miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括血清中總RNA的提取步驟、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)、熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)、熒光定量PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳等步驟。本發(fā)明易操作、準(zhǔn)確，所采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，巧妙的運(yùn)用PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增，高效、靈敏的檢測(cè)miR-193。
【專(zhuān)利說(shuō)明】miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] microRNA (miRNA)是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為18?24個(gè)核苷酸的非編碼單 鏈RNA分子，普遍存在于各種生物中。miRNA在各種生理和病理過(guò)程中起重要的作用，并參 與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝及免疫 調(diào)節(jié)。這些miRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，通過(guò)抑制翻譯或斷裂靶mRNA而調(diào)節(jié)基因的 表達(dá)。miRNA并不是在發(fā)育的特定時(shí)段表達(dá)，而是更傾向于在特定細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。miRNA 的這種表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性，提示miRNA有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的 分子。近年來(lái)研究表明miRNA可作為一種新興的腫瘤標(biāo)志物。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-193可能 參與了血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，但miR-193在多發(fā)性骨髓（MM)中的表達(dá)調(diào)控研究尚未 見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，我們擬先建立一種miR-193的檢測(cè)方法，以期進(jìn)一步探討其與MM的關(guān) 系及可能的生物學(xué)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種易操作、準(zhǔn)確的miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是： 一種miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征是：包括下列步驟： (1) 血清中總RNA的提取步驟： 無(wú)菌吸取300μ1血清樣本于2.Oml的EP管中，向樣本中加入300μI2X變性溶 液，室溫下混合均勻后冰上孵育5min;再向混合液中加入600μ1酸化的酚-氯仿，渦旋 震蕩60s，常溫下20, 000 g，離心10min，直至界面被壓縮；然后移取上層水相約500μ1 于新的I. 5mlEP管中；同時(shí)向移取的水相液體中加入625μ1無(wú)水乙醇，混合均勻備用； 接著將試劑盒提供的過(guò)濾柱和收集管依次組裝完畢，并做好標(biāo)記；將先前加入625μ1無(wú) 水乙醇的水相液體混合液移取至過(guò)濾柱中，12, 000 g，離心30 s，棄液，保留收集管；然后向 復(fù)位的過(guò)濾柱中加入700μ1總RNA提取試劑盒的miRNA洗滌液1，12, 000g，離心15s; 向再?gòu)?fù)位的過(guò)濾柱中加入500μ1總RNA提取試劑盒的洗滌液2、3,12, 000g，離心15s， 棄液，保留收集管，空管12,000g,離心Imin,然后棄掉收集管及管中所有液體,并將過(guò)濾 柱安裝至新的收集管中，接下來(lái)向過(guò)濾柱中加入30?100μ1預(yù)熱的洗脫液，12, 000 g， 離心30s;收集管中的液體即是回收的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA溶液濃度及純 度，取吸光度值A(chǔ)260/A280在1. 8?2. 1用于實(shí)驗(yàn)； (2) 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系： RNA模板2μg，逆轉(zhuǎn)錄酶2μ1，雙蒸水補(bǔ)足至11μ1，混勻離心，70°C放置10min， 冰育2min，再加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（5Χ)5μ?，脫氧核糖核苷三磷酸混合液2 μ1，4〇υ/μ1的RNA酶抑制劑0. 5μ1，20〇υ/μ1的逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5μ?，雙蒸水補(bǔ)足至25 μ?，混勻，42°C60min，70°C10min;合成的cDNA放-80°C冰箱保存?zhèn)溆茫?(3) 熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)： 反應(yīng)體系：MaximaTMSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(2X)22.5μ1，正反向miRNA莖環(huán)引物各5μ1，逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物2μI，不含RNA酶的H20補(bǔ)足至50μI;95°C預(yù)變性 20s，l個(gè)循環(huán)；95°C10s，60°C20s，70°C31s，40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔； (4) 熒光定量PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳： 因miR-193和內(nèi)參U6分子量小，所以PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，且隨時(shí)觀察，防 止分子跑出膠外。
[0005] 對(duì)建立熒光定量PCR檢測(cè)miR-193的方法進(jìn)行特異性、重復(fù)性等方法學(xué)評(píng)價(jià)； 結(jié)果計(jì)算：反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)歷的PCR 循環(huán)次數(shù)Ct值；取一個(gè)樣本，連續(xù)3天內(nèi)分別對(duì)miR-193和U6進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性測(cè) 定，每次重復(fù)5復(fù)管。根據(jù)側(cè)得的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差s、變異系數(shù)CV值。批內(nèi)Ct值平均為 26. 3928,CV值為L(zhǎng)245% ;批間Ct值平均值 26. 4573,CV值為 3. 218%。
[0006] 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS15. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)資料，計(jì)算均數(shù) 3f)、標(biāo)準(zhǔn)差s和變異系數(shù)CV，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為0.05,兩組樣本間作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以 P〈0. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0007] 本發(fā)明易操作、準(zhǔn)確，所采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，巧妙的運(yùn)用PCR技術(shù) 的DNA高效擴(kuò)增，高效、靈敏的檢測(cè)miR-193。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1麗中miR-193和U6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0009] 圖2健康對(duì)照組中miR-193和U6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0010] 圖3MM和健康對(duì)照組外周血中U6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線。
[0011] 圖4MM和健康對(duì)照組外周血中miR-193的實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線。
[0012] 圖5miR-193和U6擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。（圖5中：N:健康對(duì)照組，M:MM患者， Mar:DNAmarker;marker左邊是miR-193,右邊是U6) 圖6批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0013]miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括下列步驟： 材料： 南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的MM患者56例，男32例，女24例，平均年齡（60 ± 11)歲，所 有病例均符合MM診斷標(biāo)準(zhǔn)。35名健康獻(xiàn)血者來(lái)自南通市中心血站，男20名，女15名，平均 年齡（58±9)歲。留取待檢者血清標(biāo)本2ml，用RNA提取試劑盒提取總RNA。miR-193和U6 小核RNA(U6snRNA)逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA莖環(huán)引物（上海睿安生物科技有限公司），總RNA 提取試劑盒（美國(guó)Life公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MaximaTMSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix (2X，立陶宛Fermentas公司），DNA分子標(biāo)記（大連Takara生物工程公司）。
[0014] (1)血清中總RNA的提取步驟 無(wú)菌吸取300μ1血清樣本于2.Oml的EP管中，向樣本中加入300μI2X變性溶 液，室溫下混合均勻后冰上孵育5min。再向混合液中加入600μ1酸化的酚-氯仿，渦旋 震蕩60s，常溫下20, 000g，離心10min，直至界面被壓縮，必要時(shí)可重復(fù)次步驟。然后移 取上層水相約500μ1于新的1.5mlEP管中。同時(shí)向移取的水相液體中加入625μ1 (約1. 25體積)無(wú)水乙醇(提前室溫放置)，混合均勻備用。接著將試劑盒提供的過(guò)濾柱和收 集管依次組裝完畢，并做好標(biāo)記。將先前加入625μ1無(wú)水乙醇的水相液體混合液移取至 過(guò)濾柱中，12, 000g，離心30s，棄液，保留收集管。然后向復(fù)位的過(guò)濾柱中加入700μ1 miRNA洗滌液1，12, 000g，離心15s。向再?gòu)?fù)位的過(guò)濾柱中加入500μ1洗滌液2/3工作 液，12, 000g，離心15s，棄液，保留收集管，空管12, 000g，離心Imin，然后棄掉收集管及 管中所有液體，并將過(guò)濾柱安裝至新的收集管中，接下來(lái)向過(guò)濾柱中加入30?100μ1預(yù) 熱的洗脫液，12,000g，離心30s。收集管中的液體即是回收的總RNA，采用紫外分光光度 計(jì)檢測(cè)RNA溶液濃度及純度，取吸光度值（A260/A280)在1. 8?2. 1用于實(shí)驗(yàn)。
[0015] ( 2 )逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系： RNA模板2μg，逆轉(zhuǎn)錄酶2μ1，雙蒸水補(bǔ)足至11μ1，混勻離心，70°C放置10min， 冰育2min，再加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（5Χ)5μ?，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)混 合液2μ1，RNA酶抑制劑（40U/μ1)0. 5μ1，逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μ1)0. 5μ1，雙蒸水補(bǔ) 足至25μ?，混勻，42°C60min，70°C10min。合成的cDNA放-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0016] ( 3 )熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)： 反應(yīng)體系：MaximaTMSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(2X)22.5μ1，正反向miRNA莖環(huán)引物（5μΜ)各5μ1，逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物2μI，不含RNA酶的H2O補(bǔ)足至50μ1。95°〇 預(yù)變性20s，l個(gè)循環(huán)；95°C10s，60°C20s，70°C31s，40個(gè)循環(huán)。每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔。 注：整個(gè)過(guò)程冰上操作。
[0017] ( 4 )熒光定量PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳： 因miR-193和內(nèi)參（U6)分子量小，所以PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，且隨時(shí)注意觀 察，防止分子跑出膠外。
[0018] ( 5 )對(duì)上述建立熒光定量PCR檢測(cè)miR-193的方法進(jìn)行特異性、重復(fù)性等方法學(xué) 評(píng)價(jià)。
[0019] 結(jié)果計(jì)算：反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)歷 的PCR循環(huán)次數(shù)（Ct值)。取一個(gè)樣本，連續(xù)3天內(nèi)分別對(duì)miR-193和U6進(jìn)行批內(nèi)和批間 的重復(fù)性測(cè)定，每次重復(fù)5復(fù)管。根據(jù)側(cè)得的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（s)、變異系數(shù)（CV)值。批 內(nèi)Ct值平均為26. 3928,CV值為L(zhǎng)245% ;批間Ct值平均值26. 4573,CV值為3. 218%。
[0020] ( 6 )統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS15. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)資料，計(jì)算均數(shù)(?)、標(biāo)準(zhǔn)差 (s)和變異系數(shù)（CV)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為〇.〇5,兩組樣本間作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以Ρ〈0. 05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【權(quán)利要求】
1. 一種miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征是：包括下列步驟： (1) 血清中總RNA的提取步驟： 無(wú)菌吸取300 ill血清樣本于2. O ml的EP管中，向樣本中加入300 ill 2X變性溶 液，室溫下混合均勻后冰上孵育5 min;再向混合液中加入600 iU酸化的酚-氯仿，渦旋 震蕩60 s，常溫下20, 000 g，離心10 min，直至界面被壓縮；然后移取上層水相約500 ill 于新的I. 5 ml EP管中；同時(shí)向移取的水相液體中加入625 ill無(wú)水乙醇，混合均勻備用； 接著將試劑盒提供的過(guò)濾柱和收集管依次組裝完畢，并做好標(biāo)記；將先前加入625 iU無(wú) 水乙醇的水相液體混合液移取至過(guò)濾柱中，12, 000 g，離心30 s，棄液，保留收集管；然后向 復(fù)位的過(guò)濾柱中加入700 ill總RNA提取試劑盒的miRNA洗滌液1，12, 000 g，離心15 s ; 向再?gòu)?fù)位的過(guò)濾柱中加入500 ii 1總RNA提取試劑盒的洗滌液2、3,12, 000 g，離心15 s， 棄液，保留收集管，空管12,000 g,離心I min,然后棄掉收集管及管中所有液體,并將過(guò)濾 柱安裝至新的收集管中，接下來(lái)向過(guò)濾柱中加入30?100 ill預(yù)熱的洗脫液，12, 000 g， 離心30 s ;收集管中的液體即是回收的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA溶液濃度及純 度，取吸光度值A(chǔ)260/A280在1. 8?2. 1用于實(shí)驗(yàn)； (2) 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系： RNA模板2 ii g，逆轉(zhuǎn)錄酶2 iil，雙蒸水補(bǔ)足至11 iil，混勻離心，70°C放置10 min， 冰育2 min，再加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（5X)5 yl，脫氧核糖核苷三磷酸混合液2 iil，40 U/ill的RNA酶抑制劑0.5 iil，200 U/ill的逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 iil，雙蒸水補(bǔ)足至25 Ul，混勻，42°C 60 min，70°C 10 min;合成的cDNA放-80°C冰箱保存?zhèn)溆茫? (3) 熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)： 反應(yīng)體系：MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix( 2 X )22. 5 ii 1，正反向 miRNA 莖環(huán)引物各5 iil，逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物2 ill，不含RNA酶的H20補(bǔ)足至50 ill ;95°C預(yù)變性 20 s，l個(gè)循環(huán)；95°C 10 s，60°C 20 s，70°C 31 s，40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔； (4) 熒光定量PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳： 因miR-193和內(nèi)參U6分子量小，所以PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，且隨時(shí)觀察，防 止分子跑出膠外。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征是：對(duì)建立熒 光定量PCR檢測(cè)miR-193的方法進(jìn)行特異性、重復(fù)性等方法學(xué)評(píng)價(jià)； 結(jié)果計(jì)算：反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)歷的PCR 循環(huán)次數(shù)Ct值；取一個(gè)樣本，連續(xù)3天內(nèi)分別對(duì)miR-193和U6進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性測(cè) 定，每次重復(fù)5復(fù)管。根據(jù)側(cè)得的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差s、變異系數(shù)CV值。批內(nèi)Ct值平均為 26. 3928, CV 值為 L 245% ;批間 Ct 值平均值 26. 4573, CV 值為 3. 218%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的miR-193實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其 特征是：統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 15. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)資料，計(jì)算均數(shù) J)、標(biāo)準(zhǔn)差s和變異系數(shù)CV，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a設(shè)為0.05,兩組樣本間作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以 P〈0. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104357567SQ201410617068
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】鞠少卿, 申嫻娟, 趙虬旻, 施維, 戚菁, 吳信華, 叢輝 申請(qǐng)人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院