一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【專利摘要】一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括以下工藝步驟：1）從銅綠微囊藻提取總DNA；2）以銅綠微囊藻總DNA為模版通過(guò)PCR擴(kuò)增出vWA基因，所述的vWA基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示；3）將擴(kuò)增出的vWA基因與宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體；4）將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21（DE3），獲得基因工程菌。本發(fā)明得到的基因工程菌具有顯著吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子效果，本發(fā)明在構(gòu)建時(shí)采用廉價(jià)的大腸桿菌，不僅為治理環(huán)境中重金屬污染提供了新的思路，而且為治理環(huán)境中重金屬污染大大降低了成本。
【專利說(shuō)明】
一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌作為第一個(gè)可用于工業(yè)化大量生產(chǎn)的菌株，憑借其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，遺傳學(xué)背景清晰，容易培養(yǎng)，生長(zhǎng)速度快，目標(biāo)基因水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前最為常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和基因工程的完善，越累越多的領(lǐng)域利用大腸桿菌建造基因工程菌解決問(wèn)題。
[0003]vWA蛋白，包括252個(gè)氨基酸殘基，分子量約為30.2kD，從銅綠微囊藻中克隆獲得，數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析也顯示某結(jié)構(gòu)域中的MIDRS位點(diǎn)參與陽(yáng)離子膜轉(zhuǎn)運(yùn)。另外在動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)，vWA蛋白也被證實(shí)可通過(guò)刺激細(xì)胞中鈣離子通道來(lái)增強(qiáng)鈣離子的運(yùn)輸。
[0004]重金屬污染指由重金屬及其化合物造成的環(huán)境污染。主要由采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬超標(biāo)制品等人為因素所致。因具有毒性、易通過(guò)食物鏈在植物，動(dòng)物和人體內(nèi)累積，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。特別是隨著我國(guó)工業(yè)和城市化的不斷發(fā)展，工業(yè)和生活廢水排放、污水灌溉、汽車廢氣排放等造成的土壤重金屬污染問(wèn)題每況日下。
[0005]目前，重金屬污染的治理方法主要有化學(xué)治理法、工程治理法、生物治理法、農(nóng)業(yè)治理法，治污效果參差不齊。另外，穩(wěn)定固化法是相對(duì)更為有效且環(huán)保的措施，利用重金屬穩(wěn)化劑中的粒子吸附部分重金屬離子，吸附后的重金屬離子與穩(wěn)固劑發(fā)生離子交換反應(yīng)被穩(wěn)固劑所固定，進(jìn)一步通過(guò)非結(jié)晶及低結(jié)晶礦物的高度結(jié)晶化，使重金屬成為礦物中的微量成分。產(chǎn)生的結(jié)晶物質(zhì)可通過(guò)再結(jié)晶過(guò)程及粒子之間生成交錯(cuò)的晶體，形成強(qiáng)結(jié)構(gòu)的固化網(wǎng)，將固化的重金屬進(jìn)一步封固在固化網(wǎng)內(nèi)。此類方法治理范圍較廣泛，但相對(duì)治理費(fèi)用較貴。對(duì)于我國(guó)大量的污染現(xiàn)狀可行性有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0007]所述的一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)從銅綠微囊藻提取總DNA;
2)以銅綠微囊藻總DNA為模版通過(guò)PCR擴(kuò)增出vWA基因，所述的vWA基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示；
3)將擴(kuò)增出的vWA基因與宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體；
4)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，獲得基因工程菌。
[0008]所述的一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟2)中利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性引物上游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
[0009]所述的一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟2)宿主質(zhì)粒為pET28a。
[0010]所述的基因工程菌在重金屬污染治理中的應(yīng)用。
[0011]所述的基因工程菌在吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子中的應(yīng)用。
[0012]vWA蛋白在吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子中的應(yīng)用，所述的vWA蛋白的氨基酸序列如SEQID N0.4 所示。
[0013]本發(fā)明得到的基因工程菌具有顯著吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子效果，本發(fā)明在構(gòu)建時(shí)采用廉價(jià)的大腸桿菌，不僅為治理環(huán)境中重金屬污染提供了新的思路，而且為治理環(huán)境中重金屬污染大大降低了成本。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為重組質(zhì)粒pET-28b-W^的酶切結(jié)果分析;M:marker;l:重組質(zhì)粒pET-28b-VWA\
圖2為親和層析后目的蛋白SDS-PAGE圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0016]實(shí)施例1:
一、獲得vWA基因的編碼區(qū)DNA片段
銅綠微囊藻總DNA提取采用一管式植物DNA提取試劑盒(上海生工)進(jìn)行:取OD68q為0.1的銅綠微囊藻150mL，7000rmp離心lOmin，棄上清，用液氮研磨后，加入提取液按照說(shuō)明書提取總DNA。銅綠微囊藻vWA基因擴(kuò)增的正向引物為:ggatccATGTATCAAGAACTACTGAGTA;反向引物為:gcggccgcGCGTAATGCTCCTTGAGAAC;PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆至PMD18-T(上海生工)載體進(jìn)行測(cè)序。
[0017]擴(kuò)增得到的核苷酸序列如下(SEQID N0.1所示): ATGTATCAAGAACTACTGAGTAGCGCCAAGCCTGGATTTATCCTGATTATGATTGATCAGTCAGCTTCAATGT
CAGATAAATACGCTAATTCAAATAAAGCAGAGTTTGCCGCATTAGCCGTTAATCGAGTCATCGGAGAAATTATTACA
GCTTGTTCATCGGGTAATGAGATTAAAGACAGATGTTTTGTGGCGGTGGTTGGCTATGGAGCAAGTATTAGTATACT
ATTTCTAGACAAAGCCTCAGAGTTGGCTAAAAATCCCAATACAACAACCCTTAAGAGAAAAGTCTCTGATGGTGCAG
GTGGGTTGGTTGAAGTGGATGAAGTAATGCGAGTGTTTGTGAAACCGACTGCAAGTAATGGAACACCAATGGCTGAA
GCCTTTAAACAGGCTTATACTGGGGTAGAAAAATTTATTTCTAATCATCCCGATAGTTTTCCACCCGTTGTTATTAA
TATAACCGATGGAGAACCTAATGATTCTAGTGCTGCTACTACTGAAGCGAAAAAACTAGCACAACTTAAAACAAGTG
ACGGTAACGTGATTGTTTTGAATGCTCATATTTCTAACGCATCAGCAGGGAAAATAGAGTTACCTAGTGATAATGCT
GGTTTTAGCAATAATAAATTTGCTAACTTTTTGTTTGATATTTCCAGTGTGCTTCCTGATCCTCTTGCTGAGAGTGC
CAAAAATGCGGGTTTTAATGTTCAACCTAATGCCAGAGGTTTTATCTTTAATGCTGATGCTGAAGCACTGATTAAAC
TTCTTCAATTTGGTTCTCAAGGAGCATTACGCTAAo
[0018]其編碼的氨基酸序列如下(SEQ ID從).4所示): MYQELLSSAKPGFILIMIDQSASMSDKYANSNKAEFAALAVNRVIGEIITACSSGNEIKDRCFVAVVGYGASI
SILFLDKASELAKNPNTTTLKRKVSDGAGGLVEVDEVMRVFVKPTASNGTPMAEAFKQAYTGVEKFISNHPDSFPPV
VINITDGEPNDSSAATTEAKKLAQLKTSDGNVIVLNAHISNASAGKIELPSDNAGFSNNKFANFLFDISSVLPDPLA
ESAKNAGFNVQPNARGFIFNADAEALIKLLQFGSQGALR。
[0019]二、構(gòu)建含有目的基因的大腸桿菌重組表達(dá)載體pET-28a_
測(cè)序正確的PMD18-T-載體和pET28b(Novagen)分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶頂每切后，連接，將目的基因片段(vWA)插入pET28b，構(gòu)建pET28b- Wfd載體，獲得目標(biāo)基因融合有His-tag的重組表達(dá)載體。pET28b-W^經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL2UDE3)進(jìn)行重組蛋白(vWA)的功能研究。
[0020]三、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL2UDE3)，獲得基因工程菌
(1)菌株的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)
LB液體培養(yǎng)基配制:胰蛋白胨1g，酵母提取物5g，氯化鈉1g，蒸饋水1000 mL。
[0021 ] LB平板即LB固體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基添加15g/L瓊脂。
[0022]取于-70°C保存的大腸桿菌BL2UDE3)菌種，用滅菌牙簽沾取冰渣，劃線于LB平板(LB液體培養(yǎng)基+15g/L瓊脂)上，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時(shí)。用滅菌牙簽挑取單菌落放入含5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于30°C搖床(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)12小時(shí)。取500yL試管中菌液，轉(zhuǎn)入含50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37°C搖床(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)3小時(shí)，此時(shí)OD60Q=0.4 左右。
(2)感受態(tài)細(xì)胞的制備
培養(yǎng)液冰浴10分鐘，將90 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入2支50ml離心管中，4°C ,4500 r/min下離心5分鐘，棄上清液。用30 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，4°C，4500 r/min下離心3分鐘，棄上清液。用10 mL 0.1 mol/L CaCl2溶液溫和吸打懸浮沉淀，冰浴30分鐘，4°C，4000r/min下離心3分鐘，棄上清液。用2 mL 0.1 mol/L CaCb溶液溫和吸打懸浮沉淀，即制成感受態(tài)細(xì)胞。
(3)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
取感受態(tài)細(xì)胞菌液50yL，加入IyL含有目的基因的質(zhì)粒pET28b- vWA，輕輕吸打混勻，冰浴20分鐘。42 °C熱擊60秒，迅速置于冰上2分鐘。加入LB液體培養(yǎng)基200yL，37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)I小時(shí)。取培養(yǎng)后的菌液200yL，涂布于含卡那霉素的LB平板(卡那霉素含量50yg/mL)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)。
[0023]
四、重組蛋白分離純化
2XYT培養(yǎng)基配制:蛋白胨16 g，酵母提取物10 g，NaCl 5 g，蒸餾水100mL，pH 7.0。
[0024]含重組質(zhì)粒以及空質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL2UDE3)在37°C活化培養(yǎng)后，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含5 mL 2XYT培養(yǎng)基(含卡那霉素50yg/mL)中37 °(:振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液500 yL加入到含50 mL 2 XYT培養(yǎng)基(含卡那霉素50 yg/mL)中，37 °C搖床(轉(zhuǎn)速200 r/min)培養(yǎng)0D600至0.4，加入IPTG(0.50 mmol/L)誘導(dǎo)，20 °(:誘導(dǎo)培養(yǎng)0D600至1.0。離心收集菌體，保留上清液用于檢測(cè)。菌體沉淀加入BugBuster protein extract1n reagent(Merck公司)進(jìn)行溫和吸打懸浮，室溫孵育20 min后于4°C、14 000 r/min離心20 min，上清液和沉淀分別保存?zhèn)溆谩?br>[0025]經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)確定目標(biāo)蛋白所在的組分后，上清液采用His bindpurificat1n kit(Merck公司)進(jìn)行N1-NTA Resin親和柱層析，方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。重組蛋白由唑洗脫后在4 °(:條件下，10 mmol/L磷酸緩沖液PBS(pH 7.0)中進(jìn)行透析，更換磷酸緩沖液4次，共透析16 h以除去咪唑和NaCl等成分，透析后的蛋白經(jīng)Bradford法定量后進(jìn)行電泳分析，電泳圖中可以觀察到重組蛋白目的條帶(圖2)。上清液中蛋白來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)表明了目標(biāo)蛋白主要是胞內(nèi)的可溶性表達(dá)。可以看出利用N1-NTA Resin能成功純化出重組目標(biāo)蛋白，目標(biāo)帶相對(duì)較純，這說(shuō)明his-tag能有效的與鎳柱結(jié)合，達(dá)到高效分離純化轉(zhuǎn)移重金屬離子蛋白的目的。
[0026]結(jié)果顯示，0.1 mmol/L IPTG能顯著誘導(dǎo)重組蛋白的產(chǎn)生，大于此濃度后，對(duì)蛋白表達(dá)量的誘導(dǎo)效果不大，因此采取濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)。而在溫度37°C條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)的蛋白可溶性明顯增大，包涵體含量降低。
[0027]
實(shí)施例2:
一:感受態(tài)大腸桿菌重金屬暴露
感受態(tài)大腸桿菌菌株及對(duì)照組大腸桿菌，分別暴露在重金屬環(huán)境中(460 nM AgNPs/460 nM CuS04)，4小時(shí)后取樣，利用ICP-MS(Agilent 7500a, USA)檢測(cè)環(huán)境中以及大腸桿菌體內(nèi)的金屬含量。
[0028]二:環(huán)境內(nèi)金屬離子的檢測(cè)
AgNPs暴露下，對(duì)照組中AgNPs濃度約是感受態(tài)大腸桿菌培環(huán)境的1.23倍；同樣，CuSO4暴露下，對(duì)照組中AgNPs濃度約是感受態(tài)大腸桿菌環(huán)境的3.93倍。
[0029]三:大腸桿菌體內(nèi)金屬離子的檢測(cè)
AgNPs 暴露下，對(duì)照組 BL-21 (VWAQH)的體內(nèi) AgNPs 濃度為 0.46 ± 0.06 ng/(109 cells),感受態(tài)大腸桿菌BL-21 (VWAQH-1PTG)體內(nèi)AgNPs濃度為0.56±0.06ng/(109 cells)，是對(duì)照組的1.12倍；同樣，CuSO4暴露下，對(duì)照組的體內(nèi)CuSO4濃度為1.4±0.07ng/(19Cells)，感受態(tài)大腸桿菌體內(nèi)CuSO4濃度為7.81 ±2.30ng/(19 cells),是對(duì)照組的5.58倍。
[0030]實(shí)施例2說(shuō)明本發(fā)明得到的基因工程菌具有顯著吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子效果，能夠應(yīng)用于重金屬污染治理。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于包括以下工藝步驟: I)從銅綠微囊藻提取總DNA; 2 )以銅綠微囊藻總DNA為模版通過(guò)PCR擴(kuò)增出vWA基因，所述的vWA基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示； 3)將擴(kuò)增出的vWA基因與宿主質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組載體； 4)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3 )，獲得基因工程菌。2.如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟2)中利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性引物上游引物的核苷酸序列為SEQ IDN0.2所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。3.如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)移介質(zhì)中重金屬離子的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的步驟2)宿主質(zhì)粒為pET28a。4.通過(guò)權(quán)利要求1構(gòu)建的基因工程菌在重金屬污染治理中的應(yīng)用。5.通過(guò)權(quán)利要求1構(gòu)建的基因工程菌在吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子中的應(yīng)用。6.vWA蛋白在吸收或轉(zhuǎn)移重金屬離子中的應(yīng)用，所述的vWA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.4所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/31GK105907767SQ201610291594
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月5日
【發(fā)明人】錢海豐, 陳思, 朱錕
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)