国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      轉(zhuǎn)移基因的動(dòng)物的制作方法

      文檔序號(hào):444614閱讀:584來源:國知局
      專利名稱:轉(zhuǎn)移基因的動(dòng)物的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及畜牧業(yè),具體地說是涉及產(chǎn)生具有預(yù)期特性之新的動(dòng)物品種的方法,這些預(yù)期特性包括增加體重、飼養(yǎng)效率、牛奶產(chǎn)量或?qū)膊〉牡挚沽Φ取?br> 使用傳統(tǒng)飼養(yǎng)方法,有可能得到具有特定預(yù)期特性的動(dòng)物。但在得到這些預(yù)期特性的同時(shí),也常常產(chǎn)生許多不需要的特性。
      近年來已發(fā)展了將外源基因引入動(dòng)物基因系中的方法。一般說來,這是使用RNA/DNA技術(shù)(其包括分離和定性基因)和單細(xì)胞胚胎技術(shù)(其包括收集和再植入卵子)完成的。整個(gè)方法大致包括以下步驟-分離純的基因樣品(DNA片段);
      -收集新近受精的卵;
      -將極小部分(如10-9立方厘米)的基因溶液注入雄性細(xì)胞核(來自精子者)內(nèi),然后使之與雌性細(xì)胞核融合,以形成單細(xì)胞胚胎;以及-將已接受了上述注射的卵子植入適當(dāng)選擇的代孕母體內(nèi)。
      子代出生后,取其小部分組織(通常是尾部組織),制備DNA并分析之,以確定單一細(xì)胞階段注入的基因是否已穩(wěn)定地?fù)饺雱?dòng)物染色體內(nèi)。如果是這樣,即證明發(fā)生了基因轉(zhuǎn)移。
      上述方法已被成功地用于通過引入包含外源基因(如人生長激素基因)的構(gòu)建物,來加速小鼠生長并增加動(dòng)物大小。然而,該方法尚未在改善家畜之預(yù)期特性方面取得成功。
      本發(fā)明的一個(gè)目的是克服或至少減少現(xiàn)有方法中存在的一個(gè)或多個(gè)困難和/或缺陷。
      根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了一種創(chuàng)造動(dòng)物新品種的方法,其包括(a)得到新近受精的卵;
      (b)分離與卵細(xì)胞同源之特征化激素的基因樣品;
      (c)將基因樣品引入卵的雄性核內(nèi),然后與雌性核融合以形成單細(xì)胞胚胎;以及(d)將卵植入適當(dāng)制備的雌性動(dòng)物體內(nèi)。
      新近受精的卵可以是任何動(dòng)物的受精卵。適當(dāng)?shù)膭?dòng)物包括家畜如馬、乳牛、豬和羊??砂匆阎椒ㄖ频檬芫?。
      與卵同源的特征化激素的基因樣品必將取決于所得到的動(dòng)物卵。例如,如果動(dòng)物卵是得自豬的,則基因樣品將包含特征化的豬激素。
      被分離和注射的特征化激素的類型可以是任何預(yù)期特征性激素。被分離和注射的激素的類型可以依據(jù)預(yù)期的子代的特性而定。例如,如果子代是豬,而且預(yù)期的特性是加速生長,則基因樣品可包含豬生長激素。可依照已知方法分離基因樣品。
      依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,其提供一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體,該質(zhì)粒包含編碼一非豬啟動(dòng)子區(qū)之DNA的第一克隆序列和編碼豬生長激素(PGH)活性之DNA的第二克隆序列。
      如此形成的質(zhì)粒表達(dá)載體可在編碼區(qū)內(nèi)包含一豬生長激素的完整拷貝。
      可使用任何適宜的質(zhì)粒表達(dá)載體或克隆載體,例如質(zhì)??寺≥d體pUC19(Nonander等,Gene,26101-106,1983)。
      DNA的第一克隆序列可編碼人啟動(dòng)子區(qū)。人啟動(dòng)子區(qū)可以是人金屬硫因啟動(dòng)子(hMTIIA)。在一優(yōu)選方案中,可使用經(jīng)修飾的金屬硫因啟動(dòng)子質(zhì)粒。DNA的第一克隆序列可在質(zhì)粒克隆載體中形成-EcoRⅠ-HindⅢ插入片段。該插入片段長約810-823bp。在一優(yōu)選實(shí)施方案中,其長度為823bp。DNA的第一克隆序列也可含有人金屬硫因啟動(dòng)子的元件。
      可由信使或聚腺苷化RNA形成的cDNA庫中分離編碼豬生長激素的DNA序列。例如可由豬腦垂體組織中分離。
      DNA的第二克隆序列可在質(zhì)粒表達(dá)載體中形成-EcoRⅠ-EcoRⅠ插入片段。該插入片段長約522bp。質(zhì)粒為一小的、有高拷貝數(shù)的表達(dá)載體。質(zhì)粒表達(dá)載體可以是質(zhì)粒pUC19或pKT52。
      本發(fā)明的質(zhì)??蛇M(jìn)一步包括一個(gè)DNA的第三序列。第三克隆序列可包含豬生長激素基因的3′末端。第三克隆片段可在DNA的第二克隆片段中形成一SmaBam/Sma插入片段。該插入片段長約1000bp。
      3′末端片段也可以是被修飾了的。在一實(shí)施方案中,缺失了某些被鑒定為重復(fù)序列的區(qū)域。例如,相對(duì)于約1000bp的原始序列,在缺失了重復(fù)序列后可留下約200堿基對(duì)的3′片段。修飾豬生長激素DNA樣品的3′端以除去重復(fù)序列,是穩(wěn)定豬基因組中轉(zhuǎn)移基因之染色體排布的一個(gè)附加因素。亦可在豬基因編碼區(qū)內(nèi)括入內(nèi)含子來實(shí)現(xiàn)這一穩(wěn)定化作用。
      業(yè)已發(fā)現(xiàn),3′端片段至編碼區(qū)的包涵物可利于增加自基因轉(zhuǎn)錄之解讀序列(信使RNA或mRNA)的穩(wěn)定性。
      具上述類型的一個(gè)特定質(zhì)粒是定名為pHMPG.4的質(zhì)粒,該質(zhì)粒的樣品保存在Adelaide大學(xué)(澳大利亞)的培養(yǎng)物保藏中心內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案,其提供了質(zhì)粒pHMPG·4。圖1中顯示了pHMPG·4構(gòu)建物的基因圖。
      本發(fā)明另一個(gè)方面提供了制備上述質(zhì)粒表達(dá)載體的方法,其包括-提供一適當(dāng)?shù)馁|(zhì)??寺≥d體、含非豬啟動(dòng)子的第一DNA片段,以及編碼豬生長激素的第二DNA片段;
      -將第一DNA片段在一適當(dāng)位點(diǎn)處插入到質(zhì)??寺≥d體中;以及-將第二DNA片段在一適當(dāng)位點(diǎn)處插入到質(zhì)粒克隆載體中。
      該方法還進(jìn)一步包括-提供第三個(gè)DNA克隆片段,其包括了得自豬生長激素基因之染色體拷貝的豬生長激素基因的3′末端。
      可通過在豬生長激素DNA的限制性切點(diǎn)上切斷已經(jīng)作過限制性分析的質(zhì)粒表達(dá)載體,并將第三個(gè)DNA片段在適當(dāng)位點(diǎn)克隆到第二片段中。
      圖2中總結(jié)了這些步驟。
      應(yīng)了解到的是,制備所述質(zhì)粒的方法將包括定性豬生長激素之編碼區(qū)和相關(guān)非編碼區(qū)的預(yù)備步驟。豬生長激素的這一特征將在下文述及。圖1中顯示了PGH基因組基因的核苷酸序列。
      可使用適當(dāng)方法,將質(zhì)粒或基因如豬生長激素基因的樣品,即得自圖1所示質(zhì)粒的HindⅢ/PvuⅠ片段引入到豬卵的雄性前核中。亦可將基因樣品注射到卵的雄性前核內(nèi)。
      本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面提供了一種得到轉(zhuǎn)移基因之動(dòng)物的方法,其包括(a)提供雌性動(dòng)物的新近受精的卵子;
      (b)制備含啟動(dòng)子和將被表達(dá)基因之克隆區(qū)第一和第二克隆片段的質(zhì)粒表達(dá)載體,以及(c)將質(zhì)粒注入雄性前核內(nèi),然后使其與雌性核融合,以形成單細(xì)胞胚胎。
      將基因構(gòu)建物注入雄性前核內(nèi)時(shí)所遇到的一個(gè)主要問題是不易看到卵細(xì)胞內(nèi)的前核或核。有些動(dòng)物如兔的核結(jié)構(gòu)很容易看到,但有些動(dòng)物如羊和豬的前核和核卻很難定位。
      可使用DNA特異性熒光染色體,借助熒光顯微鏡檢法或干涉反差(IC)顯微鏡檢法看到羊卵細(xì)胞的前核和核。染色和使用紫外光有可能損傷卵細(xì)胞。因此最好使用干涉反差顯微鏡檢法進(jìn)行羊卵細(xì)胞內(nèi)的微量注射。熒光分析證明,干涉反差顯微鏡法是在大約80%羊卵細(xì)胞中進(jìn)行前核定位的一種有效方法??捎孟嗨品椒@現(xiàn)山羊卵的前核和核。
      豬卵是不透明的,即使使用干涉反差顯微鏡也看不到核結(jié)構(gòu)。但如果將天然豬卵于15000g離心3分鐘,則可能看到豬卵的前核和核。用相似方法也可以看到乳牛卵的核。但使用離心法卻無助于顯現(xiàn)綿羊卵細(xì)胞的前核。
      可于放大下并使用標(biāo)準(zhǔn)的微量注射裝置注射前核。可用平頭抓特移液管吸住卵細(xì)胞并用注射移液管穿刺透明帶、胎漿膜和前核被膜。注射移液管的直徑約為1.5μm,而平頭抓持移液管的直徑約為50μm。
      被注入的基因構(gòu)建物的量將取決于前核的大小和注射移液管的大小。例如,可以注射數(shù)百個(gè)含預(yù)期基因之2.6kb線性片段的拷貝。
      然后可用任何適當(dāng)方法將卵植入任何適當(dāng)制備的代孕母體內(nèi)。該過程可用任何已知方法來完成。
      下列非限定的實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
      實(shí)施例1PGHcDNA序列用合成的DNA探針自使用質(zhì)粒載體pUC19(Norrander等,Gene,26,101-106,1983)構(gòu)建的含大約4000個(gè)重組體的豬腦垂體cDNA庫中分離PGHcDNA克隆。所分離出的cDNA克隆中有一個(gè)(即pPG·3)經(jīng)測(cè)定完整序列,發(fā)現(xiàn)含有預(yù)計(jì)長度的插入片段。
      發(fā)現(xiàn)pPG·3cDNA插入片段的開放讀碼可編碼含216個(gè)氨基酸的激素原,而后者的氨基酸序列與Seeburg等人(DNA,2,37-45,1983)所述PGH cDNA克隆之部分長度所編碼碼的氨基酸序列完全相同。該克隆第一次提供了PGH信號(hào)序列編碼區(qū)的完整序列以及5′非翻譯區(qū)的41個(gè)堿基序列。
      編碼區(qū)內(nèi)的核苷酸序列是十分保守的,與Seeburg等人(1983)所報(bào)導(dǎo)的序列只有一個(gè)堿基差異。
      圖3PGH基因組基因的核苷酸序列圖中顯示了全部2231bp序列。其中指出了編碼PGH原(前PGH)的開放讀碼,這些堿基不同于先前研究的PGH cDNA序列pPG·3的堿基序列。用星號(hào)標(biāo)示了導(dǎo)致氨基酸取代的堿基改變。也在序列下方標(biāo)出了不同于pPG·3的3′非翻譯區(qū)中的信號(hào)堿基。根據(jù)大鼠和人GH基因帽位點(diǎn)的位置(Page等,1981;DeNoto等,1981)推斷出了其帽位點(diǎn)(+1)的定位。
      下面劃線的是推測(cè)的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化序列如TATA、AATAAA和富含GT序列,并用箭頭指出了加入PolyA尾部的位置。變異的GC供體剪接位點(diǎn)位于第一個(gè)內(nèi)含子中,大約在堿基+72處。
      圖中指出了進(jìn)行下面幾節(jié)中所述再克隆的SmaⅠ限制性位點(diǎn)。
      用PGHcDNA雜交探針進(jìn)行Southern分析當(dāng)用pPG·3的cDNA插入片段探查已用三個(gè)不用的限制性酶切割過的豬基因組DNA的Southern印跡時(shí),每一泳道中均檢測(cè)到一個(gè)強(qiáng)雜交的帶。限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ也產(chǎn)生了第二個(gè)較弱的帶,此表明如果基因在事實(shí)上是作為單一拷貝存在的,則基因組基因必然含有這些酶的內(nèi)在切點(diǎn),并接近同源于cDNA之區(qū)域的末端(后來發(fā)現(xiàn)這一推測(cè)是正確的)。使用第三個(gè)酶即HindⅢ則只產(chǎn)生了一條清晰的帶。綜合這些資料,即可證明豬基因組(每個(gè)半倍體染色體互補(bǔ)體)中只存在一個(gè)GH基因的拷貝相對(duì)于以前測(cè)定了序列的PGHcDNA克隆即pPG·3,該基因編碼區(qū)內(nèi)包含4個(gè)堿基改變,這種情況與牛和大鼠基因組相似,而與人則完全不同。
      分離和分析基因組PGH基因使用PGH cDNA克隆pPG·3篩選豬裝配型質(zhì)粒庫并分離含有PGH基因序列(2.4)的克隆。對(duì)裝配型克隆的Southern分析鑒定出了主要的Bam HⅠ和Eco RⅠ雜交帶,其大小與利用同一雜交探查所作基因組Southern分析中測(cè)得者相同。對(duì)包含于裝配型質(zhì)粒內(nèi)的基因作核苷酸序列分析顯示其包含整個(gè)編碼區(qū)(648bp)、178bp啟動(dòng)子區(qū)、61bp5′非翻譯序列、分別為242、210、197和278bp的四個(gè)內(nèi)含子以及414bp3-1非編碼序列(圖3)。相對(duì)于以前測(cè)定了序列的PGHcDNA克隆即pPG·3,該基因編碼區(qū)內(nèi)包含4個(gè)堿基改變,如圖3中所示的堿基取代導(dǎo)致了信號(hào)肽內(nèi)兩個(gè)氨基酸殘基的改變。其余兩處差異則沒有取代。與pPG·3cDNA序列相關(guān)的3′非翻譯區(qū)內(nèi)也有一個(gè)堿基改變(圖3)。
      圖4中所示的序列比較表明,被研究之各序列的啟動(dòng)子具有高度同源性。圖3表明,GH和HPL基因的5′非翻譯區(qū)也是極為保守的。
      對(duì)PGH基因3′序列的分析,可以鑒定出那些已顯示在聚腺苷酸化過程中是很重要的序列。
      將PGH基因的3′序列與所有可得到的GH和HPL序列相比較,已顯示GH和HPL基因之間也保守到一個(gè)令人驚異的程度。
      圖4GH和HPL基因啟動(dòng)子及5′非翻譯序列的比較將豬(P)、牛(B)、人(H)和大鼠(R)GH基因以及人胎盤催乳激素(HPL)基因成直線平行排列,以測(cè)定序列同源性程度(2、5、3)。相鄰序列間的同源堿基以星號(hào)標(biāo)示。PGH序列的編號(hào)是由帽位點(diǎn)(+1)計(jì)起的。
      這一例子說明包含于pPG·3中的豬GHcDNA插入片段已克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中。
      PGH在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)為在大腸桿菌中生產(chǎn)PGH,所選用的表達(dá)載體為pKT52。這一由J.Shine(California Biotechnology)提供的質(zhì)粒是一小的、有高拷貝數(shù)的表達(dá)載體,其含有能力很強(qiáng)的并且可以調(diào)節(jié)的trc啟動(dòng)子(Brosius等,1985)和作用很強(qiáng)的大腸桿菌5S轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(Brosius等,1981)。trc啟動(dòng)子是一含有大腸桿菌trp啟動(dòng)子之相符-35區(qū)直到大腸桿菌lac UV5啟動(dòng)子之相符-10區(qū)的融合啟動(dòng)子(de Boer等,1983a)。該啟動(dòng)子的lac UV5序列含有-lac操縱子位點(diǎn),從而致使由該啟動(dòng)子發(fā)起的轉(zhuǎn)錄過程在lacⅠq菌株中受到抑制。如在IPTG存在下培養(yǎng)細(xì)胞,則可刺激在lacⅠq菌株中由該啟動(dòng)子發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄過程(de Boer等,1983a)。圖5中顯示了pKT52之RBS/克隆區(qū)的限制性酶切圖及序列。
      圖5PGHcDNA克隆到表達(dá)載體PKT52中本圖說明了大腸桿菌表達(dá)載體pKT52的組織。自含有pPG,3之EcoRⅠ插入片段的M13RF中分離一800bp PstⅠ片段。該片段含有整個(gè)PGH原編碼區(qū),減去前兩個(gè)氨基酸,加上33bpmP19多聚連接子DNA。如將該片段插入PKT52的PstⅠ位點(diǎn),即可再生整個(gè)PGH原序列(3.2.1)。然后分離PKT52的EcoRⅠ插入片段并克隆到M13mp19中,以促成pKT52/PGHcDNA接合點(diǎn)的誘變(3.2.2)。圖中指出了trc啟動(dòng)子和rRNA轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的位置(rrnT1和rrnT2)。
      使用兩個(gè)大腸桿菌菌株即菌株MC1061和JM101來分析該實(shí)施例中所述有效表達(dá)的水平。由trc啟動(dòng)子開始的表達(dá)可在MC1061細(xì)胞中正常進(jìn)行,但在lacⅠq菌株(JM101)中則受到抑制。如在含有1mM IPTG的條件下培養(yǎng)細(xì)胞,卻可解除在JM101細(xì)胞中出現(xiàn)的對(duì)由trc啟動(dòng)子開始之轉(zhuǎn)錄過程的抑制。
      質(zhì)粒pGHX.1使用寡核苷酸定點(diǎn)突變法,刪除編碼激素原之氨基酸2-26的DNA,以構(gòu)建表達(dá)蛋氨?;?PGH(m-PGH)的構(gòu)建物。該缺失部分是連接到直接與ATG起始密碼子之成熟PGH分子的第一個(gè)氨基酸的TTc密碼子上的。
      分離含有與trc啟動(dòng)子序列融合之完整PGHcDNA的pKTGH的EcoRⅠ插入片段并克隆到M13mp19中。自該噬菌體中分離單股DNA,然后用于誘變反應(yīng)。為了去除編碼激素原之氨基酸2-26的75個(gè)堿基,而將一與所需刪除之每側(cè)15個(gè)堿基的30堿基長的寡核苷酸GH·30用于誘變反應(yīng)。退火并伸展之后,將誘變反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到JM101中。然后篩選噬斑,通過對(duì)從轉(zhuǎn)化平板摘取的兩份樣品的噬斑雜交來檢測(cè)是否產(chǎn)生了所需缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被篩選的150個(gè)噬斑中,有35%在雙份平行實(shí)驗(yàn)中與GH·30寡核苷酸探針雜交。自許多陽性噬斑中分離單股DNA并使用PGH特異性寡核苷酸GH·25作引物,測(cè)定其序列以進(jìn)一步確定此缺失的準(zhǔn)確性。所有陽性噬斑均含有已產(chǎn)生正確缺失的DNA。由該已缺失的噬斑(mpGHX·1)中分離復(fù)制型(RF)DNA,純化EcoRⅠ插入片段并再克隆到pKTGH的較大EcoRⅠ片段中,以產(chǎn)生質(zhì)粒pGHX·1。圖6中顯示了該質(zhì)粒和已述及的其他表達(dá)質(zhì)粒之5′末端的核苷酸序列。
      圖6PGH表達(dá)質(zhì)粒之5′區(qū)的核苷酸序列圖解顯示了mRNA前導(dǎo)物之最后24個(gè)堿基以及第3節(jié)中所述各表達(dá)質(zhì)粒編碼區(qū)之5′端的核苷酸序列。使每個(gè)序列都與PGH特異性寡核苷酸GH·25進(jìn)行引導(dǎo)的序列分析反應(yīng),以測(cè)定其各自的核苷酸序列(圖5;6、2、5)。除pKTGH(PGH原)和pGHXF(PGH融合蛋白)的表達(dá)載體外,每個(gè)質(zhì)粒均編碼蛋氨酰基PGH(m-PGH)。m-PGH表達(dá)質(zhì)粒的堿基中不同于pGHX·1序列者已在下面加橫線標(biāo)出。
      pGHXS(間隔區(qū))質(zhì)粒用具有一個(gè)重復(fù)的38堿基寡核苷酸(GH·38)將RBS中的AGGAAA改變?yōu)锳GGAGG,并將間隔DNA由CAGACC改變?yōu)門AATAT或TAAAAT。對(duì)含有pGHX·1之小EcoRⅠ片段的單鏈DNA作誘變處理,然后選擇陽性噬斑并測(cè)定序列。共有30%的噬斑與GH·38探針雜交,但其中只有20%含有GGTAATAT或GGTAAAAT RBS/間隔序列。其余陽性噬斑含有重復(fù)插入,這種現(xiàn)象可能是由于誘變反應(yīng)期間GH·38寡核苷酸的不正確雜交所引起的。由含有兩個(gè)所需改變之正確變體的噬斑中分離RF DNA,然后克隆回pKTGH中,圖4中圖解顯示了所得質(zhì)粒pGHXS·4和pGHXS·9之RBS/間隔區(qū)的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)由含有這個(gè)質(zhì)粒的MC1061和經(jīng)誘導(dǎo)的JM101細(xì)胞中制備的提取物均含有另一個(gè)主帶,其分子量為22K并具有m-PGH的預(yù)期大小。對(duì)SDS/PAGE凝膠所作激光光密度測(cè)定表明,兩種質(zhì)粒產(chǎn)生了相同水平的m-PGH,其在兩宿主內(nèi)的量為細(xì)胞總蛋白的15~20%。
      圖7圖解顯示了在未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的JM101細(xì)胞內(nèi)由pGHXS·4產(chǎn)生的m-PGH的水平。圖中還顯示了由大腸桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與垂體中制得的PGH在分子量上的相似性。m-PGH移動(dòng)距離顯示其分子量稍高于預(yù)計(jì)的分子量(約200道爾頓),這可能是由于加到凝膠上的蛋白質(zhì)提取物極其不純。以前對(duì)含有人GH的粗制細(xì)胞提取物所作分析中也觀察到了這一現(xiàn)象(Hsiung等,1986)。
      圖7由質(zhì)粒pGHXS·4產(chǎn)生m-PGH將得自含表達(dá)質(zhì)粒pGHXS·4之未誘導(dǎo)(-IPTG)和誘導(dǎo)的(+IPTG)JM101細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物,連同分子量標(biāo)記物及自腦垂體制取并純化的PGH(由R.Seamark提供)一起作SDS/PAGE分析。結(jié)果表明只在IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)3·2·2,ⅲ產(chǎn)生了有預(yù)計(jì)分子量(22,000道爾頓)之PGH的優(yōu)勢(shì)帶。
      人MT-IIA啟動(dòng)子/PGH融合基因的構(gòu)建為進(jìn)行這些研究,選用了由R.Richards提供的人金屬硫因Ⅱ-A啟動(dòng)子(Karin和Richards,1982)。
      將hMT-ⅡA啟動(dòng)子作為一個(gè)823bp片段(其中啟動(dòng)子序列由-763延伸到+60位)克隆到M13載體mp8(A·Robbins個(gè)人交流)中。用HindⅢ和EcoRⅠ雙重酶切含有該啟動(dòng)子的RF噬菌體,以釋放出與5bp載體多聚連接子序列融合的啟動(dòng)子序列。純化該823bp片段并再克隆到HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pUC19中,以產(chǎn)生質(zhì)粒pUCMT。
      自PGHcDNA克隆pPG·3中分離作為814bp EcoRⅠ片段之編碼PGH的序列。經(jīng)用EcoRⅠ限制性切斷pUCMT,然后連接到純化的pPG·3插入片段上,從而將上述序列克隆到hMT-ⅡA啟動(dòng)子的下游。對(duì)由所得轉(zhuǎn)化體制備的質(zhì)粒DNA作限制性分析(6.3.4.ⅱ),鑒定出一個(gè)含有的正確定向插入之PGHcDNA的質(zhì)粒,并定名為pUCMTGH·4(圖6)。通過將跨越這個(gè)區(qū)域的限制性片段定向克隆到M13mp18中,測(cè)定這兩個(gè)片段之間接合點(diǎn)的核苷酸序列。由該克隆得到的序列資料表明已產(chǎn)生了預(yù)期的序列,并已包含了通過9bp多聚連接子/合成連接子DNA連接到PGH5′非翻譯區(qū)(從+21位起)上的hMT-ⅡA啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(向下達(dá)到+60位)(圖8)。
      決定將得自質(zhì)粒pGHB·3(cPGH·1的2Kb BamHⅠ亞克隆)的1Kb SmaⅠ/BamHⅠ片段(其含有SmaⅠ位點(diǎn)之下游的第五外顯子加上pgh基因的長約800bp的3′非翻譯序列)再克隆到pUCMTGH·4的唯一的SmaⅠ位點(diǎn)中。
      純化pGHB·3的1Kb SmaⅠ/BamHⅠ片段(6、3、2。ⅱ)并用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修復(fù)BamHⅠ酶切產(chǎn)生的單股突出部分。然后將該平頭片段再克隆到SmaⅠ酶切的pUCMTGH·4中。檢查自大量所得轉(zhuǎn)化體中分離的質(zhì)粒DNA,發(fā)現(xiàn)其大多數(shù)大小都相當(dāng)于pUCMTGH·4。使用得自pGHB·3之遠(yuǎn)3′端的500bpBamHⅠ/PstⅠ限制片段作為雜交探針,經(jīng)濾膜雜交來篩選其中存在cPGH·1序列的轉(zhuǎn)化體。對(duì)由所得陽性菌落制得的質(zhì)粒DNA作限制性分析,表明有一個(gè)質(zhì)粒含有以正確定向插入的片段。將該質(zhì)粒定名為pHMPH·4(HM人金屬硫因;PG豬生長激素)。圖1中圖解顯示了該質(zhì)粒的組織情況。
      圖2真核生物表達(dá)質(zhì)粒pHMPG·4的構(gòu)建圖中給出了構(gòu)建pHMPG·4的流程。將含有hMT-ⅡA啟動(dòng)子的約800bpHindⅢ/EcoRⅠ片段克隆到經(jīng)HindⅢ/EcoRⅠ酶切的、脫磷酸的pUC19中以產(chǎn)生質(zhì)粒pUCMT。然后用EcoRⅠ限制性切斷該質(zhì)粒、脫去磷酸、并連接到PGHcDNA克隆(pPG·3)的EcoRⅠ插入片段上,以產(chǎn)生質(zhì)粒pUCMTGH·4。用SmaⅠ限制性切斷該質(zhì)粒,脫去磷酸并連接到裝配型質(zhì)粒亞克隆pGHB·3的平頭1kbSmaⅠ/BamHⅠ插入片段(其含有PGH基因組基因之最后外顯子的大部分及長約700bp的PGH3′非編碼序列)上,以產(chǎn)生pHMG4。所有這些構(gòu)建物均經(jīng)序列分析進(jìn)行了檢定。
      圖8pUCMTGH·4中hMT-ⅡA/PGH接合點(diǎn)的核苷酸序列自pUCMTGH·4中分離跨越hMT-ⅡA和PGHcDNA序列之間接合區(qū)的SmaⅠ/PstⅠ片段,并克隆到SmaⅠ/PstⅠ酶切的mp18中進(jìn)行序列分析。由該克隆所得序列資料表明已產(chǎn)生了正確的融合,其中hMT-ⅡA啟動(dòng)子、帽位點(diǎn)(有兩個(gè)帽位點(diǎn),均標(biāo)示為+1)和5′非翻譯序列(向下延伸至+60位)已通過9bp之合成連接子序列連接到了由堿基+21向下游延伸的PGHcDNA序列上(4.2)。
      圖1表達(dá)載體pHMPG·4圖解顯示了表達(dá)載體pHMPG·4的限制性酶切圖及組織。使hMT-ⅡA啟動(dòng)子序列與含有自+21位向下延伸至唯一SmaⅠ位點(diǎn)之PGH cDNA序列的雜合基因相融合(后者連接到該接合點(diǎn)下游的PGH基因組基因序列上)。用低融點(diǎn)凝膠作電泳純化含有整個(gè)啟動(dòng)子和PGH序列的2.7kb HindⅢ/PvuI片段加上連接到3′端的120bpPUC19Lac Z基因,并用于誘變產(chǎn)生轉(zhuǎn)移基因的動(dòng)物。
      產(chǎn)生轉(zhuǎn)移基因的豬用pHMPG·4的HindⅢ/PvuⅠ片段來產(chǎn)生轉(zhuǎn)移基因的豬。從超數(shù)排卵的大白母豬體內(nèi)收集體內(nèi)受精的單細(xì)胞豬胚胎。制備這些胚胎并注入大約600個(gè)pHMPG·4插入片段的拷貝。以外科手術(shù)方法將經(jīng)過注射的30個(gè)胚胎植入多個(gè)同時(shí)接受這一實(shí)驗(yàn)之母豬的輸卵管內(nèi)。其中四只母豬生下了成窩仔豬(每窩4-5只),總共生出17只小豬。
      對(duì)轉(zhuǎn)移基因的豬的分析ⅰ)點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)通過對(duì)分離自尾部組織的DNA的點(diǎn)印跡雜交來檢驗(yàn)小豬體內(nèi)是否存在外來基因。這些點(diǎn)印跡包括分別作為陰性和陽性對(duì)照的正常豬DNA和人基因組DNA。這些點(diǎn)印跡與hMT-ⅡA啟動(dòng)子的HindⅢ/AvaⅠ片段雜交后,顯現(xiàn)了許多陽性信號(hào)。其中四只豬顯示相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞有一個(gè)以上拷貝的強(qiáng)雜交,另外有兩只豬顯示微弱的雜交(稍高于本底),并相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞有不足一個(gè)拷貝(圖9)ⅱ)條形印跡(Slot-blots)實(shí)驗(yàn)通過長條形印跡分析法檢測(cè)存在于每只經(jīng)轉(zhuǎn)移基因的豬體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞中pHMPG·4插入片段的拷貝數(shù)。將得自每只轉(zhuǎn)移基因動(dòng)物之尾組織DNA的5μg樣品,連同人和豬的陽性和陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)移到長條印跡上。亦包括相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞1至40個(gè)拷貝之基因組拷貝數(shù)的pHMPG·4質(zhì)粒DNA的劑量范圍(其還含有5μg對(duì)照豬基因組DNA)。該長條形印跡與hMT-ⅡA啟動(dòng)子的制品翻譯的HindⅢ/AvaⅠ片段雜交,然后在高嚴(yán)緊條件下洗滌之。以激光光密度法將轉(zhuǎn)移基因之動(dòng)物DNA的雜交強(qiáng)度與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其范圍為從375號(hào)和739號(hào)動(dòng)物的每個(gè)細(xì)胞約0.5個(gè)拷貝到295號(hào)動(dòng)物的每個(gè)細(xì)胞15個(gè)拷貝(表1;圖9)。
      ⅲ)Southern分析用Southern印跡法研究轉(zhuǎn)移基因的豬DNA內(nèi)外來序列的組織。pHMPG·4插入片段內(nèi)沒有BamHⅠ位點(diǎn)。因此用該酶切割轉(zhuǎn)移基因動(dòng)物的基因組DNA應(yīng)在基因組Southern印跡上產(chǎn)生不同的帶,這些帶的長度則是由最近的BamHⅠ位點(diǎn)至整合位點(diǎn)的距離、整合位點(diǎn)的數(shù)目以及已整合之pHMPG·4插入片段的拷貝數(shù)決定的。
      圖9用點(diǎn)印跡法分析可能已轉(zhuǎn)移了基因的豬自注入了pHMPG·4之插入片段的卵發(fā)育成的豬的尾組織中分離10、5和1μgDNA樣品,使之變性并加到一薄膜上。每排點(diǎn)印跡中均包括pHMPG·4和人(HUM)基因組DNA陽性對(duì)照及豬(PIG)基因組DNA陰性對(duì)照。質(zhì)粒陽性對(duì)照是第1排的印跡A。這一排中括號(hào)內(nèi)的數(shù)目是指與各質(zhì)粒點(diǎn)印跡相當(dāng)?shù)拿總€(gè)細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)。A4至A11及B1至B9等排中的樣品均含有試驗(yàn)樣品。將該缺口翻譯的hMT-ⅡA啟動(dòng)子HindⅢ/AvaⅠ插入片段用作雜交探針。下面圖9的說明顯示了各點(diǎn)印跡上樣品的一致性。
      A.
      1234567891011A.10μg(2)HUM PIG 177 178 179 180 295 296 297 298B.5μg(1) HUMPIG177178179180295296 297 298
      C.1μg(0.5) HUMPIG177178179180295296 297 298B.
      1234567891011A.10μg373374375376735736737738739 PIG HUMB.5μg(1) 374375376735736737738739 PIG HUMC.1μg (0.5)374375376735736737738739 PIG HUM圖10對(duì)轉(zhuǎn)移基因豬的條形印跡分析將轉(zhuǎn)移基因的豬DNA以及豬和人的陰性和陽性對(duì)照樣品作變性處理后,與含各種不同量pHMPG·4質(zhì)粒DNA(這些質(zhì)粒DNA均結(jié)合了5μg豬對(duì)照DNA)的許多樣品一同加到濾膜上。所加pHMPG·4DNA的量相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞有1至40個(gè)基因拷貝的基因拷貝數(shù)(如下表括號(hào)內(nèi)所示)。所用的探針是缺口翻譯的hMT-ⅡA啟動(dòng)子HindⅢ/AvaⅠ插入片段。下面給出了對(duì)印跡上樣品的


      。使用激光光密度計(jì)對(duì)該膜上各個(gè)樣品的雜雜強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。下表中給出了這一分析的結(jié)果。
      ABC117718029523757367393PIGHUM45500(40)125(10)50(4)6375(30)100(8)25(2)7250(20)75(6)12.5(1)
      表1轉(zhuǎn)移基因豬基因拷貝數(shù)、生長情況及血清PGH濃度圖中顯示了用條形印跡分析法來估計(jì)存在于各轉(zhuǎn)移基因豬細(xì)胞內(nèi)外來基因的拷貝數(shù)(每個(gè)細(xì)胞的),同時(shí)給出每天測(cè)得的豬體重(測(cè)50至120天)及轉(zhuǎn)移基因豬與同窩內(nèi)未轉(zhuǎn)移基因豬的血清PGH濃度。雌性對(duì)照組是三只豬的均值,雄性對(duì)照組是兩只豬的均值。
      豬序號(hào)性別拷貝數(shù)/細(xì)胞每天體重增加血清PGH濃度(gm)(ng/ml)177F376510.4295F1595327.8739F0.56866.9對(duì)照組F-80610.6180M685115.3375M0.54876.3736M685711.1對(duì)照組M-67015.3圖11轉(zhuǎn)移基因豬的生長速率將各轉(zhuǎn)移基因豬的生長情況對(duì)同窩未轉(zhuǎn)移基因豬的生長速率作圖。點(diǎn)線代表同窩未轉(zhuǎn)移基因的性匹配豬的平均生長速率,破拆線代表異性未轉(zhuǎn)移基因同窩對(duì)照豬的平均生長速率。實(shí)線則代表轉(zhuǎn)移基因之動(dòng)物的平均生長速率。
      實(shí)施例2去掉Spl結(jié)合位點(diǎn)的hMT-ⅡA/PGH質(zhì)粒pHMGPG·3
      據(jù)報(bào)導(dǎo),位于鄰近基本序列處的相符Spl結(jié)合位點(diǎn)序列GGGCGG(Kadonaga等,TrendsBiochem.Sci,11,20-23,1986)可產(chǎn)生具有所需參數(shù)的啟動(dòng)子。M.Karin提供了一個(gè)改變了的hMT-ⅡA啟動(dòng)子的核苷酸序列,該序列的Spl結(jié)合位點(diǎn)已被PstⅠ連接子所取代,并具有所需的轉(zhuǎn)錄特性。這種改變是在hMT-ⅡA/mp8克隆中經(jīng)過寡核苷酸定點(diǎn)誘變而產(chǎn)生的。
      選用一46堿基長的寡核苷酸MT.46來取代圍繞并包括Spl結(jié)合位點(diǎn)的15bp區(qū)連同-17堿基長的PstⅠ連接子序列。用MT·46誘變hMT-ⅡA/mp8單股DNA并轉(zhuǎn)化到含有正確序列取代的JM101噬斑中,然后經(jīng)噬斑雜交法和核苷酸序列測(cè)定法選擇這些噬斑。自包含正確突變的一個(gè)噬斑中分離RF DNA,純化HindⅢ/EcoRⅠ插入片段并用以與pHMPG·4的EcoRⅠ插入物及HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pUC19DNA進(jìn)行三片段連接。由此連接所得到的一個(gè)質(zhì)粒具有正確的限制性酶切圖,將其定名為pHMGPG·3(無GC序列)。
      現(xiàn)已將該質(zhì)粒的插入片段引入轉(zhuǎn)移基因的小鼠體內(nèi)。
      可以設(shè)想,本發(fā)明的方法亦可用于生產(chǎn)包含與見于小鼠、羊或人金屬硫因啟動(dòng)子中的序列相對(duì)應(yīng)的不同反應(yīng)性元件之結(jié)合形式的合成啟動(dòng)子構(gòu)建物,而其中可以有或沒有其他啟動(dòng)子元件。例如其可用于調(diào)節(jié)Fe++水平。
      最后,應(yīng)明確的是,在不違背本說明書所述的本發(fā)明之發(fā)明構(gòu)思的前提下,尚可對(duì)有關(guān)內(nèi)容作各種其他修飾和/或改變。
      權(quán)利要求
      1.一種制造動(dòng)物新品種的方法,其包括(a)獲得新近的受精卵;(b)分離與卵同源的特征化激素的基因樣品;(c)將基因樣品引入卵的雄性核內(nèi),然后使之與雌性核融合以形成單細(xì)胞胚胎;以及(d)再將卵植入適當(dāng)制備的雌性動(dòng)物體內(nèi)。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中動(dòng)物是選自馬、乳牛、豬和羊。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中動(dòng)物是豬,且特征化的激素是豬生長激素。
      4.一種包含質(zhì)??寺≥d體的質(zhì)粒表達(dá)載體,其包括編碼非豬啟動(dòng)子區(qū)之DNA的第一克隆序列以及編碼豬生長激素活性的第二克隆序列。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中質(zhì)??寺≥d體選自于pUC19或pKT52。
      6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中DNA的第一克隆序列編碼人金屬硫因啟動(dòng)子(hMTⅡA)。
      7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任何一項(xiàng)的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中DNA的第一克隆序列在質(zhì)粒克隆載體中形成-EcoRⅠ-HindⅢ插入部分,且其長度約為810-823bp。
      8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任何一項(xiàng)的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中第二克隆序列在質(zhì)??寺≥d體中形成-EcoRⅠ-EcoRⅠ插入部分,且其長度約為522bp。
      9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任何一項(xiàng)的質(zhì)粒表達(dá)載體,其包括了插入到第二克隆序列中的DNA的第三克隆序列。
      10.根據(jù)權(quán)利要求9的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中第三克隆序列包括豬生長激素基因的3′末端。
      11.根據(jù)權(quán)利要求9的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中第三克隆序列在長約1000bp的第二克隆序列中形成-SmaBam/Sma插入部分。
      12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的質(zhì)粒表達(dá)載體,其中3′末端是經(jīng)過缺失鑒定為重復(fù)序列的區(qū)域而被修飾了的。
      13.根據(jù)權(quán)利要求4的質(zhì)粒表達(dá)載體包括pHMPG·4。
      14.一種制備如權(quán)利要求4至13中任何一項(xiàng)所限定之質(zhì)粒表達(dá)載體的方法,其包括-提供適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒克隆載體、含非豬啟動(dòng)子之DNA的第一片段、以及編碼豬生長激素之DNA的第二片段。-將DNA的第一片段在一適當(dāng)位點(diǎn)處插入質(zhì)??寺≥d體中;以及-將DNA的第二片段在一適當(dāng)位點(diǎn)處插入質(zhì)粒克隆載體中。
      15.一種制備轉(zhuǎn)移基因之動(dòng)物的方法,其包括
      (a)自一雌性動(dòng)物體內(nèi)分離新近受精的卵;(b)制備如權(quán)利要求4至13中任何一項(xiàng)所限定的質(zhì)粒表達(dá)載體,以及(c)將質(zhì)粒注入雄性前核內(nèi),然后使之與雌性核融合以形成一單細(xì)胞胚胎。
      全文摘要
      一種創(chuàng)造動(dòng)物新品種的方法,其包括(a)得到新近受精的卵;
      文檔編號(hào)C12N15/70GK1030255SQ8810287
      公開日1989年1月11日 申請(qǐng)日期1988年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1987年4月14日
      發(fā)明者羅伯特·西馬克, 朱利安·R·E·威爾斯 申請(qǐng)人:路明尼斯有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1