一種利用靜息乳酸菌技術(shù)轉(zhuǎn)化菜油腳料生產(chǎn)共軛亞油酸的方法
【專利摘要】一種利用靜息乳酸菌技術(shù)轉(zhuǎn)化菜油腳料生產(chǎn)共軛亞油酸的方法，包括：提取油脂，乳化，酶解，制備靜息乳酸菌，靜息乳酸菌轉(zhuǎn)化菜油腳料提取油脂酶解液生成共軛亞油酸，共軛亞油酸的提取等步驟。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品廢棄物菜油腳料的資源化利用，具有原料成本低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞密度高，轉(zhuǎn)化率可達(dá)20％-40％，轉(zhuǎn)化過程不易染菌，干擾物質(zhì)少，產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種利用靜息乳酸菌技術(shù)轉(zhuǎn)化菜油腳料生產(chǎn)共軛亞油酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用農(nóng)產(chǎn)品廢棄物菜油腳料為原料，采用靜息乳酸菌技術(shù)生產(chǎn)共軛亞油酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)的制備多采用化學(xué)法,該法是以價(jià)格為3萬/T的紅花油或葵花油為原料，采用高溫、高壓、堿法異構(gòu)化使油中的亞油酸發(fā)生異構(gòu)化而生成共軛亞油酸，其缺點(diǎn)是成本高，且合成時(shí)產(chǎn)生的t，t異構(gòu)體對(duì)人體有害。微生物細(xì)胞發(fā)酵法生產(chǎn)CLA，是以食用油為生產(chǎn)原料，微生物(如乳酸菌屬、真桿菌屬、丁酸弧菌屬等)為生產(chǎn)用菌株，雖然成本較低、生物穩(wěn)定性好，但是存在菌種很難達(dá)到高密度轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、易染菌、產(chǎn)物復(fù)雜等問題。
[0003]靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)CLA技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，可以作為亞油酸異構(gòu)酶的天然透析袋，免去了酶提取純化的繁瑣過程和高額成本，產(chǎn)物CLA以游離形式積累在細(xì)胞外，易于提?。?2)生成的反應(yīng)產(chǎn)物是具有生理活性的c9，tll-CLA和tlO, C12-CLA ；(3)反應(yīng)只需在適宜的介質(zhì)體系條件下進(jìn)行，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單一，CLA能以高濃度積累；(4)靜息細(xì)胞可以達(dá)到很高的密度，比發(fā)酵法的細(xì)胞密度高出十多倍。
[0004]我國是世界上最大的油菜籽生產(chǎn)國，年產(chǎn)量早已突破1000萬噸，在菜籽油加工過程中，油腳料每年排放量高達(dá)20萬噸之多。油腳極易發(fā)酵變質(zhì)、酸敗發(fā)臭，是我國城鎮(zhèn)油廠環(huán)境污染的重要源頭。菜油腳料中含有25%-30%的中性油，25%-35%的磷脂，其余為蛋白質(zhì)、氨基酸，糖等碳水化合物，礦質(zhì)元素及色素等物質(zhì)，所以油腳的利用開發(fā)成為環(huán)境治理和生物資源再利用的研究熱點(diǎn)。目前菜油腳料主要用來制備生物柴油、飼料、農(nóng)業(yè)肥料等，而從中提取中性脂肪酸，并進(jìn)一步加工轉(zhuǎn)化獲得高附加值產(chǎn)品CLA，卻極為少見。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供了一種利用靜息乳酸菌實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品廢棄物菜油腳料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)共軛亞油酸(CLA)的方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]本發(fā)明工藝步驟包括。
[0008](I)提取油脂:稱取菜油腳料到燒杯中，放在水浴鍋中60_90°C攪拌加熱20-40min，期間加入少量微沸蒸餾水；將熱處理后的菜油腳料4000-6000 rpm離心10-30 min，離心后上層為油層(中性油脂)，中層為水層，下層為磷脂等雜質(zhì)固體，傾出上層油，即為菜油腳料中所提取的中性油脂。
[0009](2)乳化:將步驟(I)得到的中性油脂與Tween 80按照1:0.8-1.7比例混合，加入適量的蒸餾水，進(jìn)行超聲波乳化處理(500 W，超聲10 S，間歇5 S，作用10-20次)，110-121°C滅菌20-30 min，得油脂乳化液。
[0010](3)酶解:取步驟(2)的油脂乳化液放入錐形瓶中，加入pH值7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加黑曲霉脂肪酶粉至終濃度為150-270 U/mL,40-45°C, 120-150 rpm酶解30-50 min，得油脂酶解液。
[0011](4)制備靜息乳酸菌:從新鮮斜面培養(yǎng)基上挑取乳酸菌，接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)20-26 h，得種子液。將種子液按3%-5%的接種量接種至添加有亞油酸乳化液的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，37°C靜置培養(yǎng)20 h ;培養(yǎng)液4°C，4000-6000 rpm離心15-30 min，去除上清液，底部菌體用無菌生理鹽水洗滌2_3次，離心收集，制備靜息乳酸菌菌懸液。
[0012](5)靜息乳酸菌轉(zhuǎn)化菜油腳料提取油脂酶解液生成CLA:取步驟(3)的油脂酶解液放入反應(yīng)管，加入步驟(4)的靜息乳酸菌菌懸液，加入適量0.1 mo I/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使得提取油脂終濃度為70-80 mg/mL, 32-36°C,90-110 rpm轉(zhuǎn)化22-26 h，得CLA轉(zhuǎn)化液。
[0013](6)CLA的提取:取步驟(5)的CLA轉(zhuǎn)化液與正己烷按1:2_5的比例混合，快速混勻4-6 min, 3800 -5000 rpm離心4_6min,分為三層(脂相、乳化層和水相),去除最下層水相，然后加入適量蒸餾水，混勻4-6 min，洗滌水溶性物質(zhì)，離心分層去除下層水相，將脂相層通過無水硫酸鈉過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷即得到CLA。
[0014]本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品廢棄物菜油腳料的資源化利用，具有原料成本低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞密度高，轉(zhuǎn)化效率高(轉(zhuǎn)化率可達(dá)20 % -40 % )，轉(zhuǎn)化過程不易染菌，干擾物質(zhì)少，產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中乳酸菌轉(zhuǎn)化萃取液和提取油脂的紫外光譜掃描圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0017]實(shí)施例:按以下工藝流程實(shí)施。
[0018](I)提取菜油腳料中的中性脂肪酸油脂:稱取20 g的菜油腳料到200 mL的燒杯中，放在水浴鍋中85°C攪拌加熱30 min，期間加入少量微沸蒸餾水，30min后，將菜油腳料轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，5000 rpm離心30 min,取出，可以看見離心管內(nèi)容物分為3層,上層為油層(中性油脂)，中層為水層，下層為磷脂等雜質(zhì)固體，傾出上層油，稱重。所得上層中性油脂比菜油腳料顏色淺，透明度較好，提取率可達(dá)21.76%，所得油脂酸價(jià)為24.2 mg/g，皂化值為194.706 mg/g，碘價(jià)為69.105 g/100g。經(jīng)氣相色譜檢測(cè)分析，可知提取油脂中的不飽和脂肪酸達(dá)到90%以上，其中亞油酸含量為15.5%，油酸含量為18.90%，亞麻酸含量為10%左右。
[0019](2)制備提取油脂乳化液:將步驟(I)的提取油脂與Tween 80按照1: 1.2比例混合，放入50 mL三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，進(jìn)行超聲波乳化處理(500 W，超聲10 S，間歇5 S，作用20次)，置121°C滅菌30 min，即為提取油脂乳化液，置4°C備用。
[0020](3)制備提取油脂酶解液:取一定量的步驟(2)的油脂乳化液于50 mL錐形瓶中，加入pH值7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加黑曲霉脂肪酶粉至終濃度為240 U/mL,40°C, 150 rpm酶解45 min，即為提取油脂酶解液。
[0021](4)制備靜息乳酸菌:從新鮮斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)植物乳桿菌CGMCC1.0557和嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，分別接種到150 mL MRS培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)22 h，即為種子液。按3%-5%的接種量分別接種至添加有亞油酸乳化液的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，37°C靜置培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)液4°C，5000 rpm離心20 min，去除上清液，底部菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，離心收集，分別制備得到0.25 g/mL的靜息乳酸菌菌懸液。
[0022](5)靜息乳酸菌轉(zhuǎn)化菜油腳料提取油脂酶解液生成CLA:往2個(gè)50 mL離心管中分別加入5 mL步驟(4)的靜息植物乳桿菌菌懸液、靜息嗜酸乳桿菌菌懸液，再分別加入15mL0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和3 mL步驟(3)的油脂酶解液，使得提取油脂終濃度為75 mg/mL, 35°C，100 rpm轉(zhuǎn)化24 h，即得到CLA轉(zhuǎn)化液。
[0023](6) CLA的提取和檢測(cè)-M 3 mL步驟(5)的CLA轉(zhuǎn)化液加入15 mL離心管中，力口入8 mL正己燒,快速混勻5 min, 4000 rpm離心5 min,分為三層(脂相、乳化層和水相),用移液槍吸取去除最下層水相，然后加入3 mL蒸餾水，混勻2 min，洗滌水溶性物質(zhì)，離心分層去除下層水相，將脂相層通過無水硫酸鈉過濾，定容至25 mL容量瓶中，即得到轉(zhuǎn)化液待測(cè)樣，并測(cè)定其在233 nm處吸光值。通過換算可知嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化液中CLA含量為1130.17μ g/mL，轉(zhuǎn)化率達(dá)到36.11% ;植物乳桿菌轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化液中CLA含量為869.33 μ g/mL，轉(zhuǎn)化率達(dá)到27.77%。亞油酸在200-205 nm之間有最大吸光值，而CLA在233-234 nm之間有最大吸光值。比較乳酸菌轉(zhuǎn)化24h后萃取液和菜油腳料提取油脂酶解液的光譜掃描圖(見附圖1)，可以看出，轉(zhuǎn)化24h后萃取液在205 nm處的吸光值降低了，233nm處的吸光值升高了，說明菜油腳料提取油脂中的部分亞油酸在乳酸菌的作用下轉(zhuǎn)化生成了 CLA。
【權(quán)利要求】
1.一種利用靜息乳酸菌技術(shù)轉(zhuǎn)化菜油腳料生產(chǎn)共軛亞油酸的方法，其特征是包括如下步驟: (1)提取油脂:稱取菜油腳料到燒杯中，放在水浴鍋中60-90°C攪拌加熱20-40min，期間加入少量微沸蒸餾水；將熱處理后的菜油腳料4000-6000 rpm離心10-30 min，傾出上層油，得中性油脂； (2)乳化:將步驟(I)得到的中性油脂與Tween80按照1:0.8-1.7比例混合，加入適量的蒸餾水，進(jìn)行超聲波乳化處理:500 W、超聲10 S、間歇5 S、作用10-20次，110-121°C滅菌20-30 min，得油脂乳化液； (3)酶解:取步驟(2)的油脂乳化液放入錐形瓶中，加入pH值7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加黑曲霉脂肪酶粉至終濃度為150-270 U/mL,40-45°C, 120-150 rpm酶解30-50min,得油脂酶解液； (4)制備靜息乳酸菌:從新鮮斜面培養(yǎng)基上挑取乳酸菌，接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)20-26 h，得種子液；將種子液按3%-5%的接種量接種至添加有亞油酸乳化液的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，37°C靜置培養(yǎng)20 h ;培養(yǎng)液4°C，4000-6000 rpm離心15-30min，去除上清液，底部菌體用無菌生理鹽水洗滌2-3次，離心收集，得靜息乳酸菌菌懸液； (5)靜息乳酸菌轉(zhuǎn)化菜油腳料提取油脂酶解液生成共軛亞油酸:取步驟(3)的油脂酶解液放入反應(yīng)管，加入步驟(4)的靜息乳酸菌菌懸液，加入適量0.1 mo I/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使得提取油脂終濃度為70-80 mg/mL, 32-36°C,90-110 rpm轉(zhuǎn)化22-26 h，得共軛亞油酸轉(zhuǎn)化液； (6)共軛亞油酸的提取:取步驟(5)的共軛亞油酸轉(zhuǎn)化液與正己烷按1:2-5的比例混合，快速混勻4-6 min, 3800 -5000 rpm離心4_6min,分為三層(脂相、乳化層和水相),去除最下層水相，然后加入適量蒸餾水，混勻4-6 min，洗滌水溶性物質(zhì)，離心分層去除下層水相，將脂相層通過無水硫酸鈉過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷即得到共軛亞油酸。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104388482SQ201410584037
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】巫小丹, 劉志鳳, 徐爾尼, 楊欣, 黎紫含, 葉新順, 張珊珊 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)