然群體中的分布情況。 有助于基于無(wú)毒基因標(biāo)記的稻瘟病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究；也有助于水稻品種的抗病性 鑒定和稻瘟病菌小種的鑒定；還有助于抗病品種的合理布局及輪換，以更有效地控制稻瘟 病的發(fā)生。
[0012] 本發(fā)明另一方面還提供了利用上述任一種引物對(duì)鑒定稻瘟病菌基因型的方法，該 方法是通過(guò)常規(guī)PCR技術(shù)，利用所述引物對(duì)分別對(duì)待測(cè)稻瘟病菌株進(jìn)行基于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的基因型分型。
[0013] 申請(qǐng)人:在前期研究中首先用分子標(biāo)記AvrPibF1/R1對(duì)300個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行基 因型(帶型）分析，為了排除引物匹配性造成的擴(kuò)增誤差，我們另外用AvrPibF2/R2對(duì)300 個(gè)菌株進(jìn)行基因型分析。個(gè)別菌株前后2次基因型存在差異，然后 申請(qǐng)人:參考菌株接種 IRBLb-B的致病型結(jié)果，對(duì)2次基因型(帶型）分析進(jìn)行整合，見(jiàn)圖5b。
[0014] 本發(fā)明所述結(jié)果判定的規(guī)則是：擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用阿拉 伯?dāng)?shù)字代表不同的基因型(帶型)，即"〇"、"1"、"2"、"3"、"4"分別表示沒(méi)有條帶、高帶、中 帶、低帶、雙帶；測(cè)試菌株的最終基因型由所述的2對(duì)分子標(biāo)記PCR基因型分析整合獲得。
[0015] 優(yōu)選地，所述PCR的擴(kuò)增體系為20P1，包括2W10XPCRBuffer、l. 6W2. 5mM 的dNTPs、0. 1W5U/W的酶、1W90ng/W的DNA模板、10剛引物各1W，余量為 雙蒸水。
[0016] 優(yōu)選地，當(dāng)利用引物對(duì)Jkt/HFI/RI進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94°C3 min，變性 94°C30sec，退火 62°C30sec，延伸 72°C3min20sec，擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 5min。
[0017] 優(yōu)選地，當(dāng)利用引物對(duì)Jkt/^F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94°C3 min，變性 94°C30sec，退火 60°C30sec，延伸 72°C2min20sec，擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 5min。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了兩對(duì)稻瘟病菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記，利用所述分子標(biāo)記可以建 立稻瘟病菌自然群體致病性變異的分子檢測(cè)體系，了解和把握所述基因在田間自 然群體中的分布及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以此來(lái)指導(dǎo)各個(gè)地區(qū)水稻稻瘟病抗病育種以及品種合 理布局和輪換，以便提高育種效率，更有效地控制稻瘟病的發(fā)生，以此來(lái)設(shè)計(jì)稻瘟病綜合防 治的新策略。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明采用的稻瘟病菌無(wú)毒基因的克隆及其功能研究的技術(shù)路線 圖； 圖2為稻瘟病菌無(wú)毒基因JKTftl的圖位克隆圖；其中圖a為JKTftl位點(diǎn)的遺傳圖 譜；連鎖標(biāo)記下數(shù)值為重組體/配子體；水平線下數(shù)值為標(biāo)記之間的相對(duì)遺傳距離（CM); 圖b為位點(diǎn)的電子物理圖譜；水平線下數(shù)值為根據(jù)參考菌株70-15的基因組序列 (http://www.broad,mit.edu)推測(cè)的物理距離（kb);圖c為JKrftT?位點(diǎn)的重疊群圖；圖d 為的候選基因及精細(xì)電子物理圖譜；圖e為候選基因的克隆及其遺傳轉(zhuǎn)化； 圖3為的基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)序列以及突變體；其中圖a為的基因結(jié)構(gòu)圖； 圖b為jKTftT?的蛋白序列圖，下劃線部分為信號(hào)肽；圖C為jKTftT?的基于PCR技術(shù)的定點(diǎn) 突變(左）及缺失突變(右）示意圖；F1/R1，F(xiàn)2/R2分別為PCR引物；圖d為突變體的 結(jié)構(gòu)示意圖及其致病性鑒定結(jié)果;產(chǎn)從為的對(duì)應(yīng)抗病基因，朽之及/^為的 非對(duì)應(yīng)抗病基因，以檢測(cè)二者的特異性互作關(guān)系；供體菌株（CHL42)及受體菌株（CHL724) 作為對(duì)照也用于致病性鑒定；R:抗病性(無(wú)毒性);S:感病性(有毒性）;MS:中度感病性（中度 有毒性）； 圖4為作圖群體的親本菌株（CHL42,CHL357)、遺傳轉(zhuǎn)化受體菌株（CHL724)以 及突變體菌株(Mab系列)在水稻品種IRBLb-B(含產(chǎn)從基因)上的表型鑒定圖；無(wú)菌水作為 接種物對(duì)照也用于致病性鑒定； 圖5為的特異性分子標(biāo)記及其檢測(cè)圖；其中圖a為特異性分子標(biāo)記PCR 引物的設(shè)計(jì)示意圖;的編碼區(qū)用黑框表示，各個(gè)引物的相對(duì)位置標(biāo)示于水平線下； 圖b為基于標(biāo)記Jkt/^FI/RI的基因型(左)、基于標(biāo)記Jkt/^F2/R2的基因型（中），以及基 于2個(gè)標(biāo)記的整合基因型(右）;M1 :DNA分子量標(biāo)記，DL2000 ;M2 :DNA分子量標(biāo)記，DL15000 ; 8個(gè)菌株（a-h)有關(guān)J的"表型/基因型"最終由各個(gè)菌株對(duì)水稻品種IRBLb-B(/^)的 致病性("V"表示菌株對(duì)IRBLb-B 具有致病性；"A"表示菌株對(duì)IRBLb-B 沒(méi)有致 病性）及整合基因型決定，a :V/1 (CHL26〇0) ;b :V/1 (CHL2626) ;c :V/2 (EHL〇348) ;d :A/3 (CHL2345) ；e：V/4 (EHL0342)；f：V/1 (CHL2549) ；g：V/3 (EHL0964)；h: V/0 (EHL0370)〇

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或 替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的常規(guī)手段。在本發(fā)明的實(shí)施例部分，闡述了 基因的分離克隆、功能特征、分子 鑒定以及應(yīng)用，分離的基因能夠與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入菌株中，使該菌株對(duì)含有 特異性互作的抗病基因產(chǎn)從的植物產(chǎn)生無(wú)毒性。
[0021] 本發(fā)明采用的技術(shù)路線如圖1所示。
[0022] 實(shí)施例1稻瘟病菌無(wú)毒基因的圖位克隆 (1 )JKTftl位點(diǎn)遺傳圖譜的構(gòu)建 為了發(fā)掘和鑒定稻瘟病菌無(wú)毒基因利用由稻瘟病菌株CHL357 (交配型 拗77-7;對(duì)含有產(chǎn)從的水稻品種IRBLb-B表現(xiàn)有毒性；Hua et al. 2012，Theor Appl Genet 125: 1047-1055)和 CHL42 (交配型姻77-J;對(duì) IRBLb-B表現(xiàn)無(wú) 2014，Plos One 9: e98067)雜交得到的83個(gè)后代子囊孢子菌株接種水稻品種IRBLb-B (Kobayashietal. 2007，JARQ41: 31-37)，結(jié)果表明，這個(gè)作圖群體中無(wú)毒性(非致病 性）菌株與有毒性(致病性）菌株分別為41和42株，其分離比符合1:1。由此推斷，CHL42 所表現(xiàn)的對(duì)水稻品種IRBLb-B的無(wú)毒性是由一對(duì)顯性基因控制的。
[0023] 為了快速地確定無(wú)毒基因的染色體位置，利用參考菌株75-10的參考序列 (reference sequence)，開(kāi)發(fā)并構(gòu)建了由 121 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR, simple rsequence repeat)組成的遺傳圖譜（Feng et al. 2007, Chinese Science Bulletin 52: 3346-3354)。然后，通過(guò)混合群體分離分析法（bulked-segregant analysis, BSA),篩選 了全部121個(gè)SSR標(biāo)記，得到了 7個(gè)與無(wú)毒基因連鎖的SSR標(biāo)記（MS6-24, MS6-3, MS6-7, MS6-10，MS6-17，MS3-5，MS3-26)，所述分子標(biāo)記的序列如下：

【權(quán)利要求】
1. 稻瘟病菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記由引物對(duì) jKrftlFl/Rl和JKr_ftT7F2/R2組成，所述引物對(duì)的序列如SEQ ID NO :1?4所示。
2. 權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在稻瘟病菌群體監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
3. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記鑒定稻瘟病菌基因型的方法，其特征在于，通過(guò)常規(guī) PCR技術(shù)，利用所述引物對(duì)分別對(duì)待測(cè)稻瘟病菌株進(jìn)行基于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型分型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，測(cè)試菌株的最終基因型由權(quán)利要求1所述 的2對(duì)分子標(biāo)記PCR基因型分析整合獲得。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR的擴(kuò)增體系為20 W，包括2沿 10XPCR Buffer、1.6 耵 2.5 mM 的 dNTPs、0.1 耵 5 U/W 的rT1即酶、1 耵 90 ng/W 的 DNA模板、10剛引物各1W，余量為雙蒸水。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，當(dāng)利用引物對(duì)JKTftlFl/Rl進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)， PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94°C 3 min，變性94°C 30 sec，退火62°C 30 sec，延伸72°C 3 min 20 sec，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，當(dāng)利用引物對(duì)JKTft4F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)， PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94°C 3 min，變性94°C 30 sec，退火60°C 30 sec，延伸72°C 2 min 20 sec，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104328114SQ201410570496
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】潘慶華, 張樹(shù)林, 何麗云, 楊先鋒, 王玲 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)