實時熒光定量pcr方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中t-dna串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù)序列的 拷貝數(shù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是將外源基因?qū)胫参锘蚪M的一個有效可行的方 法，它已被廣泛應(yīng)用于如黃金水稻等作物的遺傳工程中，是當(dāng)代分子生物學(xué)的重要實驗方 法。在農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化過程中經(jīng)常出現(xiàn)多個T-DNA插入同一個位點和多插入位點的頻繁出 現(xiàn)，這些T-DNA串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)經(jīng)常會導(dǎo)致目標(biāo)基因的共抑制甚至是基因沉默，從而影響后 續(xù)的實驗。因此，一個高效簡便的篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因植物的方法對研宄植物的遺傳改良和 基因功能等方面有著重要的意義。
[0003] 傳統(tǒng)的DNA印記（Southern blot)對于檢測轉(zhuǎn)基因植物中基因的拷貝數(shù)是非常有 效和實用的方法。但是當(dāng)有大量的轉(zhuǎn)基因株系需要檢測時，用Southern blot這個方法就會 非常得費時費力。此外，Southern blot實際上檢測的是轉(zhuǎn)基因插入位點的數(shù)量，只有在轉(zhuǎn) 基因植物基因組酶切位點非常接近串聯(lián)結(jié)構(gòu)時，Southern blot可檢測到轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)， 而其他情況下，Southern blot均無法準(zhǔn)確的檢測轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。實時焚光定量PCR技 術(shù)最近被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的檢測，例如：水稻、甘蔗、棉花等。前人的研宄表明， 利用定量PCR來篩選大量的轉(zhuǎn)基因植物是一種可行的方式。然而還無法確定這種方法能否 在有大量轉(zhuǎn)基因株系的情況下快速、準(zhǔn)確的定量T-DNA的拷貝數(shù)。
[0004] 盡管有些研宄已經(jīng)證明，T-DNA串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)是在進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化過程之后形成的， 但是T-DNA串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理還不是完全清楚。總所周知，在T-DNA整合到基因組 DNA的過程中，植物DNA的插入位點和T-DNA的末端會有小的缺失，T-DNA的串聯(lián)重復(fù)序列 會含有T-DNA和質(zhì)粒的同源序列。然而，更深入的了解T-DNA重復(fù)之間填充的序列可能對 完全闡明T-DNA重復(fù)的形成有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中 T-DNA串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)的方法。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0007] -種實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)的方 法，步驟包括：
[0008] 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法將含有篩選基因BAR的植物表達(dá)載體pSKI015連 接上HMGA基因，轉(zhuǎn)入到野生型Col-4擬南芥中，獲得了 300個獨立轉(zhuǎn)基因株系；
[0009] 使用兩個參考質(zhì)粒如序列表，該兩個參考質(zhì)粒都含有一個編碼擬南芥高迀移率蛋 白HMGA的內(nèi)參基因，其中一個質(zhì)粒是將HMGA基因與PSKI015載體上的BAR基因連接，另一 個質(zhì)粒是將HMGA基因與含有左邊界LB和右邊界RB的T-DNA正向重復(fù)序列連接，分別形成 TOPO_HMGA_BAR 和 TOPO_HMGA_LR 兩個參考質(zhì)粒；
[0010] 將經(jīng)過草甘膦篩選的轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA作為檢測的 模板，分別使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物進(jìn)行實用定量PCR的方式檢測突變 體植物的拷貝數(shù)；
[0011] 計算公式：
【主權(quán)項】
1. 一種實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)的方 法，其特征在于，步驟包括： 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法將含有篩選基因 BAR的植物表達(dá)載體pSKI015連接上 HMGA基因，轉(zhuǎn)入到野生型Col-4擬南芥中，獲得了 300個獨立轉(zhuǎn)基因株系； 使用兩個參考質(zhì)粒如序列表，該兩個參考質(zhì)粒都含有一個編碼擬南芥高迀移率蛋白 HMGA的內(nèi)參基因，其中一個質(zhì)粒是將HMGA基因與PSKIOl5載體上的BAR基因連接，另一個 質(zhì)粒是將HMGA基因與含有左邊界LB和右邊界RB的T-DNA正向重復(fù)序列連接，分別形成 TOPO_HMGA_BAR 和 TOPO_HMGA_LR 兩個參考質(zhì)粒； 將經(jīng)過草甘膦篩選的轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為檢測的模 板，分別使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物進(jìn)行實用定量PCR的方式檢測突變體 植物的拷貝數(shù)； 計算公式：
t代表目標(biāo)T-DNA基因，r代表HMGA基因 艮的公式：Rt= (FatXFJ/Fbt2 Fat，F(xiàn)et，F(xiàn)bt分表代表植物目標(biāo)基因的熒光強(qiáng)度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù) 序列的拷貝數(shù)的方法，其特征在于，（1)應(yīng)用PCR引物5'actttcccaaattgctttttaaaatcc和 5' tgacaataatgaatgtttagcattacc，通過PCR方法克隆HMGA基因的DNA全長序列，酶切后連 接到植物表達(dá)載體PSKI015上，得到pSKI015-HMGA載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù) 序列的拷貝數(shù)的方法，其特征在于，（2)將構(gòu)建好的PSKI015-HMGA載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101， 轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選，抗性菌落再經(jīng)PCR引物 actttcccaaattgctttttaaaatcc 和 tgacaataatgaatgtttagcattacc 驗證 HMGA 基因的 有無，含有目的基因的農(nóng)桿菌再經(jīng)液體LB的培養(yǎng)，使菌液OD6cJ直達(dá)到0. 8-1. 2,將沒有開放 的擬南芥花序在前述準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌的菌液中浸沒1分鐘，避光保濕處理一天，之后，將擬 南芥放到正常條件下生長，以獲得轉(zhuǎn)基因種子，將收獲的種子接種在具有草甘膦的抗性篩 選培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的篩選，篩選獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥提取RNA，反轉(zhuǎn)錄。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù)序 列的拷貝數(shù)的方法，其特征在于，（1)中植物生長在16小時-18小時的光/暗條件下的人 工氣候室，光強(qiáng)為230 μ E/min/m2,溫度為20°C /17°C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種實時熒光定量PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)的方法，步驟包括：通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法將含有篩選基因BAR的植物表達(dá)載體pSKI015連接上HMGA基因，轉(zhuǎn)入到野生型Col-4擬南芥中；使用兩個參考質(zhì)粒連接載體；將經(jīng)過草甘膦篩選的轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為檢測的模板，分別使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物進(jìn)行實用定量PCR的方式檢測突變體植物的拷貝數(shù)。本發(fā)明的有益效果在于可以有效屏蔽T-DNA串聯(lián)結(jié)構(gòu)對識別轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的影響，而且定量PCR與Southern blot相比更加方便高效。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-65, C12N15-84, C12Q1-68
【公開號】CN104745696
【申請?zhí)枴緾N201510128008
【發(fā)明人】魏書, 席玉珍, 劉晶晶, 宋大鵬
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月23日