專利名稱：Tt1基因在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤藥物制備領(lǐng)域，特別涉及一種植物源抗逆基因TTl的用途。
背景技術(shù)：
TTl基因是從甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)中分離得到的一種基因，現(xiàn)有技術(shù)僅公開了該基因具有提高植物抗逆性的用途(見專利申請?zhí)?00810045667.8)。癌細(xì)胞是一種變異的細(xì)胞，是產(chǎn)生癌癥的病源，癌細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，有無限生長、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移三大特點(diǎn)，因此難以消滅?，F(xiàn)階段，治療癌癥的方法主要有手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法?；瘜W(xué)療法簡稱“化療”，即用化學(xué)藥物治療癌癥，化療藥物能在癌細(xì)胞生長繁殖的不同環(huán)節(jié)抑制或殺死癌細(xì)胞，達(dá)到治療目的。但現(xiàn)有的化學(xué)藥物均有不同程度的毒副作用，它們在殺傷癌細(xì)胞的同時對正常人體細(xì)胞也有損害，尤其是殺傷人體中生長發(fā)育旺盛的血液、淋巴組織細(xì)胞等，而這些細(xì)胞與組織是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，破壞了人體的免疫系統(tǒng)，癌癥就可能迅速發(fā)展，造成嚴(yán)重后果。因此，進(jìn)行化療時往往出現(xiàn)不同程度的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)等。許多資料證明，臨床腫瘤化療中化療劑量強(qiáng)度與治療效果明顯相關(guān)，如果提高藥物的劑量強(qiáng)度和按計劃進(jìn)行甚至縮短間隔時間，將顯著提高治療的有效率及治愈率，這已在乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等的治療中得到證實。但劑量強(qiáng)度過大，藥物的毒副作用越大，越容易對正常人體細(xì)胞造成損害；而劑量強(qiáng)度不夠不僅不能殺滅癌細(xì)胞，相反會造成癌細(xì)胞對抗癌藥物攝取減少或?qū)p傷細(xì)胞的修補(bǔ)能力增加等而產(chǎn)生抗藥性。因此，如何權(quán)衡化療藥物劑量和治療效果，已成為臨床腫瘤化療所關(guān)注的重點(diǎn)問題。隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和滲透，基因治療特別是腫瘤基因治療技術(shù)迅速發(fā)展。所謂基因治療是指在基因水平上治療疾病的方法。其手段包括基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活、引入新基因等。我國是世界上較早開展基因治療基礎(chǔ)研究和臨床試驗的國家之一。經(jīng)過多年的發(fā)展，在基因?qū)牒突蛑委熍R床試驗等方面都取得了很大進(jìn)展。 尤其是腫瘤基因治療臨床試驗方面，我國目前已有重組腺病毒(p53)抗癌注射液市場化，皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤、以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤細(xì)胞治療與基因治療、IL-2基因工程胃癌細(xì)胞等等。然而，癌癥的發(fā)病機(jī)制是極其復(fù)雜的，基因治療技術(shù)中的許多環(huán)節(jié)和問題仍然困擾著科學(xué)家，現(xiàn)階段的基因治療僅是對傳統(tǒng)的手術(shù)治療、化療和放療的補(bǔ)充。因此，作為當(dāng)前臨床腫瘤研究的新熱點(diǎn)，尋找更多有利于腫瘤基因治療的基因具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于證明TTl基因及其所表達(dá)的多肽可抑制人或動物細(xì)胞的生長，同時增強(qiáng)人或動物細(xì)胞對化療藥物的敏感性，以便開發(fā)出一類配合化療藥物治療腫瘤的新型藥物。本發(fā)明所述TTl基因已在Genbank注冊,注冊號⑶204975,具有如下核苷酸序列:(I):SEQ ID N0.1所述核苷酸序列；
或(2):在SEQ ID N0.1限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID N0.1的序列編碼功能相同的多肽。所述“在SEQ ID N0.1限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”形成的的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID N0.1所編碼的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ IDN0.1同源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.1所述的序列。另外，“在SEQID N0.1中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的含義還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID N0.1所述核苷酸序列雜交的核苷酸序列；還包括與SEQ ID N0.1中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列；還包括能編碼具有與天然的SEQ ID N0.1相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1中開放閱讀框序列的變異形式，這些變異形式包括(但并不限于):若干個核苷酸的缺失、插入和/或取代(通常為I 90個，較佳地I 60個，更佳地I 20個，最佳地I 10個)，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個核苷酸(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))。所述“功能相同”是指抑制人或動物細(xì)胞生長， 同時增強(qiáng)人或動物細(xì)胞對化療藥物敏感性。本發(fā)明所述TTl基因編碼的多肽具有如下氨基酸序列:(I):SEQ ID N0.2所述氨基酸序列；或(2):在SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且與SEQ ID N0.2所述氨基酸序列的多肽功能相同。本發(fā)明通過實驗證明，將TTl基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞H印G2、人肺癌細(xì)胞A549、人前列腺癌細(xì)胞PC3，所述各種癌細(xì)胞的生長受到抑制，與對照相比，生長速度有明顯降低，同時，對化療藥物順鉬的敏感性增強(qiáng)，在較低的化療藥物濃度下(lug/ml)就可達(dá)到癌細(xì)胞生長受抑制的效果。實驗結(jié)果表明，TTl基因及其編碼的多肽可在制備治療腫瘤的藥物中應(yīng)用。所述TTl基因的重組表達(dá)載體，是將TTl基因可操作地連于載體的表達(dá)調(diào)控序列獲得。上述載體可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體)、非病毒載體(質(zhì)粒、陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物)、細(xì)菌載體(大腸桿菌Escherichia coli,沙門氏菌Salmonella,耶爾森氏菌Yersinia,志賀菌 Shigella，李氏桿菌 Listeria等)，通常選用 pcDNA3、pLNCX、pCMV、pEGFP、pSG5、pSV2中的一種。所述的“可操作地連于”表示如下情況:即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明具有以下有益效果:1、為TTl基因及其編碼的多肽開掘了新的醫(yī)療用途，開發(fā)了新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2、為宮頸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等癌癥患者提供了一種新的治療藥物，此種藥物配合化療藥物治療腫瘤(癌癥)可明顯降低毒副作用。


圖1是轉(zhuǎn)染子HeLa-TTl及其對照的RT-PCR鑒定圖譜，轉(zhuǎn)染子HeLa-TTl細(xì)胞具有TTl和β -actin條帶,而HeLa細(xì)胞對照和空載體對照僅有β -actin條帶。圖2是轉(zhuǎn)染子HeLa-TTl及其對照的Western Blotting鑒定譜圖，轉(zhuǎn)染子HeLa-TTl細(xì)胞具有TTl和β -actin條帶，而HeLa細(xì)胞對照和空載體對照僅有β -actin條帶。圖3是轉(zhuǎn)染子HeLa-TTl及其對照細(xì)胞在37°C下的生長情況示意圖。圖4是轉(zhuǎn)染子HeLa-TTl及其對照細(xì)胞在37°C下的生長曲線，其中，A圖為無順鉬條件下的生長曲線；B圖為I μ g/ml順鉬條件下的生長曲線。圖5是轉(zhuǎn)染子H印G2-TT1及其對照的RT-PCR鑒定譜圖，轉(zhuǎn)染子H印G2-TT1細(xì)胞具有TTl和β -actin條帶,而HepG2細(xì)胞對照和空載體對照僅有β -actin條帶。圖6是轉(zhuǎn)染子HepG2_TTl及其對照的Western Blotting鑒定譜圖，轉(zhuǎn)染子HepG2-TTl細(xì)胞具有TTl和β -actin條帶，而H印G2細(xì)胞對照和空載體對照僅有β -actin條帶。圖7是轉(zhuǎn)染子HepG2-TTl及其對照細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)不同時間的生長情況示意圖。圖8是轉(zhuǎn)染子！fepG2_TTl及其對照細(xì)胞在37°C下的生長曲線，其中，A圖為無順鉬條件下的生長曲線，B圖為I μ g/ml順鉬條件下的生長曲線。圖9是轉(zhuǎn)染子A549-TT1及其對照細(xì)胞在37°C下的生長曲線，其中，A圖為無順鉬條件下的生長曲線；B圖為I μ g/ml順鉬條件下的生長曲線。圖10是轉(zhuǎn)染子PC3-TT1及其對照細(xì)胞在37°C下的生長曲線，其中，A圖為無順鉬條件下的生長曲線；B圖為I μ g/ml順鉬條件下的生長曲線。
具體實施例方式下面通過實施例并結(jié)合附圖，進(jìn)一步說明而不限定本發(fā)明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如 Sambrook, Russel l 的分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。下述實施例中，人宮頸癌細(xì)胞HeLa，人肝癌細(xì)胞H印G2，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC3均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。大腸桿菌(E.coli)DH5a菌株為Qiagen公司產(chǎn)品；載體pET_28a (+)和pcDNA
3.1(+)均為Invitrogen公司產(chǎn)品。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均為美國Fermentas (MBI)公司產(chǎn)品；焦碳酸二乙酯(DEPC)、Taq DNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、PCR及凝膠DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Bcip/NBT試劑盒均為北京天根科技公司產(chǎn)品；無血清培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)用磷酸緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白液均為HyClone公司產(chǎn)品；RNA提取試劑RNAiso Plus為大連寶生物公司(Takara)產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為美國Invitrogen產(chǎn)品；順鉬、MTT、抗生素G418為美國Sigma產(chǎn)品；DNA第一鏈合成試劑盒ReverTra Ace為日本東洋紡公司(Toyobo)產(chǎn)品；小鼠抗Myc標(biāo)簽抗體、小鼠抗β -actin抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國Millipore公司產(chǎn)品。其余化學(xué)實際均為市售分析純。下述實施例中，當(dāng)“SEQ ID NO:1”單獨(dú)出現(xiàn)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解其為“SEQID NO:1所示核苷酸序列”的簡稱。實施例1:TT1基因抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa生長并增加其對順鉬的敏感性1、ΤΤ1動物細(xì)胞重組表達(dá)載體的構(gòu)建1.1原核重組表達(dá)載體pET_28a (+) -TTl的構(gòu)建根據(jù)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列設(shè)計引物，上游引物(SEQID N0.3):5’ -CGCGGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，下游引物(SEQID N0.4):5，-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列PCR程序如下:1.95°C4min (預(yù)變性)2.950C30s (變性)
3.530C30s (復(fù)性)4.720C50s (延伸)5.2-4步驟循環(huán)30次6.72 0C5min(終延伸)7.4V保存。對PCR產(chǎn)物純化(純化操作見Qiagen公司所公開的資料)，然后用BamHl與Sacl酶切，膠回收，與原核表達(dá)載體pET-28a(+)連接(連接位點(diǎn)=BamHl與Sacl)，獲得含有SEQID NO:1序列的原核重組表達(dá)載體pET-28a (+) -TTl。1.2真核重組表達(dá)載體pcDNA3.1 (+) -Myc-TTl的構(gòu)建 pcDNA.1 (+) -Myc 為在 pcDNA 3.1 (+)的 NheI 和 HindiII 位點(diǎn)之間插入了來自c-Myc的抗原決定族后構(gòu)建的質(zhì)粒,來自c-Myc的抗原決定族的序列見SEQ ID NO:5。根據(jù)SEQ ID N0.1所述核苷酸序列設(shè)計擴(kuò)增TTl基因的引物:上游引物(SEQID N0.6):5’ -CCCAAGCTTATGTCGGATGATTTGAGTTTA-3’，下游引物(SEQID N0.7):5’ -CGGAATTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGA-3’。以原核重組表達(dá)載體pET_28a (+) -TTl為模板，用Pfu高保真DNA聚合酶，以上述引物PCR擴(kuò)增TTl基因，反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.TTl基因在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述TTl基因具有如下核苷酸序列: (I):SEQ ID N0.1所述核苷酸序列； 或(2):在SEQ ID N0.1限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID N0.1的序列編碼功能相同的多肽。
2.TTl基因編碼的多肽在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，所述TTl基因編碼的多肽具有如下氨基酸序列: (I):SEQ ID N0.2所述氨基酸序列； 或(2):在SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個氨基酸衍生所得的氨基酸序列，且與SEQ ID N0.2所述氨基酸序列的多肽功能相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于將TTl基因可操作地連于載體的表達(dá)調(diào)控序列，形成TTl基因的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述載體為pcDNA3、pLNCX、pCMV、pEGFP、pSG5、pSV2 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為宮頸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌中的一種。
全文摘要
本發(fā)明通過實驗證明，將TT1基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549、人前列腺癌細(xì)胞PC3，所述各種癌細(xì)胞的生長受到抑制，與對照相比，生長速度有明顯降低，同時，對化療藥物順鉑的敏感性增強(qiáng)，在較低的化療藥物濃度下(1μg/ml)就可達(dá)到癌細(xì)胞生長受抑制的效果。實驗結(jié)果表明，TT1基因及其編碼的多肽可在制備治療腫瘤的藥物中應(yīng)用。所述TT1基因具有如下核苷酸序列(1)SEQ ID NO.1所述核苷酸序列；或(2)在SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO.1的序列編碼功能相同的多肽。
文檔編號A61K38/16GK103110958SQ201110363999
公開日2013年5月22日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者楊毅, 王健美, 萬謙, 劉志斌 申請人:四川大學(xué)