一種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，包括：將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，并在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發(fā)酵紅棗汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅棗汁。本發(fā)明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅棗汁中，吡咯喹啉醌含量達(dá)到70-95ng/mL，納豆激酶活力達(dá)到440-930U/mL。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對(duì)心血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標(biāo)志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (Nattokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個(gè)氨基酸殘基組成，分子量27KD左右， 無(wú)毒、無(wú)副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過(guò)溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預(yù)防動(dòng)脈硬化、心臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對(duì)消化系統(tǒng)的作用：大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人體吸收。Ig納豆中含有10億個(gè)以上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可以抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的痢疾桿菌等腐敗菌，促進(jìn)乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細(xì)菌平 衡，預(yù)防痢疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過(guò)納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纖維素酶和脲酶等酶群，這些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進(jìn)消化吸收。納豆芽 孢桿菌在通過(guò)分解利用大豆蛋白進(jìn)行繁殖的過(guò)程中，可以產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護(hù)作用，飲酒時(shí)可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對(duì)免疫系統(tǒng)的作用：通過(guò)接種納豆菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆可以提高機(jī)體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可以誘發(fā)機(jī)體干擾素生成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草甙、維生素 B2、維生素 E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進(jìn)肌膚光滑；
[0006] ④促進(jìn)骨骼發(fā)育：維生素 K2可促進(jìn)鈣與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進(jìn)骨骼形成，在骨骼形 成過(guò)程中起著重要作用，而納豆中維生素1(2含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預(yù)防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標(biāo)志性生理活性 物質(zhì)-批咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷 酸之后在細(xì)菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，化學(xué)名稱(chēng)為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細(xì)菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會(huì)泛夠合成 PQQ，但在各種植物、動(dòng)物以及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學(xué)家測(cè)定了 26種常見(jiàn)食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達(dá)到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動(dòng)物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時(shí)會(huì)引起哺乳動(dòng)物諸多代謝障礙，被認(rèn)為是一種新型維生 素。PQQ對(duì)哺乳動(dòng)物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能：PQQ作為人類(lèi)發(fā)育的必要因子，能刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)， 尤其是激活人體B細(xì)胞、T細(xì)胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷：PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對(duì)肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對(duì)人體的傷害=PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對(duì)人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如心臟病、癌 癥以及各類(lèi)炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。篜QQ在體內(nèi)能促進(jìn)神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾??；
[0013] ⑤促進(jìn)氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進(jìn)氨基酸吸收；
[0014] ⑥促進(jìn)生長(zhǎng)因子合成：生長(zhǎng)因子是人類(lèi)生長(zhǎng)的激素，PQQ能刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)，增 加細(xì)胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長(zhǎng)機(jī)能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥：PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細(xì)胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑧促進(jìn)谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進(jìn)機(jī)體谷胱甘肽合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強(qiáng)的抗癌功能：PQQ激活自然殺傷細(xì)胞（NK)細(xì)胞為ANK細(xì)胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細(xì)胞；封閉腫瘤細(xì)胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細(xì)胞溶解死亡；阻止腫 瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，促其凋亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨(dú)有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 孢桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽孢桿菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物（GRAS微生 物），對(duì)納豆芽孢桿菌進(jìn)行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對(duì)于 人們?cè)谌粘ｏ嬍持醒a(bǔ)充N(xiāo)K和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。
[0019] 紅棗又名大棗，其突出特點(diǎn)是維生素含量非常高，有"天然維生素丸"的美譽(yù)。中 醫(yī)理論認(rèn)為紅棗味甘性溫，歸脾胃經(jīng)，有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神、緩和藥性的功效；而現(xiàn)代藥理 學(xué)則發(fā)現(xiàn)，紅棗含有蛋白質(zhì)、脂肪、醣類(lèi)、有機(jī)酸、Va、Vc、鈣、氨基酸等，具有豐富藥理作用 ： (1)紅棗能促進(jìn)白細(xì)胞生成，降低血清膽固醇，提高血清白蛋白，保護(hù)肝臟，紅棗中還含有抑 制癌細(xì)胞，甚至可使癌細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。大棗含多種三萜類(lèi)化合物，其中燁木 酸、山植酸均發(fā)現(xiàn)有抗癌活性，對(duì)肉瘤S-180有抑制作用。棗中所含營(yíng)養(yǎng)素能夠增強(qiáng)人體免 疫功能，對(duì)于防癌抗癌和維持人體臟腑功能都有一定效果；（2)經(jīng)常食用鮮棗者很少患膽 結(jié)石，這是因?yàn)轷r棗中富含Vc，使體內(nèi)多余膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，膽固醇少了，結(jié)石形成概 率也就隨之減少；（3)棗中富含鈣和鐵，對(duì)防治骨質(zhì)疏松、產(chǎn)后貧血有重要作用，中老年人 更年期經(jīng)常會(huì)骨質(zhì)疏松，正在生長(zhǎng)發(fā)育高峰的青少年和女性容易發(fā)生貧血，大棗對(duì)他們會(huì) 有十分理想的食療作用；(4)大棗富含糖類(lèi)物質(zhì)，主要為葡萄糖，也含有果糖、蔗糖，以及由 葡萄糖和果糖組成的低聚糖、阿拉伯聚糖及半乳醛聚糖等，并含有大量Vc、核黃素、硫胺素、 胡蘿卜素、尼克酸等多種維生素，具有較強(qiáng)補(bǔ)養(yǎng)作用，能提高人體免疫功能，增強(qiáng)抗病能力， 具有補(bǔ)虛益氣、養(yǎng)血安神、健脾和胃等功效，對(duì)病后體虛者有良好滋補(bǔ)作用，也是脾胃虛弱、 氣血不足、倦怠無(wú)力、失眠等患者良好的保健營(yíng)養(yǎng)品；(5)紅棗所含的蘆丁是一種使血管軟 化從而降低血壓的物質(zhì)；(6)抗過(guò)敏、除腥臭怪味、寧心安神、益智健腦、增強(qiáng)食欲；（7)能增 強(qiáng)肌力、消除疲勞、擴(kuò)張血管、增加心肌收縮力、改善心肌營(yíng)養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)小鼠每日灌服大棗煎 齊IJ，共3周，體重增加較對(duì)照組明顯升高，并且在游泳試驗(yàn)中，其游泳時(shí)間較對(duì)照組明顯延 長(zhǎng)，表明大棗有增強(qiáng)肌力和增加體重的作用；(8)對(duì)四氯化碳肝損傷的家兔，每日喂給大棗 煎劑共1周，結(jié)果血清總蛋白與白蛋白較對(duì)照組明顯增加，表明大棗有保肝作用；(9)大棗 乙醇提取物能抑制抗體產(chǎn)生，對(duì)小鼠反應(yīng)性抗體也有抑制作用，提示大棗具有抗變態(tài)反應(yīng) 作用；（10)大棗中所含有黃酮（雙-葡萄糖甙A)有鎮(zhèn)靜、催眠和降壓作用，其中被分離出 的柚配質(zhì)C糖甙類(lèi)有中樞抑制作用，即降低自發(fā)運(yùn)動(dòng)及刺激反射作用、強(qiáng)直木僵作用，故大 棗具有安神、鎮(zhèn)靜之功；（11)紅棗富含的環(huán)磷酸腺苷是人體能量代謝的必需物質(zhì)，能增強(qiáng) 肌力、消除疲勞、擴(kuò)張血管、增加心肌收縮力、改善心肌營(yíng)養(yǎng)，對(duì)防治心血管疾病有良好的作 用；（12)對(duì)急慢性肝炎、肝硬化、貧血、過(guò)敏性紫癜等癥有較好療效。
[0020] 紅棗汁保留了紅棗營(yíng)養(yǎng)成分。本發(fā)明通過(guò)選育納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌及其共 發(fā)酵，開(kāi)發(fā)出富含NK和PQQ的食療發(fā)酵紅棗汁。但如果干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌在同一 體系中生長(zhǎng)不平衡會(huì)導(dǎo)致一種菌在競(jìng)爭(zhēng)中排斥另一種，共發(fā)酵無(wú)法順利進(jìn)行。關(guān)于生理特 性，即使在野生狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解蛋 白質(zhì)獲得必需氨基酸的能力不足，而納豆芽孢桿菌具有較強(qiáng)蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn) 生氨基酸和肽可滿(mǎn)足乳酸菌對(duì)氨基酸的需求。納豆芽孢桿菌兼性厭氧，通過(guò)消耗氧氣也促 進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴(yán)格 偏利共生關(guān)系外，更通過(guò)選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Met-)而與納 豆芽孢桿菌形成嚴(yán)格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌的共發(fā)酵順利 進(jìn)行。
[0021] 納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無(wú)法通過(guò)理性?xún)?yōu) 化手段提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類(lèi)、核苷酸四大有 機(jī)物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性（Rigidity)又 顯示出柔性（Plasticity)，處于嚴(yán)格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動(dòng)全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點(diǎn)理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對(duì)整個(gè)代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點(diǎn)但又相關(guān)的途徑進(jìn)行協(xié)同突變后，會(huì)表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性?xún)?yōu)化手段（Unrational optimization technique),對(duì)所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變,并通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，即可實(shí)現(xiàn)提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標(biāo)。
[0022] 隨機(jī)突變是最常見(jiàn)的非理性?xún)?yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突 變庫(kù)，但在突變庫(kù)中，各突變位點(diǎn)往往是分散獨(dú)立于單個(gè)細(xì)胞中，相互之間無(wú)法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見(jiàn)表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒(méi)于突變庫(kù)中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排（Genome Shuffling)是在隨機(jī)突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過(guò)隨機(jī)突變產(chǎn)生突變位點(diǎn)數(shù)量足夠大的突變庫(kù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò) 細(xì)胞融合使各突變位點(diǎn)優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級(jí)上升特別是增加大量表型可見(jiàn)突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)這種柔性進(jìn)行多點(diǎn)協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐。Zhang等（2002)首先以傳統(tǒng)誘變方法獲得一個(gè)突變庫(kù)，篩選出若干個(gè)正向突變株作為 出發(fā)株，然后通過(guò)多輪遞推原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機(jī)重組，實(shí)現(xiàn)基因組重排，最 終從突變庫(kù)中篩選出性狀被提升的目的菌株；St印hanopoulos (2002)通過(guò)基因組重排改 造了細(xì)菌表型；Patnaik等（2002)利用基因組產(chǎn)品技術(shù)實(shí)現(xiàn)了乳酸桿菌的一株工業(yè)菌株 的改良，令其在pH 4.0下乳酸產(chǎn)量為出發(fā)野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過(guò)兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobutylicum CICC 8012 產(chǎn) Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通過(guò)基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10， 其對(duì)五碳糖和六碳糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到69. 48 %和100%，而出發(fā)菌株為14. 83 %和100%， 乙醇產(chǎn)率達(dá)到47.08g/L，而出發(fā)菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過(guò)基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產(chǎn)普魯藍(lán)多糖大幅度提高，并且遺傳穩(wěn)定；Zheng等（2010)通 過(guò)基因組重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產(chǎn)率和耐 酸性；John等（2008)通過(guò)原生質(zhì)體融合式的基因組重排，獲得了以木薯-甘蔗渣為基質(zhì) 的乳酸商廣菌株；Yu等（2008)通過(guò)基因組重排獲得了糖耐度提商從而乳酸廣率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過(guò)基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產(chǎn) 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0024] 基因組重排也為進(jìn)行微生物代謝組學(xué)分析提供了支撐。經(jīng)過(guò)基因組重排而代謝 優(yōu)化的目的菌其遺傳背景來(lái)源于出發(fā)菌，故通過(guò)比對(duì)目的菌與出發(fā)菌的蛋白表達(dá)譜差異， 輔以代謝流和代謝控制分析技術(shù)，即可解析導(dǎo)致代謝優(yōu)化的關(guān)鍵酶及有關(guān)途徑的調(diào)控機(jī) 制。Luo 等（2012)通過(guò)基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)產(chǎn)率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達(dá)譜發(fā)生 明顯改變，34種蛋白表達(dá)上升而20種蛋白表達(dá)下降，提示與游霉素合成有關(guān)的牽涉廣泛的 代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化；Zhang等（2010)通過(guò)基因組重排，使Propionibacterium shermanii產(chǎn) Vb12大幅度提高，重排后菌株38種蛋白表達(dá)發(fā)生改變，其中22種蛋白表達(dá)上升而16種蛋白 表達(dá)下降，在表達(dá)上升的22種蛋白中，有6種是V b12合成途徑中的酶，提示與V B12合成有關(guān) 的牽涉廣泛的代謝網(wǎng)絡(luò)得到優(yōu)化。
[0025] 但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間 無(wú)關(guān)聯(lián)，使得選育到的菌株在發(fā)酵時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率遠(yuǎn)低于預(yù)期。針對(duì)此問(wèn)題，本發(fā)明在進(jìn)行 基因組重排選育時(shí)，選育平板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高 產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。因此， 在對(duì)納豆芽孢桿菌高產(chǎn)NK兼PQQ表型進(jìn)行基因組重排選育時(shí)，在選育平板中添加一定比例 紅棗汁，而在紅棗汁發(fā)酵時(shí)則添加一定比例豆芽汁。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0026] 本發(fā)明提供了一種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法。本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基 礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對(duì)納豆芽孢桿菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān) 的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié) 同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，獲得能夠在紅棗汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢 桿菌BN-NKPQQ-RWX-701。同時(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（Met_)干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei Shirota-Meif，LcS-MeO。LcS-Meif在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-701，但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的紅棗汁。
[0027] -種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，包括以下步驟：
[0028] 1)、將產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn)行亞硝基 胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，高通量篩選得到高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽 孢桿菌 BN-NKPQQ-RWX-701 ;
[0029] 細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽孢桿菌10261和10623所有誘變后 代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合。如有必要，可對(duì)融合后代進(jìn)行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生長(zhǎng)旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ納豆 芽孢桿菌。
[0030] 2)、將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Meif (Lactobacillus casei Shirota-Met-)；
[0031] 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701和干酪乳桿菌LcS-Mef共發(fā)酵紅棗汁，得 至IJ富含NK和PQQ的紅棗汁，得到的富含NK和PQQ的紅棗汁即為食療發(fā)酵紅棗汁。
[0032] 本發(fā)明在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，對(duì)納豆芽孢桿 菌所有可能與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而 通過(guò)高通量篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯，獲得能夠在紅棗汁發(fā)酵中高產(chǎn) NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701。同時(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷 (Met )干釀乳桿菌LcS-Met。
[0033] 欲使干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌順利共發(fā)酵，兩者之間應(yīng)形成共生關(guān)系。本發(fā) 明的策略是使通常情況下競(jìng)爭(zhēng)占優(yōu)的干酪乳桿菌成為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（LcS-MeO，從 而在代謝上對(duì)納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701形成依賴(lài)，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽孢桿菌供給，即形成嚴(yán)格的偏利共生關(guān)系。雖然LcS-Mef在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-701，但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)，兩菌之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā)酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的紅棗汁。
[0034] 所用納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級(jí)安全微生物，共發(fā)酵得到的富含NK 和PQQ的紅棗汁中，PQQ含量達(dá)到70-95ng/mL。NK活力達(dá)到440-930U/mL。所獲得的紅棗 汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有紅棗汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0035] 步驟1)中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆芽孢 桿菌10261來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中 路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽孢桿菌10263來(lái)自中 國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota) 來(lái)自養(yǎng)樂(lè)多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購(gòu)自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-013。
[0036] 所述的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性基因組重排后的高通量篩選具體包括：①制備2個(gè)平板豆 芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（紅棗汁占平板總量的10% -15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿 菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€(gè)平板后，再用纖維素膜影印 至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠?周?chē)纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大?。虎芷桨錌中，高 產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬赏该魅?，根?jù)透明圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低； ⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的 納豆芽孢桿菌。
[0037] 所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701保藏于斜面豆芽汁紅 棗汁固體培養(yǎng)基中。
[0038] 所述的平板豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基以IL計(jì)， 由以下量的組分組成：
[0039] 紅棗汀 100?150mL; 鹿糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0040] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的平板豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基和斜面豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng) 基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
[0041] 紅棗汁 100-150mL； 蔗糖 5.0g;
[0042] 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0043] 所述的豆芽汁的制備：剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL后過(guò) 濾，得到豆芽汁。
[0044] 該平板豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通量 篩選。該斜面豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌保藏。
[0045] 本發(fā)明中，采用基因組重排技術(shù)選育納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701時(shí)，選育平 板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分（紅棗汁），而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，促使選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的 菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。
[0046] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：① 制備2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D)，為平板D ;②將誘變后的干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei Shirota)涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè) 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落 而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營(yíng) 養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Met^保藏于斜面MRS固體培養(yǎng)基中。
[0047] 所述的平板MRS固體培養(yǎng)基和斜面MRS固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組 成：
[0048] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.Og; 豐寧檬酸氫二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g;
[0049] 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6.2?6.4。
[0050] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0051] 本發(fā)明中，采用隨機(jī)誘變技術(shù)獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿 菌（Lactobacillus casei Shirota-Meif，LcS-Meif)。LcS-Meif在生長(zhǎng)速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-701，但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，通過(guò)構(gòu)建共生關(guān) 系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵，獲得富含NK和PQQ的紅棗汁。
[0052] 步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-701和LcS_Met_*別進(jìn)行活化培 養(yǎng)，BN-NKPQQ-RWX-701在豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36°C (優(yōu)選35°C )，LcS-Met-在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38°C (優(yōu) 選 37。。）。
[0053] 所述的豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
[0054] 紅麥汁 100 ?1 SOmT,；
[0055] 蔗糖 4· 0 ?6. Og ;
[0056] 豆芽汁余量。
[0057] 所述的豆芽汁紅麥汁液體培養(yǎng)基以IL計(jì),優(yōu)選的，由以下量的組分組成：
[0058] 紅棗汁 100 ?150mL ;
[0059] 蔗糖 5. Og ;
[0060] 豆芽汁余量。
[0061] 該豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL后過(guò)濾，得到豆芽汁。
[0062] 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
[0063] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二銨 2.Og;
[0064] 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g: 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6.2?6.4。
[0065] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0066] 將BN-NKPQQ-RWX-701和LcS-Met_*發(fā)酵含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體包括：將活 化后的BN-NKPQQ-RWX-701和LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含紅棗汁的 發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含NK和PQQ的紅棗汁。
[0067] 所述的含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
[0068] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 0.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽汁 I OOmL; 紅棗汁 余量。
[0069] 所述的紅棗汁的制備包括：水中加去核鮮紅棗，碾磨成漿汁。具體地如IOOmL水中 加10?25g去核鮮紅棗，碾磨成漿汁。
[0070] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-701和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0071] 所述的混合菌液接種至含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1 %?5%。
[0072] 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h?36h。
[0073] 共發(fā)酵時(shí)，在含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加酪氨酸和谷氨酸對(duì) BN-NKPQQ-RWX-701進(jìn)行代謝調(diào)控，促進(jìn)PQQ合成，添加麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-701進(jìn)行代 謝調(diào)控，促進(jìn)NK生成，添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-701在紅棗汁發(fā)酵過(guò)程中的增殖。本 發(fā)明中，納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備的發(fā)酵紅棗汁富含納豆激酶和吡 咯喹啉醌，具有紅棗汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0074] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0075] -、本發(fā)明使用的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級(jí)安全微生物。
[0076] 二、首次采用基因組重排技術(shù)優(yōu)化NK和PQQ合成途徑，對(duì)納豆芽孢桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過(guò)高通量 篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫(kù)中凸顯。同時(shí)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采 用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn) 表型，獲得能夠在紅棗汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701。
[0077] 三、首次采用構(gòu)建共生關(guān)系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵。通 過(guò)隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO干酪乳桿菌LcS-Met' LcS-Mef在生長(zhǎng)速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-701，但前者對(duì)后者營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā) 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的紅棗汁。
[0078] 四、從結(jié)構(gòu)上看，PQQ通過(guò)酪氨酸和谷氨酸之間形成肽鍵連接環(huán)化而成。本發(fā)明通 過(guò)在含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸和谷氨酸對(duì)BN-NKPQQ-RWX-701進(jìn)行代謝調(diào)控， 促進(jìn)PQQ合成。通過(guò)在含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-701進(jìn)行代 謝調(diào)控，促進(jìn)NK生成。通過(guò)在含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-701 在紅棗汁發(fā)酵過(guò)程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的紅棗汁，PQQ含量達(dá)到70-95ng/mL。 NK活力達(dá)到440-930U/mL。所獲得的紅棗汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有紅棗汁固有 的滋味和氣味。

【具體實(shí)施方式】
[0079] 在實(shí)施例中，有關(guān)培養(yǎng)基配制如下，
[0080] (a)所述的豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計(jì)，由以 下量的組分組成：
[0081] 紅棗汁 130mL;
[0082] 蔗糖 5. Og ;
[0083] 豆芽汁余量；
[0084] 該豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至IOOOmL后過(guò)濾，得到豆芽汁。
[0085] (b)所述的豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL 計(jì)，由以下量的組分組成：
[0086] 紅棗汁 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0087] 該豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（平板）的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0088] (c)所述的豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL 計(jì)，由以下量的組分組成：
[0089] 紅棗汁 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g: 豆芽汁 余量； 倒試管斜面
[0090] 該豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（斜面）的配方有利于納豆芽孢桿菌的保藏。
[0091] (d)所述的MRS液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計(jì)，由以下量的組 分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g;
[0092]乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0093] pH 6_2?6.4
[0094] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0095] (e)所述的MRS固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計(jì)，由以 下量的組分組成：
[0096] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g: 葡萄糖 2.0.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0097] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和篩選。
[0098] (f)所述的MRS固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以IL計(jì)，由以 下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氫二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g;
[0099] 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0100] 倒試管斜面
[0101] 該MRS固體培養(yǎng)基（斜面）有利于干酪乳桿菌保藏。
[0102] (g)所述的含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
[0103] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽汁 IOOmL; 紅棗汁 余量。
[0104] (h)所述的紅棗汁的制備包括：1000mL水中加210g去核鮮紅麥，碾磨成漿汁。
[0105] 本發(fā)明實(shí)施例中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現(xiàn)有技術(shù)，納豆 芽孢桿菌10261來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙 橋中路24號(hào)院6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10261 ;納豆芽孢桿菌10263 來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院 6號(hào)樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號(hào)為10263 ;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)來(lái)自養(yǎng)樂(lè)多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb采用市售產(chǎn)品，購(gòu) 自嘉興元科生物科技有限公司，商品號(hào)為YK-Ab-013。
[0106] 實(shí)施例1
[0107] 本發(fā)明通過(guò)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的紅 棗汁，包括以下步驟：
[0108] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701的選育
[0109] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過(guò)基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701，具體方法為：首先構(gòu)建納豆芽孢桿菌突變庫(kù)，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽孢 桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且生 長(zhǎng)旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0110] 突變庫(kù)高通量篩選：①制備2個(gè)豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基平板（紅棗汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大小；④平板B中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 孢桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-701，保藏于豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0111] ⑵甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0112] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（LcS-MeO。
[0113] LcS-Met-篩選：①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS平板（平板D);②將干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei Shirota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至 另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出 現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落甲硫氨 酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為L(zhǎng)cS-Met^保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0114] (3) BN-NKPQQ-RWX-701 的活化培養(yǎng)
[0115] 將保存于豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-701取一環(huán)，接種 至豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9cfu/mL左右。
[0116] (4) LcS-Meif 的活化培養(yǎng)
[0117] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS_Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9cfu/mL左右。
[0118] (5)富含NK和PQQ的紅棗汁的發(fā)酵制備
[0119] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-701與LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:2 (I X 108CFM/mL: 2 X 108CFM/mL)，混合菌液以1 %接種量接種含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h，得到富含NK和PQQ的紅棗汁。含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-701合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過(guò)肽鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，紅棗汁中NK活力440U/mL，PQQ含量70ng/mL。所獲得的紅棗汁 富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有紅棗汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0120] 實(shí)施例2
[0121] 本發(fā)明通過(guò)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備富含NK和PQQ的紅 棗汁，包括以下步驟：
[0122] (1)高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701的選育
[0123] 采用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，通過(guò)基因組重排及高通量篩選技術(shù)獲得高產(chǎn)NK兼PQQ 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701，具體方法為：首先構(gòu)建納豆芽孢桿菌突變庫(kù)，將已獲 得的產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進(jìn)行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘 變后代，進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)融合（促融劑為聚乙二醇4000)，傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因組改組，使納豆芽 孢桿菌10261和10623所有誘變后代的優(yōu)勢(shì)突變得到優(yōu)化整合，選育出NK兼PQQ產(chǎn)率高且 生長(zhǎng)旺盛、遺傳穩(wěn)定、適合作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。
[0124] 突變庫(kù)高通量篩選：①制備2個(gè)豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基平板（紅棗汁占平板總 量的10-15%，使得選育培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基之間發(fā)生關(guān)聯(lián)，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng) 性策略），其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠?涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產(chǎn)PQQ誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀線，根據(jù)沉淀圈直徑大小可 肉眼判斷產(chǎn)PQQ量大?。虎芷桨錌中，高產(chǎn)NK誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬赏该魅?，根?jù)透明 圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)NK活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)PQQ菌落與高產(chǎn)NK菌落 處于同一位置者，即為高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌。所獲得的高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽 孢桿菌命名為BN-NKPQQ-RWX-701，保藏于豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0125] (2)甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷（MeO的干酪乳桿菌（LcS-MeO的選育
[0126] 將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出 甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（LcS-MeO。
[0127] LcS-Mett帝選：①制備2個(gè)MRS固體培養(yǎng)基平板，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量為10-15mg/L)，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D);②將干 酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)的誘變后代涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素 膜影印至另一個(gè)平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置， 平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌 落甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為L(zhǎng)cS-Met^保藏于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中。
[0128] (3) BN-NKPQQ-RWX-701 的活化培養(yǎng)
[0129] 將保存于豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-701取一環(huán)，接種 至豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9cfu/mL左右。
[0130] (4) LcS-Meif 的活化培養(yǎng)
[0131] 將保存于MRS固體培養(yǎng)基（斜面）中的LcS_Met_取一環(huán)，接種至MRS液體培養(yǎng)基 37°C活化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束菌種密度達(dá)到10 9cfu/mL左右。
[0132] (5)富含NK和PQQ的紅棗汁的發(fā)酵制備
[0133] 將活化的BN-NKPQQ-RWX-701與LcS_Met_混合，使混合菌液中二者密度比為 1:5 (I X 108CFM/mL: 5 X 108CFM/mL)，混合菌液以5 %接種量接種含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C六層紗布封口培養(yǎng)36h，得到富含NK和PQQ的紅棗汁。含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-701合成NK和PQQ進(jìn)行代謝調(diào)控，豆芽 汁有利于納豆芽孢桿菌增殖，麥芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通過(guò)肽鍵連 接環(huán)化而成。發(fā)酵結(jié)束后，紅棗汁中NK活力930U/mL，PQQ含量95ng/mL。所獲得的紅棗汁 富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有紅棗汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0134] 本發(fā)明中采用色譜法測(cè)定PQQ，具體步驟參照"Noji N，Nakamura T, Kitahata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone (PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Chem, 2007, 55 (18): 7258-7263·，'。
[0135] 本發(fā)明中采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測(cè)定NK活力。測(cè)定步驟：將發(fā)酵液過(guò)濾 后點(diǎn)種在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)測(cè)量透明圈 直徑計(jì)算納豆激酶相當(dāng)于尿激酶的活力單位（U/mL)。
【權(quán)利要求】
1. 一種食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)、將產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進(jìn) 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進(jìn)行細(xì)胞融合傳代培養(yǎng)，高通量篩選得到高產(chǎn)納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701 ; 2) 、將干酪乳桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_; 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵紅棗汁，得到富 含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅棗汁。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述 的高通量篩選具體包括：①制備2個(gè)平板豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將小鼠抗PQQ IgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個(gè)將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納 豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變?nèi)诤虾蟠坎计渲幸粋€(gè)平板后，再用纖維 素膜影印至另一個(gè)平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌的 誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬扇庋劭梢?jiàn)沉淀圈，根據(jù)沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產(chǎn)吡咯喹啉 醌量大??；④平板B中，高產(chǎn)納豆激酶的誘變?nèi)诤虾蟠渲車(chē)纬赏该魅?，根?jù)透明圈直 徑大小可肉眼判斷產(chǎn)納豆激酶活力高低；⑤平板A與平板B中，高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌落與高產(chǎn) 納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產(chǎn)納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述的 平板豆芽汁紅棗汁固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述 的從中篩選出甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：①制備2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng) 基，其中一個(gè)將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板，為平板D ;②將 誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè)平板，使平板C和 平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落而平板D未出現(xiàn)菌 落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的 平板MRS固體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，在共 發(fā)酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701和干酪乳桿菌LcS-Met_分別進(jìn)行活化培養(yǎng)， 納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701在豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 為34?36°C，干酪乳桿菌LcS-Met-在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36? 38。。。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的 豆芽汁紅棗汁液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 紅棗汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液體培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，將納 豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701和干酪乳桿菌LcS-Met_共發(fā)酵紅棗汁，具體包括：將活化后 的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-701和干酪乳桿菌LcS-Mef混合，形成混合菌液，將混合菌 液接種至含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅棗 汁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的 含紅棗汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以IL計(jì)，由以下量的組分組成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; V芽丨卜 lOOmL； 紅專(zhuān)汁 余量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食療發(fā)酵紅棗汁的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述 的紅棗汁的制備包括：水中加去核鮮紅棗，碾磨成漿汁。
【文檔編號(hào)】C12N15/03GK104489807SQ201410750993
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】阮暉, 徐薇薇, 何李琳, 吳淵, 胡慧雯, 林永華, 莫凡 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)