一種牛初乳生長因子粗提物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種牛初乳生長因子粗提物及其制備方法和應(yīng)用，制備方法包括：(1)將牛初乳通過離心機離心，除去脂肪獲得脫脂牛初乳；(2)酸法沉淀脫脂牛初乳中的酪蛋白，獲得乳清液體；(3)采用陶瓷膜超濾儀進行兩次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質(zhì)，獲得超濾滲透液；(4)利用透析袋透析，脫鹽；(5)冷凍干燥，即得。本發(fā)明超濾分離過程都在室溫附近的溫度下進行，不易使活性蛋白變性，低能耗，無相變；整個過程都是在液體中進行，增強了多肽穩(wěn)定性，且都是在無機相中進行，無有機相參與，使制備的牛初乳生長因子粗提物更加安全可靠。本發(fā)明制得的牛初乳生長因子粗提物含有多種生長因子，且濃度高，可用于制備防治腸炎保健品。
【專利說明】一種牛初乳生長因子粗提物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種粗提物及其制備方法，特別涉及一種牛初乳生長因子粗提物及其 制備方法和在制備防治腸炎保健品中的應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，飲食不規(guī)律，胃腸病發(fā)生率越來越高，日常生活中人們幾乎 都會患有不同程度地發(fā)生急性或慢性胃腸病。數(shù)據(jù)顯示我國有近30%的人患有各種胃炎， 目前全國胃病患者的總?cè)藬?shù)粗略估計就有近4億人，而且其中40%病情嚴(yán)重。胃腸炎發(fā)展 會導(dǎo)致細(xì)胞損傷、壞死脫落，機械屏障破壞，通透性增加，加上伴隨的腸內(nèi)菌群失調(diào)，細(xì)菌與 內(nèi)毒素移位，腸黏膜及系膜內(nèi)免疫組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)，進一步損傷腸黏膜。嚴(yán)重的黏膜損傷 不僅有大出血的潛在威脅，而且介導(dǎo)腸源性感染，引發(fā)全身性的病理、生理、及內(nèi)臟功能紊 亂。因此，如何減輕黏膜損傷，促進損傷后再修復(fù)，保持腸黏膜結(jié)構(gòu)完整成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 研宄的一個重要課題。
[0003] 牛初乳是自然界中唯一含有兩類主要生長因子（類胰島素生長因子（IGF-I，II) 和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β 1，β 2)的天然產(chǎn)物，而且IGF-I和TGF-β 2也是初乳中含量最高 的兩種生長因子，EGF在分泌初期含量較多。初乳還含有其他生長因子，如血小板生長因子 (TOGF)、上皮生長因子（EGF)、成纖維生長因子（FGF)等。牛初乳生長因子能刺激表皮、上皮 和胚胎細(xì)胞的增殖，抑制胃酸分泌，促進傷口愈合和骨吸收，在胚胎發(fā)生、組織修復(fù)、骨和結(jié) 締組織形成中起重要作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種牛初乳生長因子粗提物的制備方法以及由該制備方 法制備得到的牛初乳生長因子粗提物。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0006] 一種牛初乳生長因子粗提物的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)將牛初乳通過離心機離心，除去脂肪獲得脫脂牛初乳；
[0008] (2)酸法沉淀脫脂牛初乳中的酪蛋白，獲得乳清液體；
[0009] (3)采用陶瓷膜超濾儀進行兩次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質(zhì)，獲得超濾 滲透液；
[0010] ⑷利用透析袋透析，脫鹽；
[0011] (5)冷凍干燥，即得牛初乳生長因子粗提物。
[0012] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)所述牛初乳為健康母牛分娩后2天內(nèi)的乳汁；所述離 心的條件為：4°C下，7000r/min離心15min。
[0013] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（2)所述酸法沉淀脫脂牛初乳中的酪蛋白的具體步驟： 10111〇1/1!1(：1調(diào)節(jié)脫脂牛初乳？!1至2.5，常溫下保存1811后，再用10111〇1/1似0!1調(diào)節(jié)到？!1 4. 6,之后4°C下，10000r/min離心30min，收集乳清。
[0014] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（3)第一次超濾所用陶瓷膜的截留分子量為300Ku，第二 次超濾所用陶瓷膜的截留分子量為l〇〇Ku，超濾時操作壓力0. 15MPa，流量5L/h，溫度25°C。
[0015] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（4)所述透析袋的截留分子量為3500U ;所述透析的條件 為：在蒸餾水中4°C過夜平衡。
[0016] 超濾（Ultrafiltration)技術(shù)是一種膜過濾法，也有錯流過濾（Cross Filtration)之稱。連接并清洗濾膜和系統(tǒng)，蒸餾水排空，清洗3遍循環(huán)清洗lOmin，排空后 重新倒入IL蒸餾水。將牛初乳生長因子粗提液按比例用蒸餾水稀釋，準(zhǔn)備好原液瓶和超濾 液瓶。關(guān)閉膜殼滲透側(cè)出口閥（隔膜閥），打開進料泵前的管底閥（全開啟），緩慢打開膜 濾器濃液調(diào)節(jié)閥（全開啟）、回流閥（半開），確定泵內(nèi)已充滿料液，關(guān)小或關(guān)閉回流閥后， 方可開啟進料泵。調(diào)整膜濾器濃液調(diào)節(jié)閥開度，確認(rèn)進料泵出口壓力在〇. 28- 0. 35MPa之 間。觀察濃液回流管出口的出液情況，穩(wěn)定流量后，同時觀察膜組件入口壓力值，略關(guān)小濃 液回流控制閥，使之符合壓力要求。打開滲透側(cè)出液隔膜閥，從出液管觀察濾液出液情況。 緩慢關(guān)小濃液回流控制閥，使膜組件入口壓力值緩慢升高到0.28-0. 40MPa之間。調(diào)節(jié)閥濃 液回流調(diào)節(jié)閥及滲透側(cè)出液隔膜閥，觀察滲透側(cè)背壓，使膜操作壓力符合0. 25MPa。超濾方 式為2倍稀釋，超濾到1倍體積，再次稀釋2倍，超濾至1倍體積，共5次。當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)乳清濃 縮至原體積1/4時應(yīng)停止超濾，打開排空閥，將濃縮液排出。清洗系統(tǒng)和濾膜，先用0. 3mol/ L NaOH溶液循環(huán)清洗3遍至沒有泡沫，換蒸餾水清洗至水通量達(dá)到初始值，最后0. 3mol/L NaOH溶液循環(huán)清洗2遍，最后一遍堿液留在系統(tǒng)內(nèi)，卸下濾膜，4°C保存。
[0017] 進一步的，本發(fā)明還提供了由所述的制備方法制備得到的牛初乳生長因子粗提 物，其特征在于，所述牛初乳生長因子粗提物含有IGF-I 200?250ng/mL，EGF 30?40ng/ mL，TGF-β 21?5ng/mL，濃度分別較初乳升高139?174、89?120、67?342倍。
[0018] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述牛初乳生長因子粗提物分子量在6-90KU之間
[0019] 本發(fā)明通過研宄牛初乳生長因子粗提物對CaC0-2細(xì)胞的增殖和迀移作用發(fā)現(xiàn)： 本發(fā)明牛初乳生長因子粗提物以1 μ g/mL作用體外CaC0-2細(xì)胞時，細(xì)胞數(shù)量在12、24、36h 分別比正常組增加20. 6 %、30. 8 %、40 % ;本發(fā)明牛初乳生長因子粗提物以10 μ g/mL作用 體外CaC0-2細(xì)胞時，細(xì)胞迀移量在36、48h分別比正常組增加44%、217%;本發(fā)明牛初乳生 長因子粗提物能顯著促進CaC0-2細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的增加，且隨著濃度的增加，細(xì)胞總蛋 白質(zhì)含量呈現(xiàn)劑量依賴性，且IOngAiL牛初乳生長因子粗提物能顯著增加細(xì)胞蛋白含量。 本發(fā)明通過研宄牛初乳生長因子粗提物對MTX引起動物腸炎的修復(fù)作用發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明牛初 乳生長因子粗提物以32mg/kg/d作用于大鼠時，能降低由氨甲喋呤（MTX)引起的腸道黏膜 損傷。
[0020] 因此，更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的牛初乳生長因子粗提物在制備防治腸 炎保健品中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述牛初乳生長因子粗提物通過促進細(xì)胞增殖和迀移、增加細(xì) 胞蛋白質(zhì)含量和修復(fù)腸粘膜而達(dá)到防治腸炎的目的。
[0022] 本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述牛初乳生長因子粗提物促進細(xì)胞增殖的最低有效濃度為 Ing/mL ;所述牛初乳生長因子粗提物促進細(xì)胞迀移的最低有效濃度為Ing/mL ;所述牛初乳 生長因子粗提物增加細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的最低有效濃度為lOng/mL ;所述牛初乳生長因子粗 提物修復(fù)腸粘膜的最低有效濃度為32mg/kg/d。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0024] 本發(fā)明的牛初乳生長因子粗提物含有多種生長因子，本發(fā)明檢測了其中三種含量 高，且能夠顯著刺激上皮細(xì)胞增殖和分化的生長因子，還有其他含量較低，作用效果強的生 長因子。超濾分離過程都在室溫附近的溫度下進行，不易使活性蛋白變性，低能耗，無相變， 整個過程都是在液體中進行，增強了多肽穩(wěn)定性，且整個過程都是在無機相中進行，無有機 相參與，使制備的牛初乳生長因子粗提物更加安全可靠。超濾過程的規(guī)模和處理能力適應(yīng) 范圍廣，設(shè)備結(jié)構(gòu)緊湊，易于其他分離單元集成，實現(xiàn)自動控制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為不同濃度牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細(xì)胞迀移的影響圖；
[0026] 圖2為不同濃度生長因子粗提物對細(xì)胞迀移的影響圖；
[0027] 圖3為不同濃度生長因子粗提物對CaCO-2總蛋白質(zhì)含量的影響圖；
[0028] 圖4為大鼠腸道組織學(xué)變化圖（HE染色法，X 100);
[0029] 圖5為牛初乳生長因子粗提物對空腸及其黏膜的影響圖（*:P〈0. 05vs對照組； #:P〈0.05vs 模型組）；
[0030] 圖6為牛初乳生長因子粗提物對回腸及其黏膜的影響（*:P〈0.05vS對照組； #:P〈0.05vs 模型組）；
[0031] 圖7為牛初乳生長因子粗提物對大鼠血漿DAO活性的影響（*:P〈0. 05vs對照組； #:P〈0.05vs 模型組）；
[0032] 圖8為牛初乳生長因子粗提物對大鼠血漿D-乳酸含量的影響（*:P〈0. 05vs對照 組；#:P〈0. 05vs 模型組）。

【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0034] 牛初乳：由黑龍江完達(dá)山松北牧場提供。
[0035] 主要試劑：10mol/L Na0H，10mol/L HC1，所有試劑均為分析純。
[0036] 主要儀器：Delta320精密pH計：Mettler Toledo公司；DU-800紫外分光光度計： Beckman公司；GL-21M高速冷凍離心機；HIRAYAMA HVE-50形高壓滅菌器；300Ku、IOOKu陶 瓷膜超濾儀：北京華創(chuàng)源泉環(huán)境技術(shù)有限公司；AE-30型倒置生物顯微鏡：麥克奧迪實業(yè) 集團有限公司；Model 680型酶標(biāo)儀：美國Beckman公司。
[0037] 實施例1
[0038] 將8L牛初乳置于制備型離心機內(nèi)4°C、7000r/min離心15min，除去脂肪獲得脫脂 牛初乳6L。采用酸法沉淀脫脂牛初乳中的酪蛋白，具體操作方法為：采用lOmol/L HCl調(diào)節(jié) 脫脂牛初乳口!1至2.5，常溫下保存1811后，再用1〇111〇1/1似0!1調(diào)節(jié)到？!14.6，之后4°〇下， lOOOOr/min離心30min，收集乳清。分別采用截留分子量為300Ku和IOOKu的陶瓷膜進行 第一次超濾和第二次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質(zhì)，獲得超濾滲透液，超濾時操作 壓力0. 15MPa，流量5L/h，溫度25°C。將所得的超濾滲透液用截留分子量為3500u的透析袋 透析，脫鹽，吸水劑為蒸餾水，4°C過夜。冷凍干燥，即得牛初乳生長因子粗提物。
[0039] 實施例2牛初乳生長因子粗提物含量的基本測定
[0040] 分別檢測提取過程中各個步驟（包括初乳、脫脂乳、乳清、300Ku、IOOKu)含量較高 的IGF-I、TGF-β 2、EGF以及總蛋白的含量，檢測結(jié)果見下表。
[0041] 表1牛初乳超濾過程中蛋白質(zhì)含量
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種牛初乳生長因子粗提物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將牛初乳通過離心機離心，除去脂肪獲得脫脂牛初乳； (2) 酸法沉淀脫脂牛初乳中的酪蛋白，獲得乳清液體； (3) 采用陶瓷膜超濾儀進行兩次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質(zhì)，獲得超濾滲透 液； (4) 利用透析袋透析，脫鹽； (5) 冷凍干燥，即得牛初乳生長因子粗提物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述牛初乳為健康母牛分娩 后2天內(nèi)的乳汁；所述離心的條件為：4°C下，7000r/min離心15min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)所述酸法沉淀脫脂牛初乳 中的酪蛋白的具體步驟：10m〇l/L HC1調(diào)節(jié)脫脂牛初乳pH至2. 5,常溫下保存18h后，再用 10mol/L NaOH 調(diào)節(jié)到 pH 4.6,之后 4°C下，10000r/min 離心 30min，收集乳清。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)第一次超濾所用陶瓷膜 的截留分子量為300Ku，第二次超濾所用陶瓷膜的截留分子量為lOOKu，超濾時操作壓力 0. 15MPa，流量 5L/h，溫度 25°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)所述透析袋的截留分子量為 3500u ;所述透析的條件為：在蒸餾水中4°C過夜平衡。
6. 按照權(quán)利要求1-5任一項所述的制備方法制備得到的牛初乳生長因子粗提物，其 特征在于，所述牛初乳生長因子粗提物含有IGF-I 200?250ng/mL，EGF 30?40ng/mL， TGF-0 2 1?5ng/mL，濃度分別較初乳升高139?174、89?120、67?342倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的牛初乳生長因子粗提物，其特征在于，所述牛初乳生長因子 粗提物分子量在6_90Ku之間。
8. 權(quán)利要求6或7所述的牛初乳生長因子粗提物在制備防治腸炎保健品中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述牛初乳生長因子粗提物通過促進細(xì) 胞增殖和迀移、增加細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和修復(fù)腸粘膜而達(dá)到防治腸炎的目的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述牛初乳生長因子粗提物促進細(xì)胞 增殖的最低有效濃度為Ing/mL ;所述牛初乳生長因子粗提物促進細(xì)胞迀移的最低有效濃 度為Ing/mL ;所述牛初乳生長因子粗提物增加細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的最低有效濃度為10ng/ mL ;所述牛初乳生長因子粗提物修復(fù)腸粘膜的最低有效濃度為32mg/kg/d。
【文檔編號】A23L1/29GK104434974SQ201410752159
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】楊麗杰, 劉賓, 霍貴成, 曹鳳波, 王曉明, 李媛媛, 周晶 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)