本發(fā)明涉及一種水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液及制備方法。

背景技術(shù)：

養(yǎng)殖場(chǎng)(戶(hù))在養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期在飼料中添加抗生素，再加上不注重養(yǎng)殖環(huán)境的控制，造成污染嚴(yán)重，僅靠益生菌制劑還不能以使養(yǎng)殖動(dòng)物完全抵御病菌、病毒的侵染。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，益生菌菌劑具有動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)的作用。具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、提高抗病菌、抗病毒的能力。但是，許多中藥研究資料表明，中藥也具有預(yù)防、治療病毒性腹瀉等作用，同時(shí)也具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能。二者復(fù)合后,直接利用益生菌群發(fā)酵中草藥，能破壞中草藥的細(xì)胞壁，大大提高中草藥的有效成份的利用率，并在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種促生長(zhǎng)因子與新的物質(zhì)，能夠起到提高中草藥的藥效，將進(jìn)一步提高動(dòng)物的免疫力，提高產(chǎn)品品質(zhì)，取代抗生素防病、治病，減少獸藥殘留，提升環(huán)境效益和生態(tài)效益，真正實(shí)現(xiàn)生態(tài)化養(yǎng)殖是我國(guó)乃至全世界的共同發(fā)展趨勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液及制備方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明方案包括：

一種水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液，其中，由中藥提取液與復(fù)合益生菌發(fā)酵液按照體積比1：1-2配制而成。

所述的水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液，其中，上述復(fù)合益生菌發(fā)酵液包括乳酸菌和芽孢桿菌，乳酸菌和芽孢桿菌的重量比為1:1。

所述的水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液，其中，上述復(fù)合益生菌發(fā)酵液包括10份-20份的乳酸菌與10份-20份芽孢桿菌。

所述的水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液，其中，上述中草藥提取液是由黃芪、連翹、板藍(lán)根、銀花、菊花制備而成；

按照質(zhì)量份數(shù)如下：20份-30份的黃芪、20份-30份的連翹、20-份30份的板藍(lán)根、20份-30份的銀花與20份-30份的菊花。

一種制備如所述水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液的方法，其包括制備復(fù)合益生菌發(fā)酵液的步驟與制備中草藥提取液的步驟，然后將制備的備復(fù)合益生菌發(fā)酵液與中草藥提取液按照比例相混合。

所述的方法，其中，上述制備復(fù)合益生菌發(fā)酵液的步驟包括：

A、活化保存斜面菌種，用LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)乳酸菌與芽孢桿菌，在pH為7-7.5、100-130℃高壓滅菌20分鐘-40分鐘、在30-38℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12小時(shí)-20小時(shí)；

B、對(duì)乳酸菌、芽孢桿菌分別進(jìn)行的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量10％-20％；

C、對(duì)一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)后的乳酸菌、芽孢桿菌分別進(jìn)行二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng),接種量10％-20％；

D、將乳酸菌、芽孢桿菌發(fā)酵液按重量比為1:1的比例混合，得到復(fù)合益生菌發(fā)酵液。

所述的方法，其中，上述制備中草藥提取液的步驟包括：

E、將對(duì)應(yīng)的中草藥粉碎至60目-80目，按照重量分量稱(chēng)取對(duì)應(yīng)中草藥粉末后充分混合得到中草藥粉；

F、將中草藥粉與300份-600份的水投入到提取罐中，浸泡5小時(shí)-15小時(shí)；后加熱至40℃-100℃提取10小時(shí)-12小時(shí)，過(guò)濾收集得到提取液；然后向提取罐中的藥渣中再加入300份-600份水，在40℃-100℃提取10小時(shí)-15小時(shí)；

J、合并兩次提取液，在30℃-70℃條件下減壓濃縮至原體積的10％-20％，得到中草藥提取液。

所述的方法，其中，上述方法具體的還包括：向得到的中草藥提取液中加入復(fù)合益生菌發(fā)酵液行程混合液，在25℃-35℃條件下培養(yǎng)12小時(shí)-36小時(shí)，每隔12小時(shí)開(kāi)攪拌5min，轉(zhuǎn)速為120r/min,待混合液pH值降至3.0-3.2，即可停止發(fā)酵，攪拌30min后，用四層100目的濾布過(guò)濾得到所述水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液。

本發(fā)明提供了一種水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液及制備方法，將中草藥與復(fù)合益生菌相配合，可以起到治養(yǎng)同步的目的，在治療病毒性疾病的同時(shí)提高動(dòng)物水貂機(jī)體免疫力；可在一定范圍內(nèi)代替抗生素和化學(xué)抗病藥物，達(dá)到真正的綠色生態(tài)養(yǎng)殖。

下面結(jié)合試驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液的安全性與治病防病效果。

本發(fā)明復(fù)合益生菌中草藥保健液在青島某大學(xué)經(jīng)大鼠急性毒性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組為50只大鼠，按0.6ml/10g體重飼喂21天；空白對(duì)照組為50只大鼠，按照常規(guī)飼養(yǎng)。

結(jié)論結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組大鼠全部存活,活動(dòng)自如,毛發(fā)光滑,飲食正常,呼吸道、眼及口腔等處無(wú)分泌物外，未發(fā)現(xiàn)任何中毒癥狀，體重均有增加。與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的大鼠體重明顯增加(P＜0.001)。21天觀察期結(jié)束，將大鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、小腸等臟器均未見(jiàn)明顯異常表現(xiàn)。另外，大鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠脾臟系數(shù)明顯增加(P＜0.01)，提示本發(fā)明的復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液具有免疫增強(qiáng)作用，屬實(shí)際無(wú)毒類(lèi)物質(zhì)，安全度大。

本發(fā)明的中草藥浸出液經(jīng)多種益生菌發(fā)酵后，色、香、味均有明顯改善。原有的苦味成分明顯下降，有明顯的劃過(guò)甜味，滋味醇和爽口，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定保健液的抗氧化大為提高。

本發(fā)明的復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液含有大量的中草藥物質(zhì)，如游離氨基酸、葉綠素、胡蘿卜素、酶、甜菜堿、維生素A、維生素B、維生素C、維生素E、維生素P以及無(wú)機(jī)鹽、微量元素等幾百種浸出物；這些中草藥物不僅能起到治病防病的效果，還能促進(jìn)保健液中的乳酸菌、芽孢桿菌的共生發(fā)酵作用，并產(chǎn)生大量的中間產(chǎn)物，如葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、醋酸、乳酸、氨基酸等。

附圖說(shuō)明

圖1為不同濃度之復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液對(duì)水貂體重的影響示意圖；

圖2為不同處理組小水貂的OD值示意圖；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種水貂專(zhuān)用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液及制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

制備該復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液的原料按重量份為：黃芪20份、連翹20份、板藍(lán)根20份、銀花20份、菊花20份，乳酸菌10份、芽孢桿菌10份。

復(fù)合益生菌發(fā)酵液的制備過(guò)程如下：

(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，乳酸菌、芽孢桿菌用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌20-40分鐘，在30-38℃培養(yǎng)12-15小時(shí)；

(2)乳酸菌、芽孢桿菌的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；

(3)乳酸菌、芽孢桿菌的二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；

(4)將乳酸菌、芽孢桿菌發(fā)酵液按以下配比混合：乳酸菌10份，芽孢桿菌10份。

中草藥提取液制備過(guò)程如下：

(1)將中草藥粉碎至60目，按配方量稱(chēng)取，三維混合得中草藥粉；

(2)將混合后的中草藥粉、300份水分別投入到提取罐中，浸泡5小時(shí)；

(3)加熱至40-100℃提取10-12小時(shí)；

(4)過(guò)濾收集提取液；

(5)二次向藥渣中加入300份水，40-100℃提取10小時(shí)；

(6)合并兩次提取液，30-70℃減壓濃縮至原體積10％-20％，得到冷卻液。

(7)向步驟(6)制取的冷卻液中加入乳酸菌10-20份、芽孢桿菌10-20份，在25℃-35℃條件下，培養(yǎng)12-36小時(shí)，每隔12小時(shí)開(kāi)攪拌5min(轉(zhuǎn)速120r/min),待pH值降至3.0-3.2，即可停止發(fā)酵，攪拌30min后放罐，放出菌液用四層100目的濾布過(guò)濾得到發(fā)酵過(guò)濾液，無(wú)菌裝罐，包裝得到復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液。

實(shí)施例2

制備該復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液的原料按重量份為：黃芪25份、連翹25份、板藍(lán)根25份、銀花25份、菊花25份，乳酸菌15份、芽孢桿菌15份。

復(fù)合益生菌發(fā)酵液的制備過(guò)程如下：

(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，乳酸菌、芽孢桿菌用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌20-40分鐘，在30-38℃培養(yǎng)15小時(shí)；

(2)乳酸菌、芽孢桿菌的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；

(3)乳酸菌、芽孢桿菌的二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；

(4)將乳酸菌、芽孢桿菌發(fā)酵液按以下配比混合：乳酸菌15份，芽孢桿菌15份。

中草藥提取液制備過(guò)程如下：

(1)將中草藥粉碎至60目，按配方量稱(chēng)取，三維混合得中草藥粉；

(2)將混合后的中草藥粉、300份水分別投入到提取罐中，浸泡10小時(shí)；

(3)加熱至40-100℃提取10-12小時(shí)；

(4)過(guò)濾收集提取液；

(5)二次向藥渣中加入300份水，40-100℃提取12小時(shí)；

(6)合并兩次提取液，30-70℃減壓濃縮至原體積10％-20％，得到冷卻液。

(7)向步驟(6)制取的冷卻液中加入乳酸菌15份、芽孢桿菌15份，在25℃-35℃條件下，培養(yǎng)12-36小時(shí)，每隔12小時(shí)開(kāi)攪拌5min(轉(zhuǎn)速120r/min),待pH值降至3.0-3.2，即可停止發(fā)酵，攪拌30min后放罐，放出菌液用四層100目的濾布過(guò)濾得到發(fā)酵過(guò)濾液，無(wú)菌裝罐，包裝得到復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液。

實(shí)施例3

制備該復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液的原料按重量份為：黃芪30份、連翹30份、板藍(lán)根30份、銀花30份、菊花30份，乳酸菌20份、芽孢桿菌20份。

復(fù)合益生菌發(fā)酵液的制備過(guò)程如下：

(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，乳酸菌、芽孢桿菌用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌20-40分鐘，在30-38℃培養(yǎng)20小時(shí)；

(2)乳酸菌、芽孢桿菌的一級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；

(3)乳酸菌、芽孢桿菌的二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；

(4)將乳酸菌、芽孢桿菌發(fā)酵液按以下配比混合：乳酸菌20份，芽孢桿菌20份。

中草藥提取液制備過(guò)程如下：

(1)將中草藥粉碎至60目，按配方量稱(chēng)取，三維混合得中草藥粉；

(2)將混合后的中草藥粉、300份水分別投入到提取罐中，浸泡15小時(shí)；

(3)加熱至40-100℃提取10小時(shí)；

(4)過(guò)濾收集提取液；

(5)二次向藥渣中加入300份水，40-100℃提取15小時(shí)；

(6)合并兩次提取液，30-70℃減壓濃縮至原體積10％-20％，得到冷卻液。

(7)向步驟(6)制取的冷卻液中加入乳酸菌10-20份、芽孢桿菌10-20份，在25℃-35℃條件下，培養(yǎng)12-36小時(shí)，每隔12小時(shí)開(kāi)攪拌5min(轉(zhuǎn)速120r/min),待pH值降至3.0-3.2，即可停止發(fā)酵，攪拌30min后放罐，放出菌液用四層100目的濾布過(guò)濾得到發(fā)酵過(guò)濾液，無(wú)菌裝罐，包裝得到復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液。

為了更進(jìn)一步描述水貂用復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健口服液對(duì)水貂體重、免疫力和腸道健康的影響，以下對(duì)水貂進(jìn)行分組對(duì)照。

試驗(yàn)水貂，為大連黑，由青島某農(nóng)業(yè)科技有限公司毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖基地提供。選取150日齡仔貂60只，按性別和體重隨機(jī)分成6組，每組5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)2只，公母各半，試驗(yàn)從2016年4月20日起，5月24日結(jié)束，共計(jì)35天。每組小水貂分籠喂養(yǎng)，自由采食和飲水。

由青島某大學(xué)動(dòng)物微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離保存的乳酸菌和芽孢桿菌的活菌株。

菌落計(jì)數(shù)(平板計(jì)數(shù)法)

在超凈臺(tái)內(nèi)用經(jīng)過(guò)高壓的量筒取25mL菌液置于盛有250mL生理鹽水的廣口瓶?jī)?nèi)，充分搖勻成比例為1:10的稀釋液。用容積為1.0mL的經(jīng)過(guò)高壓的吸管吸取1.0mL置于盛有9mL的生理鹽水內(nèi)，進(jìn)行十倍稀釋?zhuān)貜?fù)上述操作直至菌液稀釋倍數(shù)為109。用吸管吸取1.0mL的菌液置于經(jīng)過(guò)高壓、烘烤后的平皿內(nèi)，同時(shí)將冷卻至46℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂倒入平皿內(nèi)，同時(shí)移動(dòng)平皿使溶液充分混合。將平板置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h計(jì)數(shù)，重復(fù)做三次。計(jì)數(shù)公式：每毫升菌落形成單位(cfu)＝同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)*稀釋度數(shù)。

免疫注射

將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成A、B、C、D、E、F六組，每組5個(gè)重復(fù)。對(duì)水貂進(jìn)行免疫，第一次每只水貂注射等體積混合的抗原與弗氏完全佐劑0.1mL。一個(gè)星期后每只水貂注射等體積混合的抗原與弗氏不完全佐劑佐劑0.1mL，間隔一周后每只水貂重復(fù)注射等體積混合的抗原與弗氏不完全佐劑佐劑0.1mL。

對(duì)水貂灌胃處理，表1為對(duì)試驗(yàn)水貂的不同處理方式

不同試驗(yàn)組對(duì)水貂體重的影響

結(jié)果分析：如圖1所示的，由折線圖可以看出水貂的初始體重接近，灌胃處理一周后不同試驗(yàn)組水貂的體重差距仍然不大，從兩個(gè)周以后差距開(kāi)始比較明顯，飼喂乳酸菌組、芽孢桿菌組、中草藥組，復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組水貂的體重都高于灌胃生理鹽水的對(duì)照組，并且灌胃復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組的小水貂體重更高。

不同試驗(yàn)組對(duì)水貂內(nèi)臟指數(shù)的影響，表2為不同處理組小水貂的內(nèi)臟指數(shù)(n＝5)

表2

數(shù)據(jù)分析：用spss軟件對(duì)水貂的內(nèi)臟器官進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用多重比較的方法。由表2得出，復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組的水貂各內(nèi)臟指數(shù)與對(duì)照組相比極顯著(P＜0.01)且顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，芽孢桿菌、乳酸菌、中藥組單獨(dú)作用組各內(nèi)臟器官的重量也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液液組顯著高于對(duì)照組及益生菌和中藥組(P＜0.05)。

血清免疫瓊擴(kuò)結(jié)果，表3為血清法氏囊病毒抗體效價(jià)。

表3

由表3計(jì)算得出：每個(gè)試驗(yàn)組血清效價(jià)較對(duì)照組分別升高了29％，24％，11％，17％，14％；30％，26％，15％，8％，12％?？梢缘贸鰪?fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液液組水貂血清法氏囊抗體含量與其它試驗(yàn)組相比有比較明顯的促進(jìn)作用。

ELISA試驗(yàn)結(jié)果分析，表4為不同處理組小水貂的OD值

由表4與圖2所示的，可以得出第一次測(cè)得的OD值除了E組之外其它試驗(yàn)組均比較接近，即在第一次免疫后水貂體內(nèi)的抗體含量差異不明顯；第二次由試驗(yàn)測(cè)得的OD值仍然比較接近，即水貂體內(nèi)的抗體含量相差不大；第三次免疫后復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組OD數(shù)值明顯高于其它試驗(yàn)組，說(shuō)明其體內(nèi)抗體含量與其它試驗(yàn)組相比數(shù)值升高的更大。

不同試驗(yàn)組對(duì)水貂空腸的粘膜厚度、絨毛長(zhǎng)度的影響

在光鏡下觀察得出，芽孢桿菌組、中藥組、復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液液組和對(duì)照組水貂空腸粘膜結(jié)構(gòu)均比較完整，并且層次分明，腸絨毛完整整齊。可見(jiàn)有明顯的支部，小腸粘膜上皮表面的紋狀緣結(jié)構(gòu)整齊均勻。與對(duì)照組相比，復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組小水貂空腸粘膜絨毛排列更加緊密，絨毛比較長(zhǎng)。

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論給水貂灌胃芽孢桿菌組、乳酸菌組、中藥組，還是灌胃復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組均能促進(jìn)水貂的增長(zhǎng)，但是灌胃復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組的水貂體重在兩周后與其它試驗(yàn)組相比遠(yuǎn)大于其它試驗(yàn)組。

不同試驗(yàn)組對(duì)水貂內(nèi)臟指數(shù)的影響

由試驗(yàn)可以得出復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組在促進(jìn)小水貂內(nèi)臟器官的生長(zhǎng)方面與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。灌胃乳酸菌組、芽孢桿菌組和中藥組對(duì)臟器指數(shù)的影響與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)。表明復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組對(duì)水貂的內(nèi)臟指數(shù)方面效果更顯著。

不同試驗(yàn)組對(duì)法氏囊抗體效價(jià)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示不同試驗(yàn)組的水貂抗體效價(jià)與對(duì)照組相比差異顯著，但是復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥保健液組水貂的血清效價(jià)較對(duì)照組在第一次和第二次分別升高了29％和30％，與其它試驗(yàn)組相比數(shù)值變化較大。表明復(fù)合益生菌中草藥保健液在增強(qiáng)抗體的效價(jià)方面效果更顯著。

所以，本發(fā)明專(zhuān)利對(duì)水貂的生長(zhǎng)增重，內(nèi)臟器官的生長(zhǎng)，雞法氏囊抗體效價(jià)的升高以及腸道微絨毛的長(zhǎng)度及腸壁厚度均有比較明顯的促進(jìn)作用，大幅度提高了水貂的性能。

當(dāng)然，以上說(shuō)明僅僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，本發(fā)明并不限于列舉上述實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)下，所做出的所有等同替代、明顯變形形式，均落在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)質(zhì)范圍之內(nèi)，理應(yīng)受到本發(fā)明的保護(hù)。