一種低pH值脅迫提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低pH值脅迫提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。在發(fā)酵過(guò)程中引入酸性pH脅迫工藝，即人為或自發(fā)使pH降為2.5-3.0，維持12-48h之后，將pH再提高到3.5-4.5，保持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。采用此種pH調(diào)控方法，能夠顯著提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的比生長(zhǎng)速率和ε-聚賴氨酸比合成速率；結(jié)合補(bǔ)料-分批發(fā)酵方式，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量較普通兩階段pH調(diào)控工藝提高50％以上。本發(fā)明將低pH脅迫的方法引入ε-聚賴氨酸發(fā)酵過(guò)程中，顯著提高了ε-聚賴氨酸的發(fā)酵水平。而且，此方法由于操作簡(jiǎn)單、效果顯著，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)施。
【專利說(shuō)明】_種低pH值脅迫提局ε —聚賴氨酸產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種低pH值脅迫提高ε -聚賴氨酸產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]ε -聚賴氨酸(ε -poly-L-lysine, ε -PL)是一種微生物合成分泌的L-賴氨酸同聚物，由25-35個(gè)L-賴氨酸殘基通過(guò)α -羧基與ε -氨基的脫水縮合作用聚合而成。ε-PL具有水溶性好、熱穩(wěn)定性高、可食用、可降解以及對(duì)人和環(huán)境無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)。另外，ε-PL還具有廣泛的抑菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌等都具有良好的抑制作用。因此，ε-PL作為一種優(yōu)良的生物食品防腐劑，已相繼被日本、韓國(guó)以及美國(guó)和歐洲等國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)其在食品加工業(yè)中使用。2014年4月，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也批準(zhǔn)ε-PL作為食品防腐劑被允許使用。除此之外，作為一種多陽(yáng)離子生物聚合物，ε-PL還被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境和電子等工業(yè)領(lǐng)域。由此可見，ε-PL是一種具有多種用途的重要工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品，具有巨大潛在商業(yè)價(jià)值。
[0003]當(dāng)前，ε-PL生產(chǎn)僅限于利用鏈霉菌通過(guò)液態(tài)好氧發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)。因此，選育高產(chǎn)菌和優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程就成為提高ε-PL發(fā)酵水平的主要途徑?；诰w生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要不同最適PH原則，由Kahar et al.最早提出了兩階段pH值調(diào)控方法:發(fā)酵周期的前48h維持PH值> 5.0 (階段I )，48h后維持pH值4.0左右(階段II )，這種pH值先高后低控制方法結(jié)合碳氮源流加技術(shù)，實(shí)現(xiàn)Streptomyces albulus S410的ε -PL最高產(chǎn)量達(dá)到48.3g/Lo近年來(lái)，發(fā)明人以最高ε -PL比合成速率為調(diào)控目標(biāo)，提出了新的兩階段pH值調(diào)控方法:發(fā)酵前36h維持pH值3.5 (階段I )，36h后維持pH值3.8 (階段II )，這種pH值先低后高的調(diào)控策略，最終實(shí)現(xiàn)Streptomyces sp.M-Z18的補(bǔ)料-分批發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量達(dá)到30.Hg/L。對(duì)比兩個(gè)pH值調(diào)控方法可以發(fā)現(xiàn)，它們之間存在明顯差異:(I)出發(fā)點(diǎn)不同，前者為菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成分別提供最適PH環(huán)境，后者是為了實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物最大比合成速率；(2) pH值控制策略不同，前者階段I控制的PH值較階段II高，而后者階段I控制的pH值較階段II低。
[0004]盡管前面的研宄工作成功的通過(guò)采用pH調(diào)控的方法提高了 ε -PL的產(chǎn)量，但是卻沒(méi)有采用極端低PH環(huán)境脅迫的方法來(lái)提高ε-PL產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)極端低pH值脅迫進(jìn)一步促進(jìn)ε-PL產(chǎn)量的提高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)在ε -PL發(fā)酵前期引入極端的酸性pH值脅迫，以提高ε -PL產(chǎn)量。本發(fā)明在發(fā)酵前期人為或自發(fā)地使發(fā)酵液PH值從起始7.0下降至2.5—3.0，維持一段時(shí)間后，將PH上調(diào)至3.5-4.5，維持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。
[0006]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在ε -PL發(fā)酵開始后，先讓發(fā)酵液pH自發(fā)下降至5.0左右，并控制pH在5.0左右直至菌體量倍增，然后人為或自然地使pH降為2.5-3.0，并維持12-48h，隨后將pH調(diào)為3.5-4.5并保持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。
[0007]本發(fā)明的一種實(shí)施方式主要包括以下步驟:(1)將ε -PL產(chǎn)生菌鏈霉菌的種子液接種到以甘油和/或葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；(2)當(dāng)pH從起始的7.0自發(fā)下降至5.0時(shí)，通過(guò)堿溶液將pH維持在5.0-6.0，直至菌體干重倍增；(3)在菌體量倍增后，人為或自然地使pH降至2.5-3.0，并維持12-48h，隨后通過(guò)流加堿溶液將pH調(diào)為3.5-4.5并保持穩(wěn)定，直到發(fā)酵結(jié)束。
[0008]本發(fā)明的另一種實(shí)施方式主要包括以下步驟:(I)將保藏的ε -PL產(chǎn)生菌鏈霉菌屬孢子，接種到M3G培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h作為種子液；⑵將種子液以8%的接種量接種到以甘油和/或葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；(3)當(dāng)pH從起始7.0自發(fā)下降至5.0時(shí)，通過(guò)蠕動(dòng)泵自動(dòng)添加堿溶液將pH維持在5.0-6.0，直到菌體干重倍增；
(4)在菌體量倍增后，人為或自然地使pH降為2.5-3.0，并維持12-48h，隨后通過(guò)流加堿溶液將PH調(diào)為3.5-4.5并保持穩(wěn)定，直到分批或補(bǔ)料-分批發(fā)酵結(jié)束。
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的ε-PL生產(chǎn)菌還可以是芽孢桿菌屬ε-PL產(chǎn)生菌。
[0010]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，ε -PL的其他發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30_37°C，通氣量為0.5-2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為200-800rpmo
[0011]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)pH的所述的堿溶液為2-4mol/LNaOH或12.5% -25%氨水。
[0012]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的發(fā)酵罐為攪拌式或氣升式發(fā)酵罐，并且發(fā)酵罐體積不限。
[0013]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是分批發(fā)酵或補(bǔ)料-分批發(fā)酵。
[0014]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的補(bǔ)料-分批發(fā)酵包括流加甘油、葡萄糖或二者混合物以及硫酸銨溶液。
[0015]本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0016](I)操作方式簡(jiǎn)單:僅依靠發(fā)酵過(guò)程中菌體自發(fā)或人為流加酸堿溶液進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，便于工業(yè)推廣和應(yīng)用。(2)顯著提高ε-PL產(chǎn)量:相比于普通的兩階段pH調(diào)控策略，ε -PL產(chǎn)量能夠顯著提高50%以上，且能夠顯著降低后提取成本，增加經(jīng)濟(jì)效益。

【具體實(shí)施方式】
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基參見文獻(xiàn)Culture medium containing glucose and glycerol asa mixed carbon source improves ε-poly-L-lysine product1n by Streptomycessp.M-Z18.B1process B1syst Eng 2012Mar，35(3):469 - 475。
[0018]實(shí)施例1兩階段pH控制策略
[0019]在5L發(fā)酵罐中裝3.26L發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，將0.24L培養(yǎng)24h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，PH值調(diào)至6.8-7.5開始發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-800rpm，通氣量控制為0.5_2vvm，溶氧控制在30%左右；在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)pH自發(fā)降為5.0時(shí)，自動(dòng)流加氨水或NaOH溶液將pH維持在5.0直到菌體量倍增，后使pH自發(fā)下降到
4.0，并通過(guò)自動(dòng)流加氨水或NaOH溶液將pH維持在設(shè)定值，直到碳源消耗完畢，發(fā)酵結(jié)束。最終，實(shí)現(xiàn)ε -PL產(chǎn)量和菌體量分別為7.83和26.89g/L，ε -PL產(chǎn)率為6.12g/L/d。
[0020]若當(dāng)發(fā)酵液中殘留的甘油或葡萄糖濃度降為10g/L時(shí)，自動(dòng)流加滅菌后的純甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在發(fā)酵液中的濃度控制在10g/L左右；當(dāng)發(fā)酵液中NH/-N濃度降到lg/L時(shí)，自動(dòng)流加滅菌后的600g/L的硫酸銨溶液，使其濃度維持在lg/L。發(fā)酵192h后，ε -PL產(chǎn)量和菌體量分別為35.87和64.02g/L，ε -PL產(chǎn)率為4.48g/L/d。。
[0021]實(shí)施例2先降后升兩階段pH控制策略
[0022]在5L發(fā)酵罐中裝3.26L發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，將0.24L培養(yǎng)24h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，PH調(diào)到6.8-7.5開始發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-800rpm，通氣量控制為0.5_2vvm，溶氧控制在30% ;當(dāng)發(fā)酵pH值自發(fā)降為3.5時(shí)(約20h)，自動(dòng)流加氨水或NaOH溶液將此pH維持穩(wěn)定，直至36h，后將pH上調(diào)到3.8，并自動(dòng)流加氨水或NaOH溶液將此pH維持穩(wěn)定，直到碳源消耗完畢，發(fā)酵結(jié)束。最終，實(shí)現(xiàn)ε -PL產(chǎn)量和菌體量分別為8.59和27.21g/L，ε -PL產(chǎn)率為6.42g/L/d。
[0023]若當(dāng)發(fā)酵液中殘留的甘油或葡萄糖濃度降為10g/L時(shí)，自動(dòng)流加滅菌后的純甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在發(fā)酵液中的濃度控制在10g/L左右；當(dāng)發(fā)酵液中NH/-N濃度降到lg/L時(shí)，自動(dòng)流加滅菌后的600g/L的硫酸銨溶液，使其濃度維持在lg/L。發(fā)酵176h后，ε-PL產(chǎn)量和菌體量分別為35.24和43.05g/L，ε-PL產(chǎn)率為4.81g/L/d。
[0024]實(shí)施例3
[0025]在5L發(fā)酵罐中裝3.26L發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，將0.24L培養(yǎng)24h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，PH調(diào)到6.8-7.5開始發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-800rpm，通氣量控制為0.5-2vvm，溶氧控制在30 % ;發(fā)酵進(jìn)行到20h，人為將pH降為2.5并維持12h，隨后將pH上調(diào)到3.5，并自動(dòng)流加氨水將pH維持在設(shè)定值，直到葡萄糖消耗完畢，發(fā)酵結(jié)束。最終，實(shí)現(xiàn)ε -PL產(chǎn)量和菌體量分別為10.39和30.61g/L，ε -PL產(chǎn)率為 7.12g/L/do
[0026]實(shí)施例4
[0027]在5L發(fā)酵罐中裝3.26L發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，將0.24L培養(yǎng)24h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，PH調(diào)到6.8-7.5開始發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-800rpm，通氣量控制為0.5-2vvm，溶氧控制在30%;當(dāng)發(fā)酵pH值自發(fā)降為5.0時(shí)，自動(dòng)流加NaOH溶液將pH維持在5.0直到菌體量倍增，后人為將pH降為2.5并維持12h，隨后將pH上調(diào)到3.5，并自動(dòng)流加氨水將pH維持在設(shè)定值，直到葡萄糖消耗完畢，發(fā)酵結(jié)束。最終，實(shí)現(xiàn)ε -PL產(chǎn)量和菌體量分別為10.21和28.36g/L，ε -PL產(chǎn)率為8.63g/L/d。
[0028]實(shí)施例5
[0029]在5L發(fā)酵罐中裝3.26L發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，將0.24L培養(yǎng)24h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，PH調(diào)到6.8-7.5開始發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-800rpm，通氣量控制為0.5-2vvm，溶氧控制在30 % ;在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)pH自發(fā)降為5.0時(shí)，自動(dòng)流加氨水將pH維持在5.0直到菌體量倍增，后使pH自發(fā)下降到3.0，并維持48h，隨后將PH上調(diào)到4.5，并自動(dòng)流加NaOH溶液將pH維持在設(shè)定值，直到甘油消耗完畢，發(fā)酵結(jié)束。最終，實(shí)現(xiàn)ε -PL產(chǎn)量和菌體量分別為9.65和23.90g/L，ε -PL產(chǎn)率為7.94g/L/d。
[0030]實(shí)施例6
[0031]在5L發(fā)酵罐中裝3.26L發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，將0.24L培養(yǎng)24h的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，PH調(diào)到6.8-7.5開始發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200-800rpm，通氣量控制為0.5-2vvm，溶氧控制在30 % ;在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)pH自發(fā)降為5.0時(shí)，自動(dòng)流加氨水或NaOH溶液將pH維持在5.0直到菌體量倍增，人為將pH值降為3.0并維持24h，后將pH上調(diào)到4.5，并自動(dòng)流加氨水或NaOH溶液將pH維持在設(shè)定值。當(dāng)發(fā)酵液中殘留的甘油或葡萄糖濃度降為10g/L時(shí)，自動(dòng)流加滅菌后的純甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在發(fā)酵液中的濃度控制在10g/L左右；當(dāng)發(fā)酵液中NH4+-N濃度降到lg/L時(shí)，自動(dòng)流加滅菌后的600g/L的硫酸銨溶液，使其濃度維持在lg/L。發(fā)酵192h后，ε -PL產(chǎn)量達(dá)到54.70g/L，相比于兩階段pH控制策略分別提高52.50% (實(shí)施例1)和55.22% (實(shí)施例2) ； ε-PL產(chǎn)率為6.84g/L/d，相比于兩階段pH控制策略分別提高52.68% (實(shí)施例1)和42.20% (實(shí)施例 2) ο
[0032]雖然本發(fā)明以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種低pH值脅迫提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，在ε-聚賴氨酸發(fā)酵過(guò)程前期引入酸性PH值脅迫策略。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵前期人為或自發(fā)地使發(fā)酵液PH值從起始7.0下降至2.5-3.0，維持12-48h后，將pH上調(diào)至3.5-4.5，維持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在ε-PL發(fā)酵開始后，先讓發(fā)酵液pH自發(fā)下降至5.0左右，并控制pH在5.0左右直至菌體量倍增，然后人為或自然地使pH降為2.5-3.0，并維持12-48h，隨后將pH調(diào)為3.5-4.5并保持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:(I)將ε-PL產(chǎn)生菌鏈霉菌的種子液接種到以甘油和/或葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；(2)當(dāng)pH從起始的7.0自發(fā)下降至5.0時(shí)，通過(guò)堿溶液將pH維持在5.0-6.0，直至菌體干重倍增；(3)在菌體量倍增后，人為或自然地使pH降至2.5-3.0，并維持12-48h，隨后通過(guò)流加堿溶液將PH調(diào)為3.5-4.5并保持穩(wěn)定，直到發(fā)酵結(jié)束。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:(I)將保藏的ε-PL產(chǎn)生菌鏈霉菌孢子，接種到M3G培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h作為種子液；(2)將種子液以8%的接種量接種到以甘油和/或葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過(guò)發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；(3)當(dāng)pH從起始7.0自發(fā)下降至5.0時(shí)，通過(guò)蠕動(dòng)泵自動(dòng)添加堿溶液將pH維持在5.0-6.0，直到菌體干重倍增；(4)在菌體量倍增后，人為或自然地使pH降為2.5-3.0，并維持12-48h，隨后通過(guò)流加堿溶液將PH調(diào)為3.5-4.5并保持穩(wěn)定，直到分批或補(bǔ)料-分批發(fā)酵結(jié)束。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，生產(chǎn)菌是芽孢桿菌屬的ε-PL產(chǎn)生菌或鏈霉菌屬的ε-PL產(chǎn)生菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，ε-PL的其他發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30-37°C，通氣量為 0.5-2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為 200_800rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)pH的所述堿溶液為2-4mol/LNaOH 或 12.5% -25%氨水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵是分批發(fā)酵或補(bǔ)料-分批發(fā)酵。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的補(bǔ)料-分批發(fā)酵包括流加甘油、葡萄糖或二者混合物以及硫酸銨溶液。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104498552SQ201510021744
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月15日
【發(fā)明者】陳旭升, 毛忠貴, 任喜東, 張建華, 張宏建, 唐蕾, 王珂 申請(qǐng)人:江南大學(xué)