專利名稱:適冷蛋白酶mcp-01在肉類嫩化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明涉及適冷蛋白酶MCP-Ol在肉類嫩化中的應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上最大的肉類生產(chǎn)國(guó)，但高新技術(shù)在我國(guó)肉制品加工業(yè)的應(yīng)用還較薄弱，精深加工的肉制品很少。在肉的食用品質(zhì)中，嫩度是消費(fèi)者最為重視的感官指標(biāo)之一。肉質(zhì)柔軟細(xì)嫩而多汁的肉，消費(fèi)者比較樂(lè)于接受。肉的硬度包括兩部分由肌原纖維變化造成的肌動(dòng)球蛋白硬度和由于結(jié)締組織變化造成的背景硬度。目前，肉類嫩化的方法有很多，但從效果看來(lái)，采用蛋白酶嫩化的方法最為先迸。它可以在適當(dāng)溫度下溫和地降解肉類蛋白質(zhì)，從而提高嫩度。方法簡(jiǎn)便，所用時(shí)間短，ロ感獨(dú)特，顯著提高經(jīng)濟(jì)效率，避免不必要的浪費(fèi)。
目前已用于商業(yè)的肉類嫩化酶有植物性蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶)、細(xì)菌性蛋白酶(枯草桿菌的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜熱芽孢桿菌的耐熱性蛋白酶)、動(dòng)物蛋白酶(胰酶、膠原酶)等幾大類。這些酶均具有降解膠原蛋白或弾性蛋白的能力。目前研究和應(yīng)用的所有肉類嫩化酶均為中高溫蛋白酶，這些蛋白酶的最適酶活溫度都在50°C或以上，在0_4°C下酶活很低，因此一般在40°C以上應(yīng)用。另外，中高溫蛋白酶對(duì)熱比較穩(wěn)定，這會(huì)使肉類嫩化酶在完成嫩化后難以滅活。適冷膠原蛋白酶在低溫和室溫下具有較高的酶活，可以在室溫下對(duì)肉制品進(jìn)行快速嫩化。而且適冷酶具有熱敏感性，在中溫條件下就容易失活，從而使嫩化酶在完成嫩化后容易被滅活。適冷膠原蛋白酶的這些特點(diǎn)使其在肉類嫩化中具有很好的應(yīng)用潛力。因此，適冷膠原蛋白酶在肉制品的嫩化方面中具有廣闊的應(yīng)用前景，但是目前尚沒(méi)有具有肉類嫩化功能的適冷膠原蛋白酶的報(bào)道，也沒(méi)有商品化的適冷肉類膠原蛋白酶。
公開(kāi)號(hào)為CN101045933A(申請(qǐng)?zhí)?00710013366. 2)的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了ー種適冷蛋白酶的基因MCPOl及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。該發(fā)明含有深海適冷蛋白酶基因MCPOl的2676BP基因組DNA片段，其中含有ー個(gè)具有2508個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框架，該開(kāi)放閱讀框架即是編碼蛋白酶MCP-Ol的基因，由蛋白酶MCP-Ol的基因MCPOl表達(dá)的適冷蛋白酶最適酶活溫度為35°C左右，最適PH為9.0，可用于低溫肉的保鮮、增鮮，乳制品的加工、洗滌劑等行業(yè)。但該申請(qǐng)只提到適冷蛋白酶MCP-Ol具有保鮮、增鮮的作用，并沒(méi)有提及其在低溫肉類嫩化方面的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供適冷蛋白酶MCP-Ol在肉類嫩化中的應(yīng)用。該適冷蛋白酶MCP-OI能在肉類保鮮冷藏過(guò)程中或常溫下對(duì)肉類進(jìn)行嫩化，改善肉類的ロ感。
適冷蛋白酶MCP-Ol在肉制品嫩化中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用，步驟如下[0008](I)將適冷蛋白酶MCP-Ol配制成濃度為5 20 μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液；
(2)將待嫩化的肉洗凈后，浸入步驟(I)制得的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液中，O 8°C保藏18 30小時(shí)。
所述步驟(I)的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液濃度為10 15 μ g/ml。
所述步驟(2)中在O 4°C保藏20 25小時(shí)。
上述保藏溫度為4°C。
所述步驟(2)中的肉為含有膠原蛋白的各種供人食用的動(dòng)物組織。
上述適冷蛋白酶MCP-Ol的制備可通過(guò)如下菌株制得
深海適冷菌假交替單胞菌株(Pseudoalteromonas) SM9913, 2010年12月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。菌種保藏號(hào)CCTCC NO M2010336o
上述適冷蛋白酶MCP-Ol可利用上述菌株通過(guò)如下方法制得
取深海適冷菌假交替單胞菌株SM9913經(jīng)種子培養(yǎng)后接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，10 15°C震蕩培養(yǎng)55 70小時(shí)，初次離心后，上清液加入硫酸銨粉末至終濃度為50 55wt%，二次離心后，沉淀溶于Tris-HCl中，三次離心后，取上清液，2 8°C下聚こニ醇20000超濾濃縮，濃縮液在2 8°C下經(jīng)柱層析分離，回收酶活峰的峰尖部分，即得適冷蛋白酶 MCP-OI。
所述種子培養(yǎng)為在固體培養(yǎng)基中12 15°C培養(yǎng)48 70小時(shí)后；再于液體培養(yǎng)基中12 15°C震蕩培養(yǎng)20 30小時(shí)；固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. O 7. 2 ;
液體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. O 7. 2。
所述初次離心條件為10000g，2 8°C離心15分鐘；二次離心條件為8000g，2 8°C離心10分鐘；三次離心條件為:10000g，2 8°C離心20分鐘。
所述Tris-HCl的濃度為20mmol/l, pH 8. 5 ;所述層析柱為Sephardex GlOO層析柱。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份
豆餅粉3. 5 4. O份、玉米粉2. O 2. 5份、麩皮2. O 2. 5份、Na2HPO4O. 3 O. 4份、KH2P040. 04 O. 05 份、水 100 份。
本發(fā)明的優(yōu)良效果在于
(I)本發(fā)明所述適冷蛋白酶MCP-Ol在0°C時(shí)仍能保持最適溫度下酶活力的12.5%，在低溫冷藏條件下(0-4 °C)以及室溫下能夠提高肉制品的嫩度；該蛋白酶可在O 4°C下特異性降解肉類結(jié)締組織中的膠原蛋白，在肉類嫩化過(guò)程中具有很好的應(yīng)用潛力。
(2)適冷蛋白酶MCP-Ol的熱穩(wěn)定性較差，在中高溫條件下很容易失活，從而使酶在完成嫩化后容易被滅活；該酶隨著溫度的提高，自溶速度増加，從而當(dāng)肉類烹制加工后，該酶會(huì)完全失活，因而不會(huì)造成對(duì)肉類的污染。
(3)適冷蛋白酶MCP-Ol能較好的保持肉制品的新鮮色澤和持水性。


圖1、純化的適冷蛋白酶MCP-Ol的毛細(xì)管電泳檢測(cè)圖；
圖2、溫度對(duì)適冷蛋白酶MCP-Ol降解牛肌腱不可溶膠原蛋白活力的影響；
圖3、適冷蛋白酶MCP-Ol處理對(duì)牛胸肌剪切力的影響的柱狀圖；
圖4、不同的嫩化酶處理對(duì)牛胸肌失水率的影響的柱狀圖；
其中對(duì)照、未添加任何蛋白酶；MCP_01、添加適冷蛋白酶MCP-01 ;Bromelain、添加菠蘿蛋白酶；Papain、添加木瓜蛋白酶；
圖5、不同的嫩化酶處理對(duì)牛胸肌色澤影響的照片；
其中Control、未添加任何蛋白酶；MCP_01、添加適冷蛋白酶MCP-01 ；Bromelain>添加菠蘿蛋白酶；Papain、添加木瓜蛋白酶。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說(shuō)明，但不限于此。
實(shí)施例中所述深海適冷菌假交替單胞菌株(Pseudoalteromonas) SM9913, 2010年12月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào)CCTCC NOM2010336。
人工海水素購(gòu)自中國(guó)海洋大學(xué)海水素廠，弾性蛋白購(gòu)自Sigma公司，魚(yú)不可溶月交原蛋白為采用 Song 等的方法(Song, E. , Kim, S. Y. , Chun, T. , Byun, H. -J. , and Lee,Y. Μ. (2006) Biomaterials 27,2951-2961)從魚(yú)皮中提取，牛肌腱不可溶膠原蛋白購(gòu)自WorthingtonBiochemical Co.,牛酸溶I型膠原蛋白購(gòu)自Sigma公司，牛II型膠原蛋白購(gòu)自Sigma公司，牛IV型膠原蛋白購(gòu)自Sigma公司。
實(shí)施例I
深海適冷菌假交替單胞菌株SM9913制備適冷蛋白酶MCP-Ol的方法，步驟如下
I.液體種子的制備
以蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. O 7. 2，(均
為重量份)配制固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌，冷卻后，在試管斜面上劃線接種深海適冷菌假交替單胞菌株(Pseudoalteromonas) SM9913，12 15°C培養(yǎng)48 70小時(shí)。將上述菌種接種裝有150ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中(配方同固體培養(yǎng)基，不添加瓊脂)，12 15°C，200轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，用作液體種子。
2.液體深層發(fā)酵制備適冷蛋白酶制劑
以豆餅粉3. 5 4. O份、玉米粉2. O 2. 5份、麩皮2. O 2. 5份、Na2HPO4O. 3
O.4份、KH2PO4O. 04 O. 05份和水100份，均為重量份，配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌，按5 7%重量百分比接種步驟I制備的液體種子，通風(fēng)、攪拌、控制轉(zhuǎn)速200rpm，15°C培養(yǎng)60小時(shí)。
3.適冷蛋白酶MCP-Ol的分離純化
將上述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基4°C，10，OOOg離心15分鐘，上清液在冰浴中緩慢攪拌加入硫酸銨粉末至終濃度為55wt%，8000g離心10分鐘。沉淀溶于pH 8. 5,20mmol/l Tris-HCl中，于4°C，IOOOOg離心20分鐘，取上清液，裝于超濾袋，4°C下用聚こニ醇20000濃縮，濃縮液經(jīng)Sephardex GlOO柱層析分離，回收酶活峰的峰尖部分。所有的操作均在15°C以下進(jìn)行。分離的蛋白酶用毛細(xì)管電泳檢測(cè)純度(如圖1)，命名為適冷蛋白酶MCP-01。
4.適冷蛋白酶MCP-Ol的性質(zhì)測(cè)定
4. I底物特異性
(I)Bradford法測(cè)定步驟3制備的適冷蛋白酶MCP-Ol的蛋白濃度。(Bradford法為本領(lǐng)域慣用技術(shù)，也可參考如下網(wǎng)址中的資料http://wenku. baidu. com/view/7b3ebld4195f312b3169a521. html)。
(2)測(cè)定酶對(duì)不可溶膠原蛋白的降解效率，不可溶膠原蛋白包括魚(yú)不可溶膠原蛋 白和牛肌腱不可溶膠原蛋白。酶活單位定義為每小時(shí)降解底物產(chǎn)生Inmol的L-亮氨酸所需要的酶量。具體步驟為稱取5mg的不可溶膠原蛋白，加入Iml濃度為10 μ g/ml的MCP-Ol酶液，置于40°C水浴中反應(yīng)5h。反應(yīng)中不斷晃動(dòng)反應(yīng)液，以保證不可溶底物與酶液的充分接觸。
(3)測(cè)定酶對(duì)可溶性底物降解效率，酶活單位定義為每分鐘降解底物產(chǎn)生Inmol的L-亮氨酸所需要的酶量。具體步驟為用50mM Tris-HCl (含O. 36mM CaCl2, pH 7. 5)配制不同的可溶底物溶液，包括牛酸溶I型膠原蛋白、牛II型膠原蛋白、牛IV型膠原蛋白，置于40°C水浴中反應(yīng)30min。
(4)上述步驟(2) (3)反應(yīng)結(jié)束后，10，00(^離心1011^11。取上清20 μ I加入100 μ I茚三酮-檸檬酸鈉溶液，沸水浴20min顯色，冷卻后加入500 μ I正丙醇，于600nm處測(cè)定吸光值。
(5)測(cè)定酶對(duì)彈性蛋白底物的降解效率，稱取5mg的彈性蛋白加入250 μ I濃度為10 μ g/ml的MCP-Ol酶液，置于40°C水浴中反應(yīng)60分鐘，10，OOOg離心IOmin終止反應(yīng)；取上清于595nm處測(cè)定吸光值。
(6)結(jié)果表明適冷蛋白酶MCP-Ol能夠特異性降解各種類型膠原蛋白，而對(duì)彈性蛋白沒(méi)有降解作用(結(jié)果如表I所示)。
4. 2最適酶活溫度測(cè)定
以牛肌腱不可溶膠原蛋白為底物，50mM Tris-HCl (含O. 36mM CaCl2,pH 7. 5)為緩沖體系，分別在0、10、20、30、40、50、55、60、70、80°C條件下測(cè)定膠原蛋白酶MCP-Ol的酶活，以確定酶的最適反應(yīng)溫度。測(cè)定酶活的具體方法為
稱取5mg的牛肌腱不可溶膠原蛋白，加入Iml濃度為10 μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol酶液，不同溫度下反應(yīng)5小時(shí)，10，OOOg離心lOmin。取上清20 μ I加入100 μ I茚三酮-朽1檬酸鈉溶液，沸水浴20min顯色,冷卻后加入500 μ I正丙醇,于600nm處測(cè)定吸光值，定義最高酶活溫度下的酶活力為100%。結(jié)果表明該酶的最適酶活溫度60°C，在0°C下仍保持了 12. 4%的相對(duì)活性，在70°C酶活力顯著下降如圖2所示。
實(shí)施例2
適冷蛋白酶MCP-Ol在肉制品嫩化中的應(yīng)用，步驟如下
(I)將步驟3制得的適冷蛋白酶MCP-Ol配制成濃度為10 μ g/ml和100 μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液；
(II)將牛胸肌肉洗浄后，浸入步驟⑴制得的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液中，4°C保藏20小時(shí)。
結(jié)果表明添加適冷蛋白酶MCP-Ol在4°C下作用20小時(shí)的牛胸肌肉剪切力顯著下降，而未添加適冷蛋白酶的對(duì)照組牛胸肌肉剪切力下降不明顯。(如圖3)。
牛胸肌肉分別與用相同濃度的菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶在4°C下處理20小時(shí)，然
后測(cè)定失水率。定義失水率為
權(quán)利要求
1、適冷蛋白酶MCP-Ol在肉制品嫩化中的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下(1)將適冷蛋白酶MCP-Ol配制成濃度為5 20μ g/ml的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液； (2)將待嫩化的肉洗浄后，浸入步驟(I)制得的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液中，O 8°C保藏18 30小時(shí)。
2、如權(quán)利要求
I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(I)的適冷蛋白酶MCP-Ol溶液濃度為 10 15 μ g/ml ο
3、如權(quán)利要求
I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中在O 4°C保藏20 25小時(shí)。
4、如權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其特征在于，上述保藏溫度為4°C。
5、如權(quán)利要求
I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中的肉為含有膠原蛋白的各種供人食用的動(dòng)物組織。
專利摘要
本發(fā)明涉及適冷蛋白酶MCP-01在肉類嫩化中的應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案完成肉類嫩化(1)將適冷蛋白酶MCP-01配制成濃度為5～20μg/ml的適冷蛋白酶MCP-01溶液；(2)將待嫩化的肉洗凈后，浸入步驟(1)制得的適冷蛋白酶MCP-01溶液中，0～8℃保藏18～30小時(shí)。該蛋白酶可在0～4℃下特異性降解肉類結(jié)締組織中的膠原蛋白，在肉類嫩化過(guò)程中具有很好的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)A23L1/314GKCN102224938 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110121380
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年5月11日
發(fā)明者何海倫, 周明揚(yáng), 周百成, 張熙穎, 張玉忠, 石梅, 解彬彬, 趙國(guó)琰, 陳秀蘭 申請(qǐng)人:山東大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),