適用于刺參的免提dna的pcr快速擴(kuò)增方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種刺參免提DNA的 PCR快速擴(kuò)增方法，其步驟是：將刺參處死后用微量注射器肌肉內(nèi)抽取體液0.02-1μL入200μL PCR管中，置于冰浴備用；當(dāng)不能立即PCR時將其置-20℃下保存，1周內(nèi)有效；一步法PCR：以上述PCR管的體液為模板，進(jìn)行25μL體系下的PCR擴(kuò)增：反應(yīng)條件為普通PCR條件，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，50-60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存；再按照常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)簡便合理，可操作性強(qiáng)，無需經(jīng)過DNA抽提過程，即可獲得理想的擴(kuò)增效果。
【專利說明】適用于刺參的免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種PCR快速擴(kuò)增方法，特別是一種適用于刺參的免提DNA的PCR快 速擴(kuò)增方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 刺參屬低等海洋生物。常規(guī)的PCR技術(shù)是建立在成功提取刺參的高質(zhì)量DNA為 前提的。目前，常用的方法就是剪取刺參肉刺，用新鮮樣品進(jìn)行DNA提取，之后在獲得DNA 后再進(jìn)行下一步的分子研究，如最常用的PCR。這一過程往往所要時間較長，從提取DNA到 完成PCR至少要半天時間，且DNA提取的過程所使用的常規(guī)藥品如苯酚、氯仿、SDS對人體 和環(huán)境具有潛在的危害。因此，開發(fā)一種不需提取DNA的PCR技術(shù)，將具有很大的技術(shù)優(yōu)勢 和應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的、方法簡單合 理、操作方便的適用于刺參的免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種適用 于刺參的免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下 ： (1) 取體液：將刺參處死后用微量注射器肌肉內(nèi)抽取體液〇.〇2-WL入20〇μ? PCR管中， 置于冰浴備用；當(dāng)不能立即PCR時將其置-20°C下保存，1周內(nèi)有效； (2) -步法PCR :以上述PCR管的體液為模板，進(jìn)行25μ?體系下的PCR擴(kuò)增： 25μ?體系： 體液 0.02-?μ? 2 X Taq PCR MasterMix 12. 5? 引物2μ?，上下游混合引物，濃度均為2. 5Mffl〇l/L ; CldH2O 補(bǔ)足至 25μ? 反應(yīng)條件：普通PCR條件，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 °C預(yù)變性4 min;94 °C變性40 s，50-60 °C 退火40 s，72 °C延伸40 s，共35個循環(huán)；72 °C延伸6 min, 4 °C保存； (3) PCR產(chǎn)物檢測：按照常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0005] 本發(fā)明所述的刺參免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法，進(jìn)一步地，在步驟（1)中，用于 取體液的刺參的個體重量優(yōu)選在2g以上。在步驟（2)-步法PCR中，體液量優(yōu)選為0. 2μ?。 在步驟（2)所述的引物優(yōu)選自：

【權(quán)利要求】
1. 一種刺參免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法，其特征在于，其步驟如下， 取體液：將刺參處死后用微量注射器肌肉內(nèi)抽取體液〇. 02-1ML入200ML PCR管中，置 于冰浴備用；當(dāng)不能立即PCR時將其置_20°C下保存，1周內(nèi)有效； 一步法PCR :以上述PCR管的體液為模板，進(jìn)行25ML體系下的PCR擴(kuò)增： 25ML體系： 體液 0.02-1ML 2. Taq PCR MasterMix 12. 5|^L 引物2ML，上下游混合引物，濃度均為2. 5Mffl〇l/L ; CldH2O 補(bǔ)足至 25ML 反應(yīng)條件：普通PCR條件，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 °C預(yù)變性4 min;94 °C變性40 s，50-60 °C 退火40 s，72 °C延伸40 s，共35個循環(huán)；72 °C延伸6 min，4 °C保存； (3) PCR產(chǎn)物檢測：按照常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺參免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法，其特征在于，在步驟（1) 中，用于取體液的刺參的個體重量在2g以上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的刺參免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法，其特征在于，在步 驟（2) -步法PCR中，體液量為0. 2ML。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的刺參免提DNA的PCR快速擴(kuò)增方法，其特征在于，在步 驟（2)所述的引物選自：
【文檔編號】C12N15/10GK104498479SQ201510019776
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月15日
【發(fā)明者】董志國, 陳百堯, 張慶起, 趙帥, 伏光輝, 安健, 張立祥 申請人:淮海工學(xué)院, 連云港市高公島黃窩捕撈養(yǎng)殖公司, 連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司, 連云港市海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究所