檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的引物及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明針對轉(zhuǎn)基因作物，依據(jù)EGFP基因核苷酸序列開發(fā)設(shè)計強(qiáng)?；砸?，在EGFP基因上下游分別設(shè)計12個和13個引物，上下游引物共組合156對引物。通過3輪篩選出2對便于檢測EGFP的引物EGFP1和EGFP2。利用EGFP1和EGFP2為引物擴(kuò)增EGFP基因，其擴(kuò)增片段大小分別為445bp和294bp。本發(fā)明針對EGFP基因所開發(fā)篩選的兩對引物，可在轉(zhuǎn)基因PCR檢測中準(zhǔn)確檢測出可信的陽性轉(zhuǎn)基因材料，具有重要的實(shí)用價值。
【專利說明】檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的引物及其篩選方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的引物 及其篩選方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 綠色突光蛋白（Green fluorescent protein, GFP)是一類存在于包括水母、水螅 和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，在紫外光或藍(lán)光的激發(fā)下可發(fā)出綠色熒光，由于 該蛋白可活體檢測且具有對細(xì)胞無毒害等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)多個領(lǐng)域，尤其在 分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中GFP基因是一個非常常用的報告基因。
[0003] 目前應(yīng)用較多的GFP是增強(qiáng)型綠色突光蛋白（Enhanced Green fluorescent protein，EGFP)，其為GFP的突變體（64位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?，所發(fā)射的熒光強(qiáng)度比 GFP大6倍以上。因此，EGFP較GFP而言更適合作為一種報告基因來研究基因的表達(dá)、細(xì)胞 的分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等。
[0004] 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品日益增多，轉(zhuǎn)基因檢測成為一個必 不可少且至關(guān)重要的工作。轉(zhuǎn)基因檢測對象主要基于外源基因（啟動子、標(biāo)記基因、報告基 因和目的基因等）的核苷酸序列和蛋白表達(dá)產(chǎn)物，檢測方法中應(yīng)用最廣泛的是基于外源基 因核苷酸序列所建立的常規(guī)定性PCR(Polymerase Chain Reaction)檢測。
[0005] 常規(guī)PCR方法作為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法，具有操作簡易、成本費(fèi)用 低等優(yōu)點(diǎn)。但作為轉(zhuǎn)基因檢測方法，常規(guī)PCR檢測存在靈敏度低、容易產(chǎn)生交叉污染、假陽 性和假陰性比例偏高的缺點(diǎn)。以上問題的存在，很大程度上可能是由于檢測引物不夠特異。 本發(fā)明為解決轉(zhuǎn)基因常規(guī)PCR檢測中的常見問題，針對轉(zhuǎn)基因作物依據(jù)EGFP基因序列開發(fā) 設(shè)計?；砸?56對，并通過3輪有目的針對性的篩選，選出2對在實(shí)驗(yàn)操作中可以準(zhǔn)確 檢測EGFP基因的引物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了用于檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 (EGFP)的引物，其篩選方法與應(yīng)用為轉(zhuǎn)基因外源基因檢測引物的開發(fā)和篩選提供一定的科 學(xué)依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基 因的引物，其特征在于，所述引物為EGFP1或EGFP2 ;所述EGFP1的正向引物堿基序列如SEQ ID NO: 1所示，EGFPl的反向引物堿基序列如SEQ ID NO:2所示；所述EGFP2的正向引物堿 基序列如SEQ ID N0:3所示，EGFP2的反向引物堿基序列如SEQ ID N0:4所示。
[0008] -種檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的引物的篩選方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0009] 步驟A :采用PrimeU軟件設(shè)計檢測EGFP基因的強(qiáng)?；砸?，在基因上游設(shè)計 12個引物，命名為gfpFn(n = 1，…，12);在基因下游設(shè)計13個引物，命名為gfpRm(m = 1，"·，13);上下游引物分別兩兩組合，共組合156(12X13)對引物；
[0010] 步驟B :利用Karroten質(zhì)粒提取試劑盒提取EGFP的表達(dá)質(zhì)粒，利用植物基因組 DNA提取試劑盒分別提取轉(zhuǎn)基因作物葉片DNA和非轉(zhuǎn)基因作物葉片DNA ;
[0011] 步驟C :引物篩選的方式分為3輪，每輪篩選設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，第1輪篩選：利用 無菌水作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除去以無菌水為模板仍可擴(kuò)增出條帶的引物，篩選出64對 引物；第2輪篩選：利用第1輪篩選出的引物，以EGFP的表達(dá)質(zhì)粒DNA和無菌水為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，選出能擴(kuò)增出EGFP基因條帶并且在無菌水中擴(kuò)增不出條帶的引物，篩選出16對 引物；第3輪篩選：利用第2輪篩選出的引物，以質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因作物DNA、無菌 水4種為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選出能在質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因作物中擴(kuò)增出EGFP基因條帶、在非轉(zhuǎn) 基因作物及無菌水中擴(kuò)增不出條帶的引物，篩選出2對引物（EGFP1和EGFP2)。
[0012] 作為優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因作物為轉(zhuǎn)基因玉米，非轉(zhuǎn)基因作物為非轉(zhuǎn)基因玉米。
[0013] 作為優(yōu)選地，在所述步驟A中，檢測EGFP的強(qiáng)?；砸锏脑O(shè)計條件：Tm值 (melting temperature)為 50°C?60°C，以 58°C最佳；GC 含量為 50%?70%，以 55%最 佳；引物長度為17bp?24bp，以20bp最佳。
[0014] 作為優(yōu)選地，在所述步驟C中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為25. 0 μ 1，包括： 1. 〇 μ 1模板（除以無菌水為模板外，模板質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)基因作物DNA和非轉(zhuǎn)基因作物DNA濃 度均為20叩/4 1)，2.54 110\卩0?1311打61'，1.〇4 154 1]1〇1/1^?1'；[11161'，2.04 12.51111]1〇1/1^ dNTPs, 2. 0 μ 125mmol/L MgCl2, 0. 1 μ I 5U/ μ I rTaq, 16. 4 μ I ddH20〇
[0015] 作為優(yōu)選地，在所述步驟C中，PCR擴(kuò)增條件：94°C反應(yīng)3min ;94°C反應(yīng)40s，58°C 反應(yīng)40s，72°C反應(yīng)45s，重復(fù)38個循環(huán)；72°C反應(yīng)5min。
[0016] 作為優(yōu)選，在所述步驟C中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠（含 溴化乙錠〇· 5 μ g/ml)上以80V電壓電泳45min。
[0017] 以轉(zhuǎn)基因作物DNA為模板，利用EGFPl引物擴(kuò)增EGFP基因，其擴(kuò)增片段為445bp， 或利用EGFP2引物擴(kuò)增EGFP基因，其擴(kuò)增片段為294bp，則待檢材料為EGFP轉(zhuǎn)基因陽性材 料。
[0018] 本發(fā)明針對EGFP基因所開發(fā)篩選的兩對引物，可在轉(zhuǎn)基因 PCR檢測中準(zhǔn)確檢測出 可信的陽性轉(zhuǎn)基因材料，具有重要的實(shí)用價值，并且檢測引物開發(fā)和篩選方法為日后轉(zhuǎn)基 因外源基因檢測引物的設(shè)計提供一定科學(xué)依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為引物第一輪篩選電泳結(jié)果示意圖（部分）；
[0020] 圖2為引物第二輪篩選電泳結(jié)果示意圖（部分），其中第奇數(shù)（1、3、···、21、23)泳 道為EGFP的表達(dá)質(zhì)粒、其余泳道為無菌水；
[0021] 圖3為引物第三輪篩選電泳結(jié)果示意圖（部分），其中第1、2、3和4泳道分別為 EGFP的表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米和無菌水。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下以轉(zhuǎn)基因玉米為例，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，但并不限定本發(fā)明。 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手 冊（New York :Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或 Draper，J 等（1988)操 作技術(shù)規(guī)程或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無特殊 說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0023] 所用 DNA Maker 為 TaKaRa 公司生產(chǎn)的 DL500,由 DNA 片段 500bp、400bp、300bp、 200bp、150bp、100bp、50bp 組成，共 7 條帶。
[0024] 1、引物的開發(fā)
[0025] 利用 Primer3 軟件（http://frodo. wi. mit. edu/primer3/)，依據(jù) EGFP 基因核苷酸 序列（SEQ ID NO:5)開發(fā)設(shè)計強(qiáng)?；砸铮镌O(shè)計條件：Tm值（melting temperature) 設(shè)置為50°C?60°C，以58°C最佳；GC含量設(shè)置在50%?70%，以55%最佳；引物長度設(shè)置 在17bp?24bp，以20bp最佳。在基因上游設(shè)計12個引物，命名為gfpFn(n=l，…，12) (見表1);在基因下游設(shè)計13個引物，命名為gfpRm(m= 1，…，13)(見表2);上下游引物 分別兩兩組合，共組合156(12X13)對引物。
[0026] 表1用Primer3軟件在EGFP基因上游設(shè)計的12個引物序列
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的引物，其特征在于，所述引物為EGFP1或 EGFP2 ;所述EGFP1的正向引物堿基序列如SEQ ID N0:1所示，EGFP1的反向引物堿基序列 如SEQ ID N0:2所示；所述EGFP2的正向引物堿基序列如SEQ ID N0:3所示，EGFP2的反向 引物堿基序列如SEQ ID N0:4所示。
2. -種篩選權(quán)利要求1所述引物的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟A :采用Primed軟件設(shè)計檢測EGFP的強(qiáng)?；砸?，在基因上游設(shè)計12個引物， 命名為gfpFn(n= 1，…，12);在基因下游設(shè)計13個引物，命名為gfpRm(m= 1，…，13);上 下游引物分別兩兩組合，共組合156對引物； 步驟B :利用Karroten質(zhì)粒提取試劑盒提取EGFP的表達(dá)質(zhì)粒，利用植物基因組DNA提 取試劑盒分別提取轉(zhuǎn)基因作物葉片DNA和非轉(zhuǎn)基因作物葉片DNA ; 步驟C :引物篩選的方式分為3輪，每輪篩選設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，第1輪篩選：利用無菌 水作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除去以無菌水為模板仍可擴(kuò)增出條帶的引物；第2輪篩選：利用 第1輪篩選出的引物，以EGFP的表達(dá)質(zhì)粒DNA和無菌水為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選出能擴(kuò)增 出EGFP基因條帶并且在無菌水中擴(kuò)增不出條帶的引物；第3輪篩選：利用第2輪篩選出的 引物，以質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因作物DNA、無菌水4種為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選出能在 質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因作物中擴(kuò)增出EGFP基因條帶、在非轉(zhuǎn)基因作物及無菌水中擴(kuò)增不出條帶的 引物。
3. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因作物為轉(zhuǎn)基因玉米，非轉(zhuǎn)基因 作物為非轉(zhuǎn)基因玉米。
4. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟A中，檢測EGFP的強(qiáng)?；砸?物的設(shè)計條件：!'111值為501：?601：，6(：含量為50%?70%，引物長度為17&--2你？。
5. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟C中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系： 總反應(yīng)體積為 25. 0 iil，包括：1. 0 ill 模板，2. 5 ill lOXPCRbuffer, 1. 0 iil5 ii mol/L Primer, 2. 0 u 1 2. 5mmol/L dNTPs, 2. 0 u 1 25mmol/L MgCl2, 0. 1 u 1 5U/ u 1 rTaq, 16. 4 u 1 ddH20。
6. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟C中，PCR擴(kuò)增條件：94°C反應(yīng) 3min ;94°C反應(yīng) 40s, 58°C反應(yīng) 40s, 72°C反應(yīng) 45s,重復(fù) 38 個循環(huán)；72°C反應(yīng) 5min。
7. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟C中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量體 積分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠上以80V電壓電泳45min。
8. 按照權(quán)利要求1所述一種檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的引物的應(yīng)用，其特征在 于，以轉(zhuǎn)基因作物DNA為模板，利用EGFP1引物擴(kuò)增EGFP基因，其擴(kuò)增片段為445bp，或利用 EGFP2引物擴(kuò)增EGFP基因，其擴(kuò)增片段為294bp，則待檢材料為EGFP轉(zhuǎn)基因陽性材料。
【文檔編號】C12N15/10GK104404148SQ201410696383
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】葛敏, 張曉林, 趙涵 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院