技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于動物保健用品，具體就是一種動物使用的防御素保健制劑品。

背景技術(shù)：
：

防御素(defensins)是生物體在抵御病原微生物侵襲的防御反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一種基本物質(zhì)，分子量一般在4kd-10kd之間。防御素的功能和應(yīng)用情況如下：

(1)防御素在機(jī)體的防御系統(tǒng)中起重要作用

動物每天會直接接觸、食入、吸入大量的病原微生物而不患感染性疾病，這種抵抗外來致病微生物的能力主要是通過天然免疫的防御機(jī)制得以實(shí)現(xiàn)的。防御素是所有物種中天然防御機(jī)制的重要組成部分，具有廣譜的抗菌活性，能殺滅革蘭氏陰性菌及陽性菌、真菌、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞以及一些囊膜病毒如hiv、肝炎病毒等。防御素通過趨化作用參與機(jī)體的獲得性免疫過程，實(shí)驗(yàn)證明a-防御素能夠吸引t細(xì)胞，有趨化作用，使之回流至炎癥部位，從而在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。防御素的趨化作用有利于炎癥效應(yīng)細(xì)胞及效應(yīng)分子向感染部位的回流，使機(jī)體能更有效的殺滅病原微生物。防御素還具有提高動物免疫水平和特異性免疫抗體水平，調(diào)節(jié)動物的生長發(fā)育。從另一方面來講，防御素也是獲得性免疫反應(yīng)中效應(yīng)細(xì)胞的重要活性介質(zhì)，例如在b細(xì)胞能合成防御素，對入侵的病源微生物起直接殺菌作用，所以防御素是天然免疫與機(jī)體獲得性免疫的橋梁，在機(jī)體抵御外來病原微生物的入侵中起著重要的作用。

(2)防御素有重要的應(yīng)用價(jià)值

防御素對很多病原微生物有殺滅作用，包括一些抗生素耐藥株，它們能快速殺滅病原微生物而不易產(chǎn)生耐藥的突變株，還能促進(jìn)動物生長，誘導(dǎo)動物的獲得性免疫。防御素與一些傳統(tǒng)的抗生素、其他抗菌分子、溶菌酶有協(xié)同作用。因此更多的研究焦點(diǎn)是將其發(fā)展為新的抗微生物藥，應(yīng)用在治療感染，食品防腐劑，飼料添加劑等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了充分發(fā)揮防御素的抗病原微生物的作用，本發(fā)明的目的是提供一種利用鴕鳥皮膚提取制作的動物防御素保健制品。

本發(fā)明的技術(shù)方案是以下述方式實(shí)現(xiàn)的：

一種動物防御素保健制品：它是以液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚為原料、經(jīng)過下述制作步驟：

(1)將液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚置5％～5.5％乙酸冰水混合物中混合、勻漿、水浴、離心、上清液浸提過夜；

(2)將步驟(1)中的沉淀物用等體積5％～5.5％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液：

(3)合并步驟(1)、(2)中的兩次上清液，調(diào)整ph值至6.0，離心，保留上清液；

(4)將上清液上樣于sephadexg-100凝膠柱，用乙酸鈉洗脫，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測后，自動收集器收集，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍干燥保存，真空度-60kpa～-75kpa、冷凍干燥溫度為-10℃～-15℃、時(shí)間為18h～20h，制得防御素制品上述步驟1中液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚重量與乙酸冰水混合物的體積比按1:10～15，上述步驟1中水浴的溫度為95℃～100℃滅活樣品中的其他微生物、時(shí)間為10min～12min，然后迅速冷卻至室溫；

上述步驟4中乙酸鈉水溶液濃度為0.20mol/l～0.25mol/l。

上述步驟中(1)：

所述的液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚冷凍需先剪碎；所述的離心速度為4000r/min、時(shí)間為40min。

上述步聚4中：

所述的自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml。

上述步聚4中：

所述的乙酸鈉水溶液濃度為0.2mol/l，恒流泵的速度為4滴/分，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測后有od值，收集值在0.3～0.6的收集管，意味著有蛋白。

上述防御素制品在制備動物保健食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：低溫/室溫保存對防御素空間結(jié)構(gòu)影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經(jīng)真空冷凍可有效保存其活

防御素的活性檢測:

鴕鳥皮膚經(jīng)乙酸浸提，sephadexg-100葡聚糖凝膠分離后，出現(xiàn)兩個(gè)峰，選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行體外抗菌活性試驗(yàn)。結(jié)果表明：提取的抗菌肽對g+和g-都有抑菌作用，且抑菌作用的主要在第二峰，但皮膚抗菌肽對大腸桿菌的抑菌結(jié)果更明顯。1g鴕鳥皮膚經(jīng)乙酸(1:10w/v)提取后，一般可得到12ml提取液。sephadexg-100每次分離2ml提取液，一般得到5ml有抑制細(xì)菌活性的洗脫液，經(jīng)真空冷凍干燥，可得到約5mg含有少量的乙酸鈉鹽成分及一些雜蛋白的蛋白成分，有效抑菌濃度為3.2-6.4mg/ml。

本發(fā)明的積極效果是：

本發(fā)明防御素制品可調(diào)節(jié)動物免疫功能，包括促進(jìn)中樞免疫功能，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。防御素上調(diào)雞免疫器官的免疫反應(yīng)，法氏囊和胸腺是中樞免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)生，分化，成熟的場所。脾臟是外周免疫器官捕獲和消化抗原。鴕鳥皮膚防御素(1μg/ml)作為無害抗原促進(jìn)中樞免疫器官的成熟。我們的實(shí)驗(yàn)通過觀察組織學(xué)切片也沒有檢測到防御素對細(xì)胞的損傷，也證明了在實(shí)驗(yàn)中使用的鴕鳥皮膚防御素濃度沒有發(fā)現(xiàn)毒性作用?？赡苡胁糠著r鳥皮膚防御素在消化道被蛋白酶降解，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明口服途徑還是有效果。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明的鴕鳥皮膚抗菌肽粗提物在sephadexg-100層析行為。

圖2為鴕鳥皮膚抗菌肽對抗原刺激的雛雞免疫器官淋巴細(xì)胞增殖的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例一

取液氮冷凍的新鮮鴕鳥皮膚，稱重，剪碎；按鴕鳥皮膚與乙酸冰水混合物的重量體積(w/v)比為1:10比例加入5％乙酸冰水混合物，手動勻漿器勻漿，100℃水浴10min，然后迅速冷卻，4000r/min離心30min去除沉淀。取上清液4℃浸提過夜，將沉淀物用等體積5％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液。合并兩次上清液，調(diào)整ph值至6.0，4000r/min離心30min，保留上清液。將上清液上樣于sephadexg-100凝膠柱，用0.2mol/l乙酸鈉溶液洗脫，恒流泵的速度為4滴/分，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測有od值，收集值在0.3的收集管，自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍干燥保存。

低溫/室溫保存對防御素空間結(jié)構(gòu)影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經(jīng)真空冷凍干燥，真空度-60kpa、冷凍溫度-10℃、時(shí)間18h，可有效保存其活性。

實(shí)施例二

取液氮冷凍的新鮮鴕鳥皮膚，稱重，剪碎；按鴕鳥皮膚與乙酸冰水混合物的重量體積(w/v)比為1:10～15比例加入5.5％乙酸冰水混合物，手動勻漿器勻漿，100℃水浴10min，然后迅速冷卻，4500r/min離心40min去除沉淀。取上清液4℃浸提過夜，將沉淀物用等體積5.5％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液。合并兩次上清液，調(diào)整ph值至6.0，4500r/min離心40min，保留上清液。將上清液上樣于sephadexg-100凝膠柱，用0.2mol/l乙酸鈉水溶液洗脫，恒流泵的速度為4滴/分，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測有od值，收集值在0.3的收集管，自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍干燥保存。

低溫/室溫保存對防御素空間結(jié)構(gòu)影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經(jīng)真空冷凍干燥，真空度-65kpa、冷凍溫度-12℃、時(shí)間19h，可有效保存其活性。

實(shí)施例三

取液氮冷凍的新鮮鴕鳥皮膚，稱重，剪碎；按鴕鳥皮膚與乙酸冰水混合物的重量體積(w/v)比為1:12比例加入5.2％乙酸冰水混合物，手動勻漿器勻漿，100℃水浴10min，然后迅速冷卻，4200r/min離心42min去除沉淀。取上清液4℃浸提過夜，將沉淀物用等體積5.2％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液。合并兩次上清液，調(diào)整ph值至6.0，4300r/min離心40min，保留上清液。將上清液上樣于sephadexg-100凝膠柱，用0.2mol/l乙酸鈉水溶液洗脫，恒流泵的速度為4滴/分，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測有od值，收集值在0.3的收集管，自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍干燥保存。

低溫/室溫保存對防御素空間結(jié)構(gòu)影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經(jīng)真空冷凍干燥，真空度-75kpa、冷凍溫度-15℃、時(shí)間20h，可有效保存其活性。

本發(fā)明防御素制器的應(yīng)用實(shí)例如下：

一、1ug/ml的防御素可調(diào)節(jié)動物免疫功能，包括促進(jìn)中樞免疫功能，增強(qiáng)疫苗的免疫效果如表1、表2。

表1鴕鳥皮膚防御素對雛雞免疫器官指數(shù)和體重的影響

注：免疫器官指數(shù)＝免疫器官重量(mg)/雛雞體重(g)

表2雛雞免疫ibd疫苗后血清中ibdv抗體滴度的變化(490nmod)

ibd：雞傳染性法氏囊炎

ibdv：雞傳染性法氏囊炎病毒

從表1、表2中可以看出：為研究鴕鳥皮膚防御素是否對雛雞的體重有影響，本研究在1、4、7、10、17日齡對雛雞的體重進(jìn)行了記錄，結(jié)果見表1。由此結(jié)果可知，對照組和鴕鳥皮膚防御素組雛雞的體重?zé)o明顯差別，統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。為研究鴕鳥皮膚防御素是否對雛雞的免疫器官指數(shù)有影響，本研究在1、4、7、10、17日齡對雛雞的免疫器官重量和體重進(jìn)行了記錄，并計(jì)算免疫器官指數(shù)，結(jié)果見表1。由此結(jié)果可知，與對照組比較，鴕鳥皮膚防御素提高了7～17日齡雛雞的胸腺指數(shù)，4～7日齡雛雞的法氏囊指數(shù)并且在4日齡差異顯著(p<0.10)。鴕鳥皮膚防御素組4～17日齡雛雞的脾臟指數(shù)低于對照組雛雞，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。

為研究鴕鳥皮膚防御素與疫苗是否有協(xié)同作用，本研究對鴕鳥皮膚防御素組和對照組雛雞常規(guī)滴鼻點(diǎn)眼接種ibdv疫苗，在疫苗免疫后選取一些時(shí)間點(diǎn)觀察兩組雛雞血清中ibdv抗體滴度的變化。結(jié)果見表2，由結(jié)果可見在實(shí)驗(yàn)的觀察期間，即疫苗免疫后14～35d，鴕鳥皮膚防御素組雛雞血清中ibdv抗體水平高于對照組，并且在第21d明顯高于對照組，且差異顯著(p<0.05)。

從圖1中可以看出：本發(fā)明防御素制品對多種細(xì)菌病毒有明顯的抑制或殺滅作用，如對多殺性巴氏桿菌有殺滅作用，最低殺死濃度0.16mg/ml。從圖1中還可以看出：有抑菌作用的主要在第二峰，瓊脂糖彌散方法檢測洗脫液對巴氏桿菌的抑菌作用，主要集中在7～10管。

從圖2中可知：鴕鳥皮膚抗菌肽對抗原刺激的雛雞免疫器官淋巴細(xì)胞增殖的影響中可以看出：由于此防御素在功能上具有免疫調(diào)節(jié)作用，可開發(fā)為綠色環(huán)保型動物保健劑。