一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒包含一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物，所述的一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下游引物；其通過(guò)檢測(cè)與阿爾茨海默病相關(guān)的Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度輔助診斷阿爾茨海默病，簡(jiǎn)單、方便，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確可靠、靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于阿爾茨海默病的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。
【專利說(shuō)明】一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及阿爾茨海默病的輔助診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種輔助診斷阿爾茨海 默病的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，尤其指一種能用于檢測(cè)與阿爾茨海默病相關(guān)的Kappa阿 片受體（KappaOpoioidRec印tor1，0PRK1)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的檢測(cè)試劑盒及其 檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimerdisease,AD)是一種系統(tǒng)性神經(jīng)退行性疾病，其臨床 表現(xiàn)為高級(jí)認(rèn)知功能低下，主要特征包括腦細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)及細(xì)胞外老年斑。阿爾茨 海默病患者需要終生護(hù)理，因此給社會(huì)和家庭帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。阿爾茨海默病是一種 由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而引起的復(fù)雜性疾病，尋找阿爾茨海默病相關(guān)基因進(jìn)而闡 明癡呆癥發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。雖然有越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)重視 并開(kāi)展阿爾茨海默病的病因研究，且研究多集中于相關(guān)候選基因的單核苷酸多態(tài)性與阿爾 茨海默病的關(guān)聯(lián)性上，但其發(fā)病機(jī)理仍未被完全闡釋清楚，這無(wú)疑妨礙了阿爾茨海默病預(yù) 防及治療水平的提高。
[0003] Kappa阿片受體（KappaOpoioidReceptor1，0PRK1)是G蛋白歐聯(lián)受體家族中 阿片受體中的一員。Kappa阿片受體是由位于8號(hào)染色體的Kappa阿片受體基因（Kappa OpoioidRec印torl，0PRKl)(chr8: 53225716. .53251697)編碼而成的。國(guó)內(nèi)外已有大量 研究報(bào)道了 0PRK1基因單核苷酸多態(tài)性與阿爾茨海默病發(fā)病的關(guān)系。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有公開(kāi)任何關(guān)于用于檢測(cè)與阿爾茨海默病相關(guān)的Kappa阿片受 體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的檢測(cè)試劑盒相關(guān)研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供檢測(cè)方便、針對(duì)性強(qiáng)、檢 測(cè)準(zhǔn)確率高的一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒；通過(guò)對(duì)樣品DNA甲基化水平測(cè)定 輔助診斷阿爾茨海默病，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為： 一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒包含一對(duì)Kappa阿片受 體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物，所述的一對(duì)Kappa 阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異 性下游引物： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5,-GTGGGTTTGGTGGGTAAT-3,； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5'-Biotin-CTCTTCTAAAAAACCACCCTATAACAT-3' ； 所述的甲基化特異性測(cè)序引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGTTTGGTGGGTAATT-3'。
[0007] 為優(yōu)化上述技術(shù)方案，采取的具體措施還包括： 一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：包括以下步驟： 步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測(cè)所得DNA的濃度； 步驟二：采用甲基化試劑盒對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化； 步驟三：取步驟二中轉(zhuǎn)化過(guò)的DNA樣本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶，并加入一對(duì) Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟四：焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備：在PSQ96板中預(yù)先加入45 yl含有0. 3 y M甲基化特 異性測(cè)序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉(zhuǎn)移到一個(gè)微量離心管中，在 瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，將PCR產(chǎn)物在常溫下 混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開(kāi)真空預(yù)備工作站的泵，將真 空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿 起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關(guān)掉泵； 將真空準(zhǔn)備工具放入含有甲基化特異性測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠；使用高純水 清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室 溫； 步驟五：焦磷酸測(cè)序：在焦磷酸測(cè)序儀上，采用Pyromark Gold Q24試劑盒對(duì)步驟四中 的PSQ96板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用PyroMark CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析。
[0008] 上述的步驟一中采用Lab-Aid 820全自動(dòng)核酸提取儀提取全血基因組DNA，再通 過(guò)Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。
[0009] 上述的步驟二中采用EZ DNA甲基化試劑盒。
[0010] 上述的步驟三中PCR擴(kuò)增條件為：首先95°ClOmin的變性；接著95°C30s，Tm 40s，72°C50s，共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C7min。
[0011] 上述的步驟五中焦磷酸測(cè)序儀采用PyroMark Q24焦磷酸測(cè)序。
[0012] 本發(fā)明一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，所述的檢測(cè)試 劑盒包含一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性 測(cè)序引物，所述的一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物包括甲基化 特異性上游引物和甲基化特異性下游引物；其優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)檢測(cè)與阿爾茨海默病相關(guān)的 Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度輔助診斷阿爾茨海默病，簡(jiǎn)單、方便，檢測(cè)效率高， 針對(duì)性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確可靠、靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于阿爾茨海默病的早期發(fā)現(xiàn)和 及時(shí)治療。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為被檢測(cè)序列所在區(qū)域以及3個(gè)CpG位點(diǎn)的相關(guān)性示意圖； 圖2為DNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0015] 一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒包含一對(duì)Kappa阿 片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物，所述的一對(duì) Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化 特異性下游引物： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5, -GTGGGTTTGGTGGGTAAT-3,； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CTCTTCTAAAAAACCACCCTATAACAT-3' ； 所述的甲基化特異性測(cè)序引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGTTTGGTGGGTAATT-3'。
[0016] 一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：包括以下步驟： 步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測(cè)所得DNA的濃度； 步驟二：采用甲基化試劑盒對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化； 步驟三：取步驟二中轉(zhuǎn)化過(guò)的DNA樣本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶，并加入一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟四：焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備：在PSQ96板中預(yù)先加入45yl含有0. 3yM甲基化特 異性測(cè)序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉(zhuǎn)移到一個(gè)微量離心管中，在 瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，將PCR產(chǎn)物在常溫下 混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開(kāi)真空預(yù)備工作站的泵，將真 空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿 起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關(guān)掉泵； 將真空準(zhǔn)備工具放入含有甲基化特異性測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠；使用高純水 清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C2分鐘，再冷卻到室 溫； 步驟五：焦磷酸測(cè)序：在焦磷酸測(cè)序儀上，采用PyromarkGoldQ24試劑盒對(duì)步驟四中 的PSQ96板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用PyroMarkCpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析。
[0017] 實(shí)施例中，步驟一中采用Lab-Aid820全自動(dòng)核酸提取儀提取全血基因組DNA，再 通過(guò)Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。
[0018] 實(shí)施例中，步驟二中采用EZDNA甲基化試劑盒。
[0019] 實(shí)施例中，步驟三中PCR擴(kuò)增條件為：首先95°ClOmin的變性；接著95°C30s，Tm 40s，72°C50s，共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C7min。
[0020] 實(shí)施例中，步驟五中焦磷酸測(cè)序儀采用PyroMarkQ24焦磷酸測(cè)序。
[0021] Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化水平導(dǎo)致阿爾茨海默病基因的低表 達(dá)，從而影響阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展。因此，Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平 與阿爾茨海默病的患病率呈正相關(guān)，以檢測(cè)阿爾茨海默病基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平為基礎(chǔ) 的診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)阿爾茨海默病的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針 對(duì)性強(qiáng)。
[0022] 下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與阿爾茨海默病的 患病率呈正相關(guān)。
[0023] 1、研究對(duì)象的收集 從寧波市某三甲醫(yī)院收集阿爾茨海默病患者，癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)世界衛(wèi)生組織的國(guó)際 疾病分類第10版（ICD-10)，阿爾茨海默?。ˋD)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用NINCDS-ADRDA標(biāo)準(zhǔn)。排除血 管性癡呆，路易體癡呆等疾病后，最后確定阿爾茨海默病人48例作為病例組（81. 23±9. 00 歲），同時(shí)收集年齡匹配且無(wú)癡呆家族史的58名正常者作為對(duì)照組（79. 68±7. 94歲）。對(duì) 所有研究對(duì)象在知情同意的前提下，抽血檢測(cè)載脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指標(biāo)，同 時(shí)抽取靜脈血3ml入EDTA抗凝管中，-80°C低溫儲(chǔ)存，以備用于標(biāo)本統(tǒng)一提取基因組DNA。
[0024] 2、基因組DNA的提取 應(yīng)用Lab-Aid820全自動(dòng)核酸提取儀（中國(guó)廈門(mén)，致善生物科技）提取上述步驟得到 的樣本的全血基因組DNA，再通過(guò)NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)，ThermoFisher Scientific)檢測(cè)所得DNA的濃度，以供0PRK1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的檢測(cè)。
[0025]3、DNA甲基化水平測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)的4個(gè)CpG位點(diǎn)（如圖1)進(jìn)行了DNA甲基化水平分析。此技術(shù)的基本原理：用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈 反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變 成了尿嘧啶（U)，然后通過(guò)測(cè)序引物進(jìn)行PCR測(cè)序，從而得到哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。本次 研究采用PyroMarkAssayDesign軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用于實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引 物如下： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5, -GTGGGTTTGGTGGGTAAT-3,； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CTCTTCTAAAAAACCACCCTATAACAT-3' ； 所述的甲基化特異性測(cè)序引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGTTTGGTGGGTAATT-3'。
[0026] DNA甲基化水平測(cè)定的具體步驟： 第一步：采用EZDNA甲基化試劑盒-Gold(EZDNAMethylation-Gold?Kit;ZYM0RESEARCH)對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。
[0027] 第二步：取第一步中轉(zhuǎn)化過(guò)的DNA樣本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶（Zymo Taq?PreMix，ZYM0RESEARCH)，并加入上述一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異 性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：首先95°C10min的變性；接著95°C30s，Tm40s， 72°C50s，共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C7min。（注：Tm在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)跑 PCR梯度溫度確定） 第三步：焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備：在PSQ96板中預(yù)先加入45yl含有0. 3yM上述甲基 化特異性測(cè)序引物的退火緩沖液（PyroMarkAnnealingBuffer;Qiagen);將需要使用的 混勻的瓊脂糖珠總量（每樣本3yl)轉(zhuǎn)移到一個(gè)微量離心管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩 沖液（PyroMarkBindingBuffer;Qiagen)，使得平均每個(gè)樣品約有50ii1的體積，將混合 物混勻；將以上混合物加入PCR產(chǎn)物（50ill反應(yīng)體積）中，每樣本50ill;將PCR產(chǎn)物在常 溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入 180ml的高純水、70%乙醇、洗漆緩沖液（PyroMarkWashBuffer;Qiagen;)和 120ml的變 性緩沖液（PyroMarkDenaturationSolution;Qiagen);打開(kāi)真空預(yù)備工作站的泵，將真 空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具（PyroMarkVacuumPr印Filter Probes;Qiagen)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠（在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此 操作）；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具 放入70%乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 - 10秒；關(guān) 掉泵；將真空準(zhǔn)備工具放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠（測(cè)序引物也可最后 加入）；使用高純水清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。
[0028] 第四步：焦磷酸測(cè)序：在PyroMarkQ24焦磷酸測(cè)序儀上，采用PyromarkGoldQ24 試劑盒（PyromarkGoldQ24Reagents;Qiagen)對(duì)第三步中的PSQ96板中的樣本進(jìn)行測(cè) 序，然后應(yīng)用PyroMarkCpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析（甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示例見(jiàn)圖 2)。圖2中所示百分?jǐn)?shù)為對(duì)應(yīng)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，如圖2所示CpGl到CpG3的甲基化 程度分別為5%，7%，22%。
[0029] 4、數(shù)據(jù)分析 本次實(shí)驗(yàn)采用SPSS16. 0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，我們發(fā)現(xiàn)：被檢測(cè)的3個(gè)CpG位點(diǎn)間 存在顯著關(guān)聯(lián)（相關(guān)系數(shù)r> 0.715,p〈 0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1)(注：p〈 0.05時(shí) 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下同），所以我們把CpGl-CpG3求平均值后參與到后續(xù)的分析中，發(fā)現(xiàn) 病例組和對(duì)照組之間的DNA甲基化水平存在顯著差異（p= 0.006,見(jiàn)表1)。因此，我們分 性別比較了病例組和對(duì)照組間阿爾茨海默病基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的差異，結(jié)果（見(jiàn)表 2)發(fā)現(xiàn)平均甲基化在男性中與阿爾茨海默病存在關(guān)聯(lián)（p= 0. 049)，而CpG3在女性中與阿 爾茨海默病相關(guān)（P= 0. 045)。
[0030] 圖1為被檢測(cè)序列所在區(qū)域：具體位置為Chr8:54163184. . 54163384;以及所檢測(cè) 的3個(gè)CpG點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果(例如CpGl與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0. 881，CpG2與CpG3 的相關(guān)系數(shù)為〇. 869)。
[0031] 表1病例組與對(duì)照組間的比較（n=106)

【權(quán)利要求】
1. 一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒，其特征是：所述的檢測(cè)試劑盒包含一對(duì) Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物，所述 的一對(duì)Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物包括甲基化特異性上游引物 和甲基化特異性下游引物： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5, -GTGGGTTTGGTGGGTAAT-3,； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CTCTTCTAAAAAACCACCCTATAACAT-3' ； 所述的甲基化特異性測(cè)序引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGTTTGGTGGGTAATT-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：其特 征是：包括以下步驟： 步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測(cè)所得DNA的濃度； 步驟二：采用甲基化試劑盒對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化； 步驟三：取步驟二中轉(zhuǎn)化過(guò)的DNA樣本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶，并加入一對(duì) Kappa阿片受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟四：焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備：在PSQ96板中預(yù)先加入45 yl含有0. 3 y M甲基化特 異性測(cè)序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉(zhuǎn)移到一個(gè)微量離心管中，在 瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，將PCR產(chǎn)物在常溫下 混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開(kāi)真空預(yù)備工作站的泵，將真 空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿 起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關(guān)掉泵； 將真空準(zhǔn)備工具放入含有甲基化特異性測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠；使用高純水 清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室 溫； 步驟五：焦磷酸測(cè)序：在焦磷酸測(cè)序儀上，采用Pyromark Gold Q24試劑盒對(duì)步驟四中 的PSQ96板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用PyroMark CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方 法：所述的步驟一中采用Lab-Aid 820全自動(dòng)核酸提取儀提取全血基因組DNA，再通過(guò) Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述 的步驟二中采用EZ DNA甲基化試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述 的步驟三中PCR擴(kuò)增條件為：首先95°C lOmin的變性；接著95°C 30s，Tm40s，72°C 50s， 共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C 7min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述 的步驟五中焦磷酸測(cè)序儀采用PyroMark Q24焦磷酸測(cè)序。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328201SQ201410657146
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】段世偉, 季慧慧, 王欽文, 劉桂利 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)