本發(fā)明屬于生物發(fā)酵
技術領域：
，具體涉及一種以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合物及其制備方法。
背景技術：
：冬蟲夏草主要指子囊菌門中蟲草屬真菌，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有止咳、化痰、降低膽固醇、調節(jié)和增強免疫力、抗腫瘤等藥理作用。冬蟲夏草悠久的應用歷史和豐富多彩的生物活性激起許多科學工作者的高度研究熱情。大量的現(xiàn)代藥理研究表明蟲草菌絲體、生藥、醇和水或乙酸乙酯等提取物具有廣泛藥理活性，其活性涉及到對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、肝臟和腎臟功能、機體代謝等各個方面，具有調節(jié)免疫、降血脂、保護肝臟腎臟和心腦組織、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、抗菌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)靜和抗輻射等多方面作用。到目前為止，除了常見的甘露醇、腺苷、麥角甾醇、氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素等外，還發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中含一些特有的活性成分，如蟲草素、蟲草酸以及蟲草多糖。然而，對上述各個活性成分的確切功效尚未有清晰的研究結論。目前普遍認為蟲草中的核苷類物質(腺苷、尿苷、鳥苷)是冬蟲夏草的主要有效成分之一，尤其是蟲草腺苷，它具有明顯的藥理作用，如改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質釋放和調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等。蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素、3’-脫氧腺苷,也是一種腺苷，它具有中醫(yī)醫(yī)理中的陰陽同補和雙向調節(jié)人體平衡的功能，可以護肝、保腎、潤肺、大補氣血。從西醫(yī)醫(yī)理角度看，蟲草素具有抗腫瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫調節(jié)、改善新陳代謝、清除自由基等多種藥理作用，有良好的臨床應用前景。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內，能產生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的微生物的總稱。益生菌主要包括：雙歧桿菌、乳桿菌、放線菌、酵母菌等，隨著研究手段的進步，近年來又有許多益生菌被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。人體腸道內益生菌的主要作用包括：1.幫助營養(yǎng)物質的消化吸收。許多益生菌株在胃腸道內可產生消化酶，這些酶可幫助人體更好地消化所攝入的食品及吸收食品中的營養(yǎng)成分。益生菌還可競爭性抑制有害微生物吸收營養(yǎng)物質及進入血液循環(huán)系統(tǒng)。嗜酸乳桿菌是這方面的代表菌株，可分泌消化乳糖的乳糖酶，從而緩解乳糖不耐癥。2.產生重要的營養(yǎng)物質。益生菌能產生維生素，包括泛酸、尼克酸、B1,B2,B6及維生素K等，同時能產生短鏈脂肪酸、抗氧化劑、氨基酸等等，對骨骼成長和心臟健康有重要作用。3.抵抗細菌病毒的感染，提升免疫通過三大步驟，益生菌可清除有害菌對身體的傷害：1)抑制有害菌的生長。益生菌通過產生殺滅有害菌的化學物質，及與有害菌競爭空間和資源而遏制它們的生長。2)抑制有害菌產生毒素。3)清除有害菌產生的毒素。4.預防和治療某些疾病，如腸道綜合癥、呼吸道感染、生殖系統(tǒng)感染、過敏、口臭、胃潰瘍等。人體許多健康問題都是由體內菌群失衡引起，可通過使體內菌群重新達到生態(tài)平衡來實現(xiàn)緩解與治療的目的。例如腹瀉、便秘、陰道感染等癥狀，經(jīng)過多年的研究和實踐，證明使用經(jīng)臨床證實的特定益生菌可有效地進行治療。目前，益生菌已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農業(yè)等領域。代生素(Postbiotic)是益生菌代謝產物中的非生命物質，它可以發(fā)揮益生菌的生物學作用。代生素是近年來國際益生菌研究領域出現(xiàn)的一個新詞匯，對于究竟有哪些物質可以稱作代生素？代生素的有效成分有哪些？代生素由哪些益生菌產生？目前學術界對上述問題尚了解得極少。通常地，我們可以把益生菌生長到一定階段后提取的有生物學作用的有效成分作為代生素。盡管人們認識到蟲草腺苷是蟲草的主要有效成分之一，也認識到益生菌及代生素對人體腸道微生態(tài)平衡的重要調節(jié)作用，但迄今為止并沒有把蟲草腺苷與益生菌及代生素相關聯(lián)起來的研究報道。申請人研究結果證實了蟲草腺苷被益生菌轉化后的產物可以發(fā)揮代生素的作用。鑒于此，本專利提供了一種以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合物及其制備方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供了一種以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合物及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：一種以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合物，將益生菌接種于含有蟲草腺苷提取物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，即獲得以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合發(fā)酵物；其中，蟲草腺苷提取物從蟲草或蟲草培養(yǎng)殘基中提取獲得，蟲草提取物的添加量占發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.1-5.0％。用于發(fā)酵接種的益生菌種子液中的益生菌含量不少于1×108CFU/ml，接種量在發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1-20％。所述蟲草為冬蟲夏草、蛹蟲草、蟲草菌絲體中的一種或多種的混合物；所述蟲草腺苷提取物為粗提液或將粗提液進一步純化、濃縮的濃縮液；所述蟲草腺苷提取物中包含蟲草素與蟲草腺苷等。其中，粗提液為將所述蟲草或蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉碎，而后與水按體積比1:2-20的比例混合，混合后經(jīng)20-60℃浸提1-10小時，然后過濾，濾渣重復上述提取2-3次，將所得濾液合并，即為粗提液；或蛹蟲草液態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵液過濾后，即得粗提液；濃縮液為將粗提液過濾后經(jīng)反相ODS填料柱吸附洗脫，每升濾液添加20-60g的填料，而后依次用5-15個柱體積的水、5-15個柱體積的乙醇水溶液和乙醇洗脫，收集洗脫液再經(jīng)濃縮即為蟲草腺苷濃縮液；其中，所述乙醇水溶液為體積百分比5-30％的乙醇水溶液；ODS填料粒徑小于等于150μm。收集洗脫液再經(jīng)濃縮即得到含量約1-20％的蟲草腺苷濃縮液。所述益生菌發(fā)酵分為活化階段、前期發(fā)酵和后期發(fā)酵，益生菌的活化階段采用活化培養(yǎng)基，28-37℃，厭氧培養(yǎng)6-36小時；益生菌的前期發(fā)酵采用發(fā)酵培養(yǎng)基，28-37℃，厭氧培養(yǎng)6-36小時；在益生菌的后期發(fā)酵階段向發(fā)酵培養(yǎng)集中加入蟲草腺苷粗提液(包括蟲草素與蟲草腺苷等)，粗提液的加入量占發(fā)酵體積的0.5-25％，繼續(xù)發(fā)酵24-72小時至發(fā)酵結束。所述益生菌活化培養(yǎng)基，其配方為：酪蛋白胨10g，酵母浸出粉2.5g，葡萄糖5g，大豆蛋白胨5g，吐溫-801.0ml，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，混合鹽溶液5ml和蒸餾水995ml，經(jīng)過115℃、30分鐘滅菌，待用；其中，混合鹽溶液：K2HPO420.0g，MgCl2·6H2O5.0g，ZnSO4·7H2O2.5g，CaCl21.5g和FeCl30.5g，加蒸餾水至100ml。。所述益生菌發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨5.0g,牛肉膏5.0g,胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫-801.0ml，K2HPO42.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，ZnSO4·7H2O0.25g，MgSO4·7H2O0.1g，加蒸餾水至1000ml；經(jīng)115℃、30分鐘滅菌，待用。所述益生菌為雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、酵母菌中的一種或多種混合物。用于發(fā)酵接種的益生菌種子液中的益生菌含量不少于1×108CFU/ml，接種量在發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1-20％。所述的蟲草腺苷提取物的粗提液或濃縮液，在使用前需經(jīng)115℃、30分鐘滅菌。所述以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合發(fā)酵物經(jīng)機械加工方法，制成液體、膏劑、顆粒劑或片劑。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明通過益生菌在含有蟲草腺苷提取物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，利用蟲草腺苷為底物，將蟲草腺苷被益生菌轉化后的產物可以發(fā)揮代生素的作用，即能獲得大量益生菌，又能保留大部分蟲草活性物質，還能產生由益生菌轉化蟲草腺苷而成的新代謝產物，從而發(fā)揮益生菌與蟲草活性物質的雙重功效，起到調整腸道菌群生態(tài)平衡、提高免疫力、促進人體健康等作用。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，實施例只用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據(jù)上述本發(fā)明的內容作出的一些非本質的改進和調整也屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明從蟲草或蟲草固體培養(yǎng)殘基提取蟲草腺苷，以上述蟲草腺苷提取物為底物，進行益生菌發(fā)酵，獲得的發(fā)酵產物中既包含大量益生菌，又同時保留了大部分蟲草活性物質，還獲得蟲草腺苷經(jīng)由益生菌代謝后的新活性物質，從而具有調整腸道菌群生態(tài)平衡、提高免疫力、促進人體健康等功效。實施例1：1)蟲草腺苷粗提液的獲得：將蛹蟲草子實體粉碎后，與水按體積比1:5的比例混合，混合后經(jīng)40℃浸提6小時，然后過濾，濾渣重復上述提取2次，將所得濾液合并，得蟲草腺苷粗提液。2)益生菌發(fā)酵：采用嬰兒雙歧桿菌作為益生菌進行發(fā)酵，發(fā)酵分為三個階段，即活化階段、前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。益生菌的活化階段采用活化培養(yǎng)基，在37℃，厭氧培養(yǎng)24小時；益生菌的前期發(fā)酵采用發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃，厭氧培養(yǎng)36小時。在益生菌的后期發(fā)酵階段加入蟲草素與上述獲得蟲草腺苷粗提液，蟲草素與上述獲得蟲草腺苷粗提液的加入量約占發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5％，在37℃下繼續(xù)厭氧發(fā)酵36小時至發(fā)酵結束，即獲得發(fā)酵產物。上述用于發(fā)酵接種的嬰兒雙歧桿菌種子液中的益生菌含量為5×108CFU/ml，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8％。實施例2：1)蟲草腺苷濃縮液的獲得：將冬蟲夏草子實體粉碎后，與水按體積比1:5的比例混合，混合后經(jīng)40℃浸提6小時，然后過濾，濾渣重復上述提取3次，將所得濾液合并，得粗提液。把上述粗提液過濾，濾液經(jīng)反相ODS填料柱吸附，每升濾液添加40g的填料，而后依次用6個柱體積的水、6個柱體積的乙醇水溶液和乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮后成為蟲草腺苷濃縮液；其中，所述乙醇水溶液為體積百分比10％的乙醇水溶液；ODS填料粒徑小于等于60μm。收集洗脫液后采用乙醇對柱子再生，循環(huán)利用。2)益生菌發(fā)酵：采用嗜酸乳桿菌作為益生菌進行發(fā)酵，發(fā)酵分為三個階段，即活化階段、前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。活化階段采用活化培養(yǎng)基，37℃，厭氧培養(yǎng)12小時；前期發(fā)酵采用發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，厭氧培養(yǎng)24小時。在后期發(fā)酵階段加入蟲草素與上述獲得蟲草腺苷提取物的濃縮液，蟲草腺苷提取物的濃縮液約占發(fā)酵液體積的2％，在37℃下繼續(xù)發(fā)酵24小時至發(fā)酵結束，即獲得發(fā)酵產物。在該發(fā)酵產物中獲得大量嗜酸乳桿菌，又能保留大部分蟲草活性物質，還能產生由益生菌轉化蟲草腺苷而成的新代謝產物。上述用于發(fā)酵接種的嗜酸乳桿菌種子液中的益生菌含量為1×109CFU/ml，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％。實施例3：1)蟲草腺苷粗提液的獲得：將蛹蟲草培養(yǎng)基(含有蟲草菌絲體及小麥或大米)粉碎后，與水按體積比1:3的比例混合，混合后經(jīng)30℃浸提8小時，然后過濾，濾渣重復上述提取2次，將所得濾液合并，得粗提液。2)益生菌發(fā)酵：采用酵母菌作為益生菌進行發(fā)酵，發(fā)酵分為三個階段，即活化階段、前期發(fā)酵和后期發(fā)酵?；罨A段采用活化培養(yǎng)基，28℃，厭氧培養(yǎng)12小時；前期發(fā)酵采用發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，厭氧培養(yǎng)12小時。在后期發(fā)酵階段加入上述獲得蟲草腺苷提取物粗提液，上述獲得蟲草腺苷提取物粗提液約占發(fā)酵體積的5％，繼續(xù)發(fā)酵48小時至發(fā)酵結束，即獲得發(fā)酵產物。在該發(fā)酵產物中獲得大量酵母菌，又能保留大部分蟲草活性物質，還能產生由益生菌轉化蟲草腺苷而成的新代謝產物。上述用于發(fā)酵接種的酵母菌種子液中的益生菌含量為5×108CFU/ml，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％。實施例4：1)蟲草腺苷濃縮液的獲得：將蛹蟲草子實體粉碎后，與水按體積比1:10的比例混合，混合后經(jīng)40℃浸提8小時，然后過濾，濾渣重復上述提取3次，將所得濾液合并，得粗提液。把上述粗提液過濾，濾液經(jīng)反相ODS填料柱吸附，每升濾液添加50g的填料，而后依次用8個柱體積的水、8個柱體積的乙醇水溶液和乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮后成為蟲草腺苷濃縮液；其中，所述乙醇水溶液為體積百分比25％的乙醇水溶液，ODS填料粒徑小于等于80μm，收集洗脫液后采用乙醇對柱子再生。2)益生菌發(fā)酵：采用長雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌作為益生菌進行發(fā)酵，發(fā)酵分為三個階段，即活化階段、前期發(fā)酵和后期發(fā)酵?；罨A段采用活化培養(yǎng)基，37℃，厭氧培養(yǎng)8小時；在益生菌的發(fā)酵階段加入蟲草腺苷提取物濃縮液，占發(fā)酵體積的2％，繼續(xù)發(fā)酵36小時至發(fā)酵結束，即獲得發(fā)酵產物。在該發(fā)酵產物中既獲得了大量長雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌，又能保留大部分蟲草活性物質，還產生由益生菌轉化蟲草腺苷而成的新代謝產物。上述用于發(fā)酵接種的長雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌種子液中的益生菌含量為1×109CFU/ml，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5％。同時，將上述實施例1-4獲得的以蟲草腺苷為底物的代生素與益生菌復合發(fā)酵物經(jīng)機械加工方法，制成液體、膏劑、顆粒劑或片劑。上述實施例1-4中的活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：活化培養(yǎng)基，其配方為：酪蛋白胨10g，酵母浸出粉2.5g，葡萄糖5g，大豆蛋白胨5g，吐溫-801.0ml，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，混合鹽溶液5ml和蒸餾水995ml，經(jīng)過115℃、30分鐘滅菌，待用；其中，混合鹽溶液：K2HPO420.0g，MgCl2·6H2O5.0g，ZnSO4·7H2O2.5g，CaCl21.5g和FeCl30.5g，加蒸餾水至100ml。。發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨5.0g,牛肉膏5.0g,胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫-801.0ml，K2HPO42.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，ZnSO4·7H2O0.25g，MgSO4·7H2O0.1g，加蒸餾水至1000ml；經(jīng)115℃、30分鐘滅菌，待用。上述實施例1-4中發(fā)酵產物提高小鼠免疫力的實驗如下：1.小鼠血清溶血素測定試驗動物：昆明種雌性小白鼠，體重18-22g。試驗方法：取雄性小鼠隨機分組：空白對照組、試驗組，小鼠每天灌胃給藥1次，每次給藥量為1.5g/kg，空白對照組給予等容量的蒸餾水。連續(xù)30d后分別對動物進行血清溶血素指標測定。血清溶血素測定：于灌胃第25天給小鼠腹腔注射2％SRBC(0.2ml/只)，于免疫后第5天摘眼球采血，分離血清并在微量血凝板上進行血清溶血素測定：37℃孵育3h，統(tǒng)計血球凝集度，計算相應抗體積數(shù)。試驗結果見表1。2.小鼠抗體生成細胞檢測試驗方法：取雄性小鼠隨機分組：空白對照組、試驗組，小鼠每天灌胃給藥1次，每次給藥量為1.5g/kg，空白對照組給予等容量的蒸餾水。連續(xù)30d后分別對動物進行抗體生成細胞(PFc)檢測指標測定?？贵w生成細胞(PFc)檢測：于灌胃第25天給小鼠腹腔注射2％SRBC0.2ml/只，于免疫后第5天處死，解剖取脾制備脾細胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整脾細胞濃度為5x109個/L。按程序方法制備瓊脂糖玻片，在CO2培養(yǎng)箱(37℃、5％CO2)中溫育1.5h后加補體，再溫育1.5h，計數(shù)每張瓊脂薄層玻片上形成的溶血空斑數(shù)。試驗結果見表1。上述小鼠免疫力指標的試驗結果表明，本發(fā)明所獲得的代生素與益生菌復合物具有很好提高免疫力的作用。表1.對小鼠血清溶血素和抗體生成細胞檢測結果組別動物數(shù)(只)抗體積數(shù)溶血空斑數(shù)(個/106脾細胞)對照組9135.2±6.3595±104實施例19174.4±11.7667±132實施例29181.9±15.3815±201實施例39165.5±15.6724±198實施例49213.1±20.8833±220當前第1頁1 2 3