環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)b群鏈球菌的引物組及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的引物組及試劑盒，該引物組包括一對(duì)特異性?xún)?nèi)引物和一對(duì)特異性外引物，該試劑盒中包括若干個(gè)內(nèi)含18μL反應(yīng)液的反應(yīng)管、1管內(nèi)含10μL GBS DNA的陽(yáng)性對(duì)照管、1管內(nèi)含100μL無(wú)菌超純水的陰性對(duì)照管，本試劑盒針對(duì)GBS基因中高度保守、特異的cAMP基因設(shè)計(jì)引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，DNA提取過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要任何化學(xué)試劑，只需要沸水浴10min后離心即可，避免引入化學(xué)試劑對(duì)后續(xù)核酸擴(kuò)增的影響，而且對(duì)儀器設(shè)備及操作要求低，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，降低了檢測(cè)成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的引物組及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的引物組及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] B群鏈球菌（Group B Streptococcus，GBS)，又稱(chēng)無(wú)乳鏈球菌，兼性厭氧，革蘭陽(yáng)性 鏈球菌，正常寄居于陰道和腸道，屬于條件致病菌。GBS感染引起肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、軟組 織感染、敗血癥等。GBS可引起新生兒、孕婦和老年人感染，是新生兒敗血癥和腦膜炎最常 見(jiàn)的病原菌，以新生兒感染率最高。成年人的B鏈球菌群感染多發(fā)生于機(jī)體抵抗力低下時(shí)。 GBS寄居于母親泌尿道和胃腸道的黏膜，孕婦帶菌率4%?40%不等，可能在生產(chǎn)過(guò)程中傳 遞給他們的孩子。20世紀(jì)70年代，GBS感染成為導(dǎo)致新生兒早期死亡的主要原因，死亡率 高達(dá)50%。GBS感染的新生兒，幸存者中30% -50%有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括腦癱、 腦積水、發(fā)育障礙、智力障礙、聽(tīng)力或智力受損。GBS除了會(huì)造成新生兒感染外，懷孕婦女感 染GBS會(huì)出現(xiàn)早產(chǎn)，早期破水、羊膜腔炎，產(chǎn)后子宮發(fā)炎，甚至流產(chǎn)、死產(chǎn)。GBS是圍產(chǎn)期女性 泌尿生殖道感染和新生兒期重癥肺炎、敗血癥和腦膜炎的常見(jiàn)病原菌。新生兒的GBS感染 具有發(fā)病迅速、病死率高的特點(diǎn)，是新生兒的主要死亡原因，已引起世界范圍內(nèi)廣大學(xué)者的 深切關(guān)注。對(duì)孕婦進(jìn)行GBS篩查可及早發(fā)現(xiàn)感染，及時(shí)治療，有效控制GBS的危害。
[0003] 細(xì)菌培養(yǎng)是檢測(cè)GBS的標(biāo)準(zhǔn)方法，但此菌營(yíng)養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)，至少 2d，且陽(yáng)性率較低，給門(mén)診就醫(yī)患者帶來(lái)不便，尤其不能滿(mǎn)足孕檢篩查的需要。如何在感染 早期快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)GBS是臨床診斷關(guān)注的要點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球 菌的引物組及試劑盒。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的引物組，包括，特異性外引物F3 :其核苷 酸序列如SEQ ID NO :1所示；特異性外引物B3 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；特異 性?xún)?nèi)引物FIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；特異性?xún)?nèi)引物BIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :4 所示。
[0007] -種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的試劑盒，包括裝有18 μ L反應(yīng)液的反應(yīng) 管，裝有10 μ L GBS DNA的陽(yáng)性對(duì)照管，裝有100 μ L無(wú)菌超純水的陰性對(duì)照管，所述反應(yīng)液 內(nèi)含反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶、顯色液、外引物F3、外引物Β3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP ; 所述反應(yīng)緩沖液各組分的濃度如下：400mM的Tris-Hcl，pH8. 8 ;20mM的氯化鉀；20mM的硫 酸銨；16mM的硫酸鎂和0. 2% Tween2Q、l. 6M的甜菜堿、2. 8mMX4種dNTP ;Bst DNA聚合酶的 活性含量為：160單位/18 μ L ;顯色液為：錳離子鰲和型鈣黃綠素，0.001 μ mol/18 μ L ;F3 : 4pmol/18 μ L，B3 :4pmol/18 μ L ;FIP :32pmol/18 μ L，BIP :32pmol/18 μ L。
[0008] 所述試劑盒中裝有18 μ L反應(yīng)液的反應(yīng)管為8個(gè)，裝有10 μ L GBS DNA的陽(yáng)性對(duì) 照管1個(gè)，裝有100 μ L無(wú)菌超純水的陰性對(duì)照DNA管1個(gè)。
[0009] 所述試劑盒內(nèi)還含20個(gè)適配1-10 μ 1移液器的Tip頭。
[0010] 上述試劑盒的使用方法：將2 μ L待檢DNA加入反應(yīng)管內(nèi)，混勻，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和 陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照中加入GBS DNA，陰性對(duì)照中加入無(wú)菌超純水，將反應(yīng)管置水浴鍋中進(jìn) 行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：60_65°C水浴恒溫反應(yīng)30-40min，觀察顏色變化。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] 1.本試劑盒針對(duì)GBS基因中高度保守、特異的cAMP基因設(shè)計(jì)引物，采用環(huán)介導(dǎo)等 溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)。因?yàn)閿U(kuò)增效率高，特異性好，對(duì)DNA質(zhì)量和數(shù)量要求 不高，DNA提取過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要任何化學(xué)試劑，只需要沸水浴IOmin后離心即可，避免引入 化學(xué)試劑對(duì)后續(xù)核酸擴(kuò)增的影響，而且對(duì)儀器設(shè)備及操作要求低，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，降低了 檢測(cè)成本；
[0013] 2.針對(duì)GBS基因中高度保守、特異的cAMP基因中的6個(gè)片段，自行設(shè)計(jì)并優(yōu)選出 特異性高、反應(yīng)迅速、包含有4條引物的引物組，使得反應(yīng)可在30-40min內(nèi)完成；
[0014] 3.將每個(gè)反應(yīng)所需試劑預(yù)先混合并置于反應(yīng)管中，檢測(cè)時(shí)只需要在反應(yīng)管中加入 樣本DNA即可進(jìn)行反應(yīng)，避免因多次加樣帶來(lái)的污染及誤差，對(duì)操作人員要求低；而且試劑 盒中包含取樣所需移液器頭（Tip頭），不需要另外準(zhǔn)備耗材，進(jìn)一步降低污染，提高檢測(cè)的 精確度和便捷度；
[0015] 4.與文獻(xiàn)報(bào)道的反應(yīng)體系不同：反應(yīng)液包括2X反應(yīng)緩沖液（200mMTris-Hcl， pH8. 8 ;100mM氯化鉀；IOOmM硫酸銨；20mM硫酸鎂和1% TritonX-100、甜菜堿、dNTP、超純 水）、BstDNA聚合酶、引物組、熒光染料。反應(yīng)液采用Tris-HCl緩沖體系，更加穩(wěn)定；提高了 甜菜堿的濃度（I. 6M)，更好的保護(hù)Bst DNA聚合酶的活性，提高反應(yīng)效率；降低引物濃度， 提高了反應(yīng)的特異性，降低假陽(yáng)性；
[0016] 5.用于結(jié)果判斷的染料采用鈣黃綠素，反應(yīng)效率高，特異性好，只能檢測(cè)到LAMP 反應(yīng)而對(duì)常規(guī)PCR反應(yīng)無(wú)效，避免因核酸擴(kuò)增中的微弱PCR反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性；
[0017] 6.染料預(yù)先加到反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后不需要再打開(kāi)反應(yīng)管，避免了因形成氣溶膠 產(chǎn)生的DNA污染，有效保護(hù)反應(yīng)環(huán)境，避免后續(xù)檢測(cè)中的假陽(yáng)性；
[0018] 7.反應(yīng)快速，40min內(nèi)即可完成；設(shè)置結(jié)果判斷的時(shí)間范圍為30-40min，因?yàn)?40min以后可能產(chǎn)生假陽(yáng)性，所以40min以后的結(jié)果不予判讀，確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0019] 8.與同類(lèi)試劑盒相比，本試劑盒更加方便、快捷、特異、精確，對(duì)儀器設(shè)備和操作人 員要求低，不具有高級(jí)實(shí)驗(yàn)室的基層醫(yī)院也可以開(kāi)展，而且病人當(dāng)天就可拿結(jié)果，節(jié)約時(shí)間 和費(fèi)用，為治療爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。
[0020] 9.整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在恒溫下完成，不需要復(fù)雜的變溫設(shè)備；擴(kuò)增效率更高，是一般 PCR擴(kuò)增效率的10-100倍；耗時(shí)更少，一般PCR擴(kuò)增需要花費(fèi)2-3h，而LAMP擴(kuò)增只需要 0. 5-lh即可完成；結(jié)果可目視，容易判斷，無(wú)需電泳，節(jié)約時(shí)間，避免污染。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為L(zhǎng)AMP法目視鑒定GBS結(jié)果，其中，1號(hào)管為陰性對(duì)照，2號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，3 號(hào)管為檢測(cè)管；
[0022] 圖2為L(zhǎng)AMP法目視檢測(cè)試劑盒靈敏性結(jié)果，其中，1-6號(hào)管中加入的為倍比稀釋的 DNA，濃度依次為100、10、1、0· 1、0· 01、0· OOlng/μ 1，1-5號(hào)為陽(yáng)性，6號(hào)為陰性；
[0023] 圖3LAMP法目視檢測(cè)試劑盒特異性結(jié)果，1-8管依次為：B群鏈球菌質(zhì)控菌，B群鏈 球菌臨床分離株，A群鏈球菌，F(xiàn)群鏈球菌，星座鏈球菌，草綠色鏈球菌，肺炎鏈球菌，糞腸球 菌，1、2號(hào)管為陽(yáng)性，其它均為陰性；
[0024] 圖4LAMP法目視檢測(cè)臨床樣本結(jié)果，其中1，2，3為陽(yáng)性，4-20為陰性。。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0026] I. DNA 提取
[0027] (1)培養(yǎng)細(xì)菌的DNA提?。河靡凭h(huán)刮取固體平板上的菌落，置于含0. 2ml無(wú)菌雙 蒸水的EP管中，沸水浴8-10min，8000-12000rpm離心2_5min，取上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中， 即為樣本DNA，可直接用于LAMP反應(yīng)。
[0028] (2)臨床液體樣本的DNA提?。阂后w樣本10000-12000rpm離心5min，除去部分上 清液，留取下部分沉淀，沉淀與蒸餾水I : 1混合后置沸水中水浴8-lOmin后，8000-12000rpm 離心2-5min，取上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，即為樣本DNA，可直接用于LAMP反應(yīng)。
[0029] (3)臨床固體樣本的DNA提?。汗腆w樣本置于1倍體積蒸餾水中，沸水浴8-10min， 8000-12000rpm離心2-5min，取上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，即為樣本DNA，可直接用于LAMP反 應(yīng)。
[0030] (4)咽拭子等樣本的DNA提取：將拭子置于Iml蒸餾水中，充分震蕩，棄去拭子，按 照液體樣本方法提取DNA。
[0031] 2.引物設(shè)計(jì)及篩選
[0032] 根據(jù)GBS的cAMP基因序列設(shè)計(jì)引物組，每組引物包括一對(duì)特異性?xún)?nèi)引物和一對(duì)特 異性外引物，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間及特異性對(duì)不同引物的反應(yīng)進(jìn)程和結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測(cè)、篩選，確定反 應(yīng)快、特異性高的最佳引物。最佳引物序列見(jiàn)表1。
[0033] GBS的cAMP基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0034] 表1引物序列
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的引物組，其特征在于，包括，特異性外引物 F3 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；特異性外引物B3 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所 示；特異性?xún)?nèi)引物FIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；特異性?xún)?nèi)引物BIP :其核苷酸序 列如SEQ ID NO :4所示。
2. -種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)B群鏈球菌的試劑盒，其特征在于，包括裝有18 y L 反應(yīng)液的反應(yīng)管，裝有10uL GBS DNA的陽(yáng)性對(duì)照管，裝有l(wèi)OOiiL無(wú)菌超純水的陰性 對(duì)照管，所述反應(yīng)液內(nèi)含反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶、顯色液、外引物F3、外引物B3、內(nèi) 引物FIP、內(nèi)引物BIP ;所述反應(yīng)緩沖液各組分的濃度如下：400mM的Tris-Hc 1，pH8. 8 ; 20mM的氯化鉀；20mM的硫酸銨；16mM的硫酸鎂和0. 2% Tween2Q、l. 6M的甜菜堿、2. 8mMX4 種dNTP ;Bst DNA聚合酶的活性含量為：160單位/18iiL ;顯色液為：錳離子鰲和型鈣 黃綠素，0? 001 ii mol/18 ii L ;引物 F3 :4pmol/18 ii L，引物 B3 :4pmol/18 ii L ;引物 FIP : 32pmol/18 u L，引物 BIP :32pmol/18 u L。
3. 如權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，裝有18 yL反應(yīng)液的反應(yīng)管為8個(gè)，裝有 10 ii L GBS DNA的陽(yáng)性對(duì)照管1個(gè)，裝有100 ii L無(wú)菌超純水的陰性對(duì)照管1個(gè)。
4. 如權(quán)利要求2或3所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)還含20個(gè)適配1-10 yl 移液器的Tip頭。
5. 如權(quán)利要求2-4任一所述試劑盒的使用方法，其特征在于，將2 y L待檢DNA加入 反應(yīng)管內(nèi)，混勻，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，將反應(yīng)管置水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為： 6〇-65°C水浴恒溫反應(yīng)30-40min，觀察顏色變化。
【文檔編號(hào)】C12R1/46GK104328212SQ201410682430
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】楊煒華, 汪運(yùn)山, 裴鳳艷, 紀(jì)明宇, 曹翠明, 張芳, 田娟娟 申請(qǐng)人:濟(jì)南市中心醫(yī)院