一種遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒，包括測序引物，所述測序引物包括如下序列：SEQ ID NO:1-36。本發(fā)明的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒的具有檢測位點多、覆蓋范圍廣、陽性檢出率高、臨床使用價值高、靈敏度高、準確性高、檢測特異性高、重復(fù)性高和檢測穩(wěn)定性好的優(yōu)點；可以用于婚前篩查、產(chǎn)前診斷、孕期胎兒及耳聾人群的遺傳性耳聾基因位點篩查檢測，可極大地避免聾兒的出生及遲發(fā)性耳聾的發(fā)生，減輕社會家庭的經(jīng)濟負擔，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。
【專利說明】一種遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因測序技術(shù)，特別涉及一種遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是世界范圍內(nèi)最常見的感覺障礙性疾病之一，遺傳性耳聾可以分為非綜合征 性耳聾和綜合征性耳聾。據(jù)第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國聽力殘疾人數(shù)約2004萬 人，占殘疾人總數(shù)的24. 16%;耳聾導(dǎo)致的言語殘疾約127萬人，占殘疾人總數(shù)的1. 53%。先 天性耳聾在新生兒中的發(fā)病率約為1/1000,其中一半以上的先天性耳聾與遺傳基因有關(guān)。
[0003] 在非綜合征性耳聾中，GJB2、SLC26A4和線粒體DNA是我國最常見的致病基因。 GJB2基因編碼連接蛋白（connexin 26)，參與細胞間信號介導(dǎo)和離子傳遞，突變的GJB2 基因可能導(dǎo)致連接蛋白異常，進而影響細胞間隙的連接功能，引起內(nèi)耳鉀離子回收障礙而 致耳聾。GJB2基因突變與非綜合征性遺傳性耳聾密切相關(guān)，包括常染色體顯性遺傳性聾 DFNA3和常染色體隱性遺傳性聾DFNBl。在中國人群中，26 %?33 %的語前聾患兒為GJB2 基因突變所致，占常染色體隱性遺傳性耳聾的28 %，其突變的主要方式為c. 235delC，檢 出率約為13. 6%?21. 5%。GJB2基因突變還可導(dǎo)致非綜合性常染色體顯性遺傳性耳聾。 SLC26A4基因突變與大前庭水管綜合征/Mondin畸形和Pendred綜合征（前庭水管擴大 或伴Mondini畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫）有著密切關(guān)系。SLC26A4基因編碼Pendred蛋 白。Pendred蛋白主要由疏水性氨基酸組成，其功能主要參與碘/氯離子的轉(zhuǎn)運。在內(nèi)耳 中,Pendred蛋白表達于內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊上皮細胞及橢圓囊和球囊邊緣的神經(jīng)細胞中。 Pendred蛋白發(fā)生異常即可影響細胞內(nèi)外陰離子的轉(zhuǎn)運，從而影響聲音傳遞而導(dǎo)致聽力損 失。在中國大陸，大前庭水管患者SLC26A4基因突變檢出率為97. 9%，高于韓國（78% )、日 本（92% )和歐洲（40% )。
[0004] 目前，臨床上用于耳聾基因進行檢測的試劑盒所用技術(shù)方法有PCR-RFLP法、微陣 列芯片法、ARMS-PCR法、熒光定量PCR法，凝膠電泳法，熒光熔解曲線法，熒光毛細管電泳 法。現(xiàn)我國臨床上主要用的是微陣列芯片法和熒光定量PCR法，它們的主要技術(shù)缺陷如下：
[0005] 微陣列芯片法檢測需經(jīng)過全血DNA提取（30min)、PCR擴增（2h以上）、產(chǎn)物雜交 分析（3h以上）等步驟，檢測時間長以上），操作繁瑣，不能滿足臨床對致聾基因大量 篩查的需求；由于操作流程過多，容易造成樣本交叉污染；其次，對單個堿基的辨識率比較 低，易出現(xiàn)假陰性和假陽性，使結(jié)果的準確率受到影響；此外，微陣列芯片成本過高，需要專 門的芯片掃描儀器，檢測成本高；普通ARMS-PCR產(chǎn)品的擴增效率僅為正常擴增的1-10%， 因此擴增體系缺乏穩(wěn)定性；四引物ARMS-PCR的一個反應(yīng)只能檢一個突變位點。普通PCR產(chǎn) 品共有的缺點為：在結(jié)果判讀時需要通過條帶大小判斷基因型，缺乏直觀性。凝膠電泳檢 測結(jié)果容易造成PCR交叉污染、檢測靈敏度低且耗時長；利用Taqman探針進行SNP突變檢 測，每檢測一個位點需要2條探針，且對探針特異性有較高要求。探針合成成本較高，對熒 光PCR儀的通道數(shù)有要求，不利于推廣；熒光熔解曲線法檢測一管檢測位點少，且受熒光染 料通道限制無法滿足耳聾多基因多位點的檢測；PCR-RFLP法檢測技術(shù)操作繁瑣，需要經(jīng)過 酶切反應(yīng)，反應(yīng)時間長，同時需要凝膠電泳檢測容易出現(xiàn)樣本交叉污染。酶切位點易受基因 變異影響；多重PCR引物體系較復(fù)雜，較難設(shè)計，多對引物之間會形成相互干擾，競爭性抑 制。因此檢測位點越多，所需引物越多，PCR體系優(yōu)化難度越高，同時受毛細管電泳儀熒光 通道的限制，產(chǎn)品推廣較難，一般檢測位點最多不超過20個；
[0006] 現(xiàn)有產(chǎn)品共有的缺點是檢測位點少，只能檢測遺傳性耳聾基因熱點突變，無法檢 測眾多的稀有位點，然而耳聾致病基因多，突變位點多，以上方法均無法滿足臨床上快速， 簡便，檢測范圍廣的要求。在臨床應(yīng)用時存在漏檢的可能，無法對患者的病因作出進一步的 解釋，降低了臨床使用的價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種檢測范圍廣、速度快、靈敏度高的遺傳性 耳聾基因突變檢測試劑盒。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒，包括測序引物，所述測序引物包括如下序 列：根據(jù)GJB2基因設(shè)計的上游引物Fl和下游引物R1，所述Fl的序列如SEQ ID N0:1，所述 Rl的序列如SEQ ID N0:2 ;根據(jù)GJB3基因設(shè)計的上游引物F2和下游引物R2,所述Fl的序列 如SEQIDN0:3，所述R1的序列如SEQIDN0 :4;根據(jù)SLC26A4基因設(shè)計的上游引物F3-F16 和下游引物R3-R16，所述F3-F16的序列如SEQIDN0 :5-18，所述R3-R16的序列如SEQID NO: 19-32 ;根據(jù)12S rRNA基因設(shè)計的上游引物F17-18和下游引物Rl7-18，所述F17-F18的 序列如 SEQ ID N0:33-34,所述 R17-R18 的序列如 SEQ ID N0:35-36。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0011] (1)本發(fā)明的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒的測序引物針對GJB2基因、 SLC26A4基因、12S rRNA基因和GJB3基因進行設(shè)計，可檢測出位于GJB2基因的37個位點 突變，位于GJB3基因的2個位點突變，位于SLC26A4基因的59個位點突變，位于12S rRNA 基因的7個位點突變，總共105個位點，具有檢測位點多、范圍廣，可以檢測遺傳性耳聾多個 基因的熱點突變及稀有突變。現(xiàn)有市面上產(chǎn)品均無法檢測稀有位點或只能檢測少數(shù)稀有位 點，存在漏檢的可能。本試劑盒可以彌補現(xiàn)有產(chǎn)品的缺陷，一次檢測眾多的稀有位點突變， 從而實現(xiàn)檢測位點多、覆蓋范圍廣、陽性檢出率高、臨床使用價值高的目的；
[0012] (2)可以用于婚前篩查、產(chǎn)前診斷、孕期胎兒及耳聾人群的遺傳性耳聾基因位點篩 查檢測，為全面開展遺傳性耳聾基因篩查創(chuàng)造了條件，可極大地避免聾兒的出生及遲發(fā)性 耳聾的發(fā)生，減輕社會家庭的經(jīng)濟負擔，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育；
[0013] (3)本發(fā)明的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒具有靈敏度高（最低檢出限為 5ng)、準確性高（達99%以上）、檢測特異性高（達99%以上）、重復(fù)性高（99%以上）和檢 測穩(wěn)定性好的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實施例的線粒體1555A>G純合子測序圖譜；
[0015] 圖2為本發(fā)明實施例的線粒體14940T純合子測序圖譜；
[0016] 圖3為本發(fā)明實施例的GJB2176del 16雜合子測序圖譜；
[0017] 圖4為本發(fā)明實施例的GJB2235del C雜合子測序圖譜；
[0018] 圖5為本發(fā)明實施例的GJB2299del AT純合子測序圖譜；
[0019] 圖6為本發(fā)明實施例的GJB3538CXT純合子測序圖譜；
[0020] 圖7為本發(fā)明實施例的SLC26A4IVS7-2A>G雜合子測序圖譜；
[0021] 圖8為本發(fā)明實施例的SLC26A42168A>G雜合子測序圖譜；
[0022] 圖9為本發(fā)明實施例的SLC26A41174A>T純合子測序圖譜；
[0023] 圖10為本發(fā)明實施例的SLC26A41226G>A純合子測序圖譜；
[0024] 圖11為本發(fā)明實施例的SLC26A41229CXT純合子測序圖譜；
[0025] 圖12為本發(fā)明實施例的SLC26A42027T>A純合子測序圖譜；

【具體實施方式】
[0026] 為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附 圖予以說明。
[0027] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：針對GJB2基因、SLC26A4基因、12S rRNA基因和GJB3 基因設(shè)計測序引物，從而具有檢測位點多、覆蓋范圍廣的優(yōu)點。
[0028] 本發(fā)明根據(jù)遺傳性耳聾基因突變的位點，設(shè)計特異的引物進行擴增，通過測序反 應(yīng)從而可以對遺傳性耳聾基因檢測位點進行快速、高通量檢測。本發(fā)明可以檢測位于遺傳 性耳聾四個基因 GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA上的105個突變位點的108種突變，包括熱 點突變及稀有突變，共有引物18對，對應(yīng)特異的PCR產(chǎn)物18組。
[0029] 1、測序引物設(shè)計：測序引物在設(shè)計上對引物的特異性要求高，以確保所擴增的 PCR產(chǎn)物片斷單一、特異并包含檢測位點，同時不存在非特異擴增。引物的Tm過高，雖可提 高引物特異性，但影響引物與模板序列的結(jié)合效率，導(dǎo)致產(chǎn)物量低。Tm值過低，雖可提高結(jié) 合效率，但影響其特異性，容易出現(xiàn)非特異擴增。引物的特異性與效率之間的平衡是本發(fā)明 測序引物設(shè)計中的難點。本發(fā)明的測序引物為經(jīng)過大量篩選優(yōu)化后獲得，可確保PCR擴增 特異性的同時保證其擴增效率。為了使本發(fā)明的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒在使用 上的方便，將引物退火溫度統(tǒng)一設(shè)計為58°C左右（±3-5°C )。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取GJB2、 GJB3、SLC26A4、12SrRNA基因的DNA序列，并根據(jù)各突變位點的位置設(shè)計引物，對應(yīng)擴增18 組PCR產(chǎn)物。優(yōu)化后的最優(yōu)引物與檢測位點的對應(yīng)關(guān)系如表1所示。表1為測序引物與檢 測位點的對應(yīng)關(guān)系表。
[0030] 表 1
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括測序引物，所述測序引物包 括如下序列： 根據(jù)GJB2基因設(shè)計的上游引物F1和下游引物R1，所述F1的序列如SEQ ID N0:1，所 述R1的序列如SEQ ID N0:2 ; 根據(jù)GJB3基因設(shè)計的上游引物F2和下游引物R2,所述F1的序列如SEQ ID NO: 3,所 述R1的序列如SEQ ID NO:4 ; 根據(jù)SLC26A4基因設(shè)計的上游引物F3-F16和下游引物R3-R16,所述F3-F16的序列如 SEQ ID N0:5-18,所述 R3-R16 的序列如 SEQ ID N0:19-32; 根據(jù)12S rRNA基因設(shè)計的上游引物F17-18和下游引物R17-18,所述F17-F18的序列 如 SEQ ID N0:33-34,所述 R17-R18 的序列如 SEQ ID N0:35-36。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒，其特征在于，還包括PCR反 應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括MgCl2、PCR Buffer、dNTP混合液和DNA聚合酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒，其特征在于，還包括PCR測 序試劑，所述PCR測序試劑包括BigDye和5XSequencing buffer。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒，其特征在于，還包括質(zhì)控 品，所述質(zhì)控品為正常人基因組DNA。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404164SQ201410795636
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】劉晶晶, 危林耿, 梁少明, 向筑 申請人:亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司