一種生物炭固定化微生物共代謝降解三氯乙烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種生物炭固定化微生物共代謝降解三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)的方法，屬于固定化微生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】。生物炭是一種新型材料，呈現(xiàn)緊密層疊的片狀結(jié)構(gòu)，表面微孔密集，比表面積較大，吸附性能良好。本發(fā)明首次提出以生物炭為載體，利用吸附法固定化熒光假單胞菌，以苯酚為底物共代謝降解土壤中的TCE。比較了兩種體系中TCE及苯酚降解的差異，考察了吸附時間、pH、TCE濃度、鹽度、加菌量對固定化體系中TCE降解的影響。與游離體系相比，固定化體系對TCE的總體去除率提高了15％，達到55％，且對不良環(huán)境的耐受性增強。本發(fā)明采用吸附法，以新型材料生物炭為載體，為固定化微生物技術(shù)提供了新的方法。
【專利說明】一種生物炭固定化微生物共代謝降解三氯乙烯的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化微生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及利用生物炭固定化熒光假單胞菌，以苯酚作為生長基質(zhì)，共代謝降解三氯乙烯在污染土壤微生物處理和環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]固定化微生物技術(shù)是用化學或物理的手段，將游離細胞或酶定位于限定的區(qū)域，使其保持活性并可反復(fù)利用的方法。固定化技術(shù)因其特有的細胞密度高、抗毒性強及可反復(fù)利用等特點已廣泛應(yīng)用于工業(yè)廢水處理中，效果較好。據(jù)研宄，微生物被固定化后，可以避免微生物分離上的困難以及微生物的流失；還可提高單位空間微生物的密度和生理活性；另外，微生物被固定化后，可以提高其對惡劣環(huán)境的抗沖擊能力。目前，最常用的微生物固定化方法主要有:包埋法和吸附法，這兩種固定化方法有利有弊。包埋法是利用線性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物載體的加裹作用，將游離細胞截留在形成的高分子材料內(nèi)，其結(jié)構(gòu)可防止細胞滲出到周圍培養(yǎng)基中，但底物仍能滲入與細胞發(fā)生反應(yīng)。包埋法操作簡便，微生物本身不參與水不溶性膠網(wǎng)格或微膠囊的形成，活力較高，應(yīng)用廣泛。但包埋材料有一定的傳質(zhì)阻力，會一定程度阻礙底物和氧擴散，并對大分子底物不適用。吸附法又稱載體結(jié)合法，是通過物理吸附、化學或離子結(jié)合，將微生物固定于非水溶性載體。這種方法操作簡單，對微生物活力影響小，但所結(jié)合的微生物量有限，反應(yīng)穩(wěn)定一性和反復(fù)使用性差，并且，載體的選擇尤為關(guān)鍵。目前應(yīng)用較為廣泛的固定化載體有無機類、多糖與蛋白質(zhì)類、天然高分子凝膠類和有機合成高分子凝膠類。隨著研宄的進行，一些新型固定化載體也不斷涌現(xiàn)。
[0003]生物炭是由生物殘體(如植物秸桿和動物糞便等)在完全或部分缺氧情況下，經(jīng)高溫慢熱(通常低于700°C)產(chǎn)生的一類難熔、穩(wěn)定、富含碳素、高度芳香化的固態(tài)物質(zhì)。根據(jù)制備生物炭的生物質(zhì)材料來源，生物炭可以分為植物源生物炭和動物源生物炭兩大類，其中包括木炭、秸桿炭、谷殼炭，家禽、家畜糞便炭等多種類型。近年來，由于其可以改良土壤，調(diào)節(jié)溫室氣體的減排，以及修復(fù)受污染場地，以其各方面存在的較強應(yīng)用潛力，引起了越來越多的關(guān)注，成為了一種環(huán)境友好的新型材料。生物炭主要由C、H、0等元素組成，以高度富含碳質(zhì)為主要標志，一般含碳量在70%?80%之間，可以看作是纖維素、羧酸以及其衍生物、吡喃、呋喃及脫水的糖、苯酚、烷烴類及烯烴類的衍生物等成分各異的復(fù)雜含碳物質(zhì)混合構(gòu)成的統(tǒng)一體，其最主要成分是烷基和芳香結(jié)構(gòu)。觀察生物炭的微觀構(gòu)型發(fā)現(xiàn)，生物炭是緊密層疊、高度變形的芳香環(huán)組成的片狀結(jié)構(gòu)，生物炭表面常常分布著密集的微孔，因此比表面積較大，這些性質(zhì)就使得生物炭具有良好的吸附性能。微生物可以吸附生長于這些微孔中，避免了因為吸附力小而導致固定化菌大量流失的現(xiàn)象，此外這種微孔結(jié)構(gòu)使得載體本身具有較大的比表面積，增強了固定化熒光假單胞菌對土壤中污染物的吸附能力。因此，生物炭從理論上可作為熒光假單胞菌的固定化載體，以苯酚為底物，共代謝降解三氯乙烯。將生物炭作為固定化載體，利用吸附法固定化熒光假單胞菌共代謝降解TCE的研宄尚無報道。
[0004]三氯乙稀(trichloroethylene，TCE)是一種廣泛應(yīng)用的氯代有機溶劑，可用作清洗劑、脫脂劑、萃取劑等；另外，TCE還作為殺蟲劑、鐵路、汽車、食品加工、紡織、醫(yī)藥和有機化工的原料而廣泛應(yīng)用。隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，三氯乙烯對環(huán)境造成了嚴重污染，嚴重影響生態(tài)平衡和人類健康。受TCE污染的土壤和地下水的修復(fù)技術(shù)主要包括物理方法、化學方法和微生物方法，其中物理方法僅將污染物轉(zhuǎn)移到另外一相，沒有將污染物清除；化學方法雖可以徹底分解有機物，但易導致生態(tài)環(huán)境遭到破壞，微生物方法因其具有處理效率高、費用低、降解徹底和適宜現(xiàn)場處理等特點，一直受到廣泛關(guān)注。在好氧條件下，TCE必須通過共代謝進行降解。其共代謝主要的底物有甲烷、丙烷、戊烷等脂肪族化合物和甲苯、苯酚、苯、甲苯酚等芳香族化合物。本發(fā)明選取苯酚為底物，共代謝降解土壤中的TCE。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是從利用固定化微生物降解污染物的理念出發(fā)，利用新型碳質(zhì)材料生物炭作為載體，采用吸附法固定化熒光假單胞菌，以苯酚為基質(zhì)共代謝降解TCE，達到降低土壤中TCE可提取率及生物有效性的目的，同時提出了將新型環(huán)境友好材料生物炭作為載體，應(yīng)用于以吸附法制備固定化微生物的過程中，增加固定化微生物技術(shù)的實用性。
[0006]本發(fā)明的生物碳固定化微生物共代謝降解三氯乙稀(trichloroethylene，TCE)的方法，包括以下步驟:
[0007]第一步:熒光假單胞菌的預(yù)培養(yǎng)及菌懸液的制備，該方法選取熒光假單胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet CGMCC1.758)作為TCE共代謝降解菌，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；取適量在含苯酚(100mg/L)的無機鹽培養(yǎng)液中馴化過的熒光假單胞菌于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)液中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后，離心，用無機鹽培養(yǎng)液重懸浮，調(diào)節(jié)菌懸液OD6tltl,備用；
[0008]第二步:生物炭固定化熒光假單胞菌的制備，采用吸附法，將一定量生物炭粉末(每個降解體系中生物炭含量為體系總質(zhì)量的1% )與菌懸液0D_= 0.1?0.5混合，攪拌吸附，吸附時間2?20h，使微生物與生物炭充分結(jié)合，備用；
[0009]第三步:固定化微生物共代謝降解TCE，取1mL生物炭固定化熒光假單胞菌懸濁液，一定體積的共代謝底物標準儲備液、TCE儲備液于含2g 土壤的40mL樣品瓶中，pH為7?13，1^^濃度0.2?201^/1 ;迅速旋緊瓶蓋，搖勻，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)若干小時，定點取樣測定。
[0010]所述的固定化微生物共代謝降解TCE的方法，第二步生物炭固定化熒光假單胞菌的制備中，菌懸液0D_選取0.2?0.4，與生物炭混合吸附2h，使得后續(xù)實驗中TCE去除效果最佳；以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，在第三步固定化微生物共代謝降解TCE中，pH選取7、TCE濃度選取I?5mg/L，體系中TCE去除效果最佳。
[0011]本發(fā)明選取新型環(huán)境友好材料生物炭作為載體，采取吸附法固定化熒光假單胞菌，以苯酚為底物，共代謝降解TCE取得了良好的結(jié)果。與游離體系相比，添加生物炭作為載體的固定化體系對TCE的總體去除率提高了 15%，且對不良環(huán)境條件(如:pH、鹽度、污染物濃度等)的耐受性有一定提高。本發(fā)明創(chuàng)造性的將生物炭作為固定化載體，應(yīng)用于以吸附法制備固定化熒光假單胞菌過程中，共代謝降解TCE，操作簡單，可行性強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1固定化體系及游離體系中TCE共代謝降解動力學
[0013]圖2固定化體系及游離體系中苯酚共代謝降解動力學
[0014]圖3吸附時間對TCE共代謝降解的影響
[0015]圖4pH對TCE共代謝降解的影響
[0016]圖5TCE濃度對TCE共代謝降解的影響
[0017]圖6鹽度對TCE共代謝降解的影響
[0018]圖7加菌量對TCE共代謝降解的影響

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施對本發(fā)明進一步詳細的描述，但發(fā)明的實施方式不限于此。
[0020]實施例:生物炭固定化熒光假單胞菌共代謝降解TCE的研宄
[0021]選取生物炭作為固定化載體，濃度為100mg/L的苯酚作為共代謝底物，TCE濃度選取2mg/L，選取不同吸附時間、pH、TCE濃度、鹽度、加菌量，測定TCE殘留率。
[0022]由圖1可見，反應(yīng)72h后基本達到平衡；平衡后游離體系TCE的去除率為39%?41%，固定化體系為55%?58%;與游離體系相比，固定化體系對三氯乙烯的的總體去除率比游離體系提高了 15%。固定化體系中去除的TCE，約有30%被吸附在生物炭上的熒光假單胞菌共代謝降解，另外約有25%被生物炭吸附，由于老化作用吸附在生物炭上的TCE較難被提取。
[0023]由圖2可見，對于苯酚而言，不同的反應(yīng)體系中苯酚在1h內(nèi)都能完全降解；綜合1，2可知，苯酚基本耗盡之后，TCE才開始較快降解。這是由加氧酶的競爭作用引起的，由實驗可知苯酚與加氧酶的親和力遠遠高于TCE。
[0024]將一定量的生物炭粉末加入菌懸液中，分別攪拌2、6、10、20h，使得生物炭與細菌充分接觸、吸附，隨后添加到反應(yīng)體系中，降解92h，間隔一定時間取樣測定TCE濃度，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，吸附短時間對TCE的降解影響不大，隨著時間的延長(20h)TCE的殘留率升高，這可能是由于在沒有底物存在的情況下，隨著接觸時間的增長，細菌的活性降低，從而對TCE的降解作用減弱。
[0025]分別用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)無機鹽溶液的pH值至7?13，降解92h，間隔一定時間取樣測定體系中TCE的濃度，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，在pH為7?10的環(huán)境體系中，微生物對TCE的共代謝降解基本未變化；在11?13的環(huán)境體系中TCE的共代謝效果隨著PH的升高而減弱。這是由于過高的堿性不利于熒光假單胞菌的生長，同時隨著pH的變化，生物炭的表面特性也會對細菌的生長產(chǎn)生影響。
[0026]調(diào)節(jié)TCE濃度分別至0.2、1.0、2.0、10、20mg/L，研宄不同TCE濃度對TCE共代謝降解的影響，實驗結(jié)果如圖5所示。由圖可知隨著TCE濃度的增大，TCE降解率降低，這主要是由TCE及其降解產(chǎn)物的毒性引起的，然而與游離體系相比固定化體系中TCE對于高濃度TCE及其降解產(chǎn)物的耐受性更強。
[0027]分別向無機鹽溶液中加入不同質(zhì)量的NaCl，使得體系中NaCl的質(zhì)量濃度分別至0.09%?3% (無機鹽培養(yǎng)液的初始鹽度0.09% )，反應(yīng)72h，測定TCE濃度。實驗結(jié)果如圖6所示。由圖可見，隨著鹽度的增大，TCE的去除率變化不大，當鹽度為3%時，去除率略有增高；且與游離體系相比較，固定化體系對于鹽度的耐受性更強。
[0028]調(diào)節(jié)菌懸液OD6tltl分別至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5，反應(yīng)72h，測定反應(yīng)結(jié)束后TCE濃度。實驗結(jié)果如圖7所示。由圖可知，在一定范圍內(nèi)，隨著加菌量的增大，TCE去除率有所提高，當0D_> 0.3后，隨著加菌量的增加，TCE去除率不再變化。這可能是由O2、代謝底物等因素引起的。
【權(quán)利要求】
1.一種生物炭固定化微生物共代謝降解三氯乙烯的方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步:熒光假單胞菌的預(yù)培養(yǎng)及菌懸液的制備，該方法選取熒光假單胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet CGMCC1.758)作為TCE共代謝降解菌，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；取適量在含苯酚(100mg/L)的無機鹽培養(yǎng)液中馴化過的熒光假單胞菌于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)液中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后，離心，用無機鹽培養(yǎng)液重懸浮，調(diào)節(jié)菌懸液OD6tltl,備用； 第二步:生物炭固定化熒光假單胞菌的制備，采用吸附法，將一定量生物炭粉末(每個降解體系中生物炭含量為體系總質(zhì)量的1% )與菌懸液0D_= 0.1?0.5混合，攪拌吸附，吸附時間2?20h，使微生物與生物炭充分結(jié)合，備用； 第三步:固定化微生物共代謝降解TCE，取1mL生物炭固定化熒光假單胞菌懸濁液，一定體積的共代謝底物標準儲備液、TCE儲備液于含2g 土壤的40mL樣品瓶中，pH為7?13，TCE濃度0.2?20mg/L ;迅速旋緊瓶蓋，搖勻，置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)若干小時，定點取樣測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化微生物共代謝降解TCE的方法，其特征在于，第二步生物炭固定化熒光假單胞菌的制備中，菌懸液0D_選取0.2?0.4，與生物炭混合吸附2h，使得后續(xù)實驗中TCE去除效果最佳；以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，在第三步固定化微生物共代謝降解TCE中，pH選取7、TCE濃度選取I?5mg/L，體系中TCE去除效果最佳。
【文檔編號】C12N11/14GK104450669SQ201410814366
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】孫紅文, 李冰, 李巖, 王翠蘋 申請人:南開大學