專利名稱：一種檢測乙型肝炎病毒p基因ymdd變異的置換擴(kuò)增法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus HBV)基因及其變異的分子檢測方法。尤 其是HBV基因組包括DNA和RNA以及YMDD基因變異的多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction) PCR擴(kuò)增檢測法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)導(dǎo)，全球約20億人曾 感染過HBV，其中超過了 3.5億人為慢性乙肝病毒HBV感染者，我國是乙肝感染高流行區(qū)。 乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科，也是慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭及原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主 要原因。乙肝感染的診斷目前主要依據(jù)血清學(xué)酶免方法檢測，隨著PCR技術(shù)出現(xiàn)而發(fā)展了 許多HBV基因擴(kuò)增PCR檢測法，然而PCR太過靈敏容易帶來假陽性問題。乙肝感染的控 制主要采用乙型肝炎疫苗接種預(yù)防，乙肝的治療采用a -干擾素和核苷酸類抗病毒藥拉米夫 定(Lamivudine)。然而拉米夫定治療中受藥物選擇而容易產(chǎn)生耐藥變異株。據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)， 血清e(cuò)抗原陽性病人經(jīng)一年拉米夫定治療，會(huì)有14-32%耐藥，長期治療，第二、三、四年 的耐藥率增加至38%、 49%和66% (KarayianmisR， Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003，51:p761-785)。耐藥株基因變異主要在HBV多聚酶活性區(qū)PoL/RT片段(349-692 aa， 即rtl-rt344),常見的是酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸YMDD變異，即由YMDD 變異為YIDD (rtM204I/aaM5521)或YVDD (rtM204V/aaM552V) , YVDD常伴有rtL180 M 變異(Lai CL.，et. al.， Clin.Infect.Dis,2003，36: p687-696)。而且血清HBV RNA的YMDD變異 更早于HBV DNA變異檢測(Hatakeyama., et. al., Hepatology; 2007,45-5: pll79-86)。因此， 檢測HBV YMDD基因變異尤其RNA的YMDD變異對調(diào)整治療用藥、及時(shí)用阿德福韋 (adefovir)代替拉米夫定的耐藥無效治療具有重要的指導(dǎo)意義。目前對HBV YMDD變異株的檢測方法多采用PCR或RT-PCR擴(kuò)增HBV多聚酶P基因 產(chǎn)物測序法(Chayamak,et.al.,Hepatology 1998,27: pl711-1716); PCR-RFLP限制性片段長度 多態(tài)性分析法(Allen ML, etal., Journal of Clinical Microbiology 1999,37-10:p3338-3347和中 國專利200710036511.9);各種熒光PCR分析法(Whallyey SA, et al.， J Clinical Microbiol, 2001， 39:pl456-1459 ; Wang PZ, et al,， World Clin J Digestol 2004，12-3:p600-603和中國專利 200510065445.9);以及線性探針反向雜交法INNO-LipA(Osinwg C.,et al., Journal of Clinical Microliology 2003,41-72:p5473-5477)。這些基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)的應(yīng)用方法不僅存在著繁瑣、費(fèi)時(shí)，不便于臨床快速監(jiān)測，最重要的是PCR技術(shù)太過于靈敏，極易產(chǎn)生假陽性擴(kuò)增?；蛐酒夹g(shù)是近十年來發(fā)展起來的高效大規(guī)模并行分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)許多 領(lǐng)域。并且在HBV拉米夫定抗藥性檢測中得到應(yīng)用(Jang H.,et.al.， Journal of Clinical Microbiology,2004,42-9: p4181-4188;中國專禾ij:03111452.0和02221161.6等)。然而這種固相 生物芯片加工繁瑣昂貴，分子在固相表面較液相中反應(yīng)不均一，不充分，芯片之間的加工 差異而導(dǎo)致重復(fù)性不好。需要專用復(fù)雜儀器，不便于推廣等。我國HBV慢性感染者眾多， 在拉米夫定治療中亟待發(fā)展更有效，簡便，快捷的耐藥YMDD變異檢測方法,以建立完善的 耐藥監(jiān)測體系以指導(dǎo)臨床合理用藥。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述領(lǐng)域中的缺陷，提供一種檢測乙型肝炎病毒P基因YMDD變異的置換擴(kuò)增法， 通過置換法降低擴(kuò)增靈敏度來規(guī)避PCR產(chǎn)物再污染導(dǎo)致的假陽性問題，同時(shí)給合熒光顯色， 可檢測各變異株的含量。一種檢測乙型肝炎病毒P基因YMDD motif(模體)及變異的置換擴(kuò)增法，其特征在于 將待測P基因RT區(qū)(…sYMDDv…)DNA/RNA作為保留雜交序列與包括一套以上的指示 DNA首尾互補(bǔ)序列雜交，連接酶反應(yīng)，指示加首尾DNA的首尾共價(jià)連接，形成置換指示 DNA環(huán)，再反向PCR擴(kuò)增；所述待測P基因RT區(qū)包括YMDD、及變異YIDD和YVDD 基因的DNA和RNA樣本，所述指示DNA的序列是與HBV基因包括P基因RT區(qū)序列 無關(guān)的基因序列，無關(guān)定義為6-8 base堿基以上連續(xù)相同為相關(guān)，反之無關(guān)。所述保留雜 交序列為待測基因中P基因RT區(qū)含變異(或突變)序列，長度為20-100bp;從變異基因開 始斷開，形成左、右半部分序列，鏈長10-50base;所述保留雜交序列優(yōu)選為P基因RT區(qū) 一段長30-60base序列片段。所述首尾互補(bǔ)雜交序列是指保留雜交序列的右半部分序列加在 指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA， 所述指示DNA序列長度為80-1000 bp;所述指示DNA序列優(yōu)選長度為150-500 bp。所述連 接酶反應(yīng)的連接酶指DNAligase包括T4 Ugase，Taq ligase;所述連接反應(yīng)包括0'C-2(TC連接 反應(yīng)和熱循環(huán)連接反應(yīng)。所述反向PCR擴(kuò)增是采用指示DNA正中間序列的右半部分作為 反向引物RevF，左半部分以互補(bǔ)反義序列作為反向引物RevR,反向擴(kuò)增置換指示DNA 環(huán)。所述置換擴(kuò)增體系中還包括有熒光分子信標(biāo)或熒光染料。所述熒光分子信標(biāo)為 Molecular Beacon, Taqmen或LightCycler，熒光分子信標(biāo)序列與待測模板保留序列雜交或與 指示模板序列雜交。所述熒光染料為DNA熒光染料包括SYBR Green。檢測乙型肝炎病毒P基因YMDD變異的試劑盒，包括DNA/RNA純化試劑，Taq連接 酶及緩沖液、抑制Olligo、 dNTP、 Taq Polymerase及緩沖液，DNA熒光染料或分子信標(biāo)，凝膠電泳試劑，其特征在于還包括指示加首尾DNA和反向引物Rev F和Rev R。 本發(fā)明置換指示PCR (見圖1)工作原理及流程如下基本原理是將待測PCR就是工作PCR的常規(guī)概念轉(zhuǎn)變成為用指示PCR系統(tǒng)置換待測 PCR來工作。具體置換方法就是選取待測基因一段作為特異保留雜交序列，將這段序列分 成左右兩半分別加在指示DNA首尾兩端，加了首尾的指示DNA就能與待測目的基因雜交， 從而指示DNA首尾靠近，缺口連接,使指示DNA成環(huán)。再反向PCR擴(kuò)增首尾連接了的指 示DNA。這種置換效率較直接擴(kuò)增基因效率低，降低了直接PCR的太過的靈敏度。減少指 示DNA的量或比例，可以極大地降低非特異性擴(kuò)增。雜交鏈缺口兩側(cè)堿基配對要完全正確 才能連接，因此，可以分析待測基因的單堿基變異。1. 準(zhǔn)備指示DNA:以待測乙型肝炎病毒HBV多聚酶催化區(qū)POL/RT片段蛋白序列---sYMDDv—，其核酸 序列5'-c tgt t/c tg get ttc agt tat atg gat gat gtg gt w(aA) ttg g-3，作為待測HBV非耐藥株基因 的保留雜交序列。變異YIDD核酸序列5，- c tgt t/c tg get ttc agt tat att gat gat gtg gtw(a/t) ttg g-3，和變異YVDD核酸序列5，-c tgt t/c tg get ttc agt tat gtg gat gat gtg gtw(a/t) ttg g-3，作為拉米 夫定耐藥株基因的保留雜交序列。選取一段與HBV無關(guān)的日本血吸蟲谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST基因(13-341nt/aa5-114)約 300 bp的序列作為YMDD的指示DNA 1 ，同樣的序列首尾各除去約50 bp的GST 83-270nt 近200 bp的序列作為YIDD的指示DNA 2，同樣的序列首尾再各除去約25 bp的GST 105-250nt近約150 bp的序列作為YVDD的指示DNA3;指示DNAl， 2， 3構(gòu)成獨(dú)立一套 指示系統(tǒng)。以此類推，選取另一無關(guān)的基因序列作為第二套指示系統(tǒng)，……等等。每個(gè)保留雜交序列從變異堿基開始斷開分成左半部分L和右半部分R。右半部分序列以 有意義鏈序列3'末端加在指示DNA上游5'端20bp序列前面合成指示DNA 5'端制備 引物，左半部以互補(bǔ)反義序列3'端接在指示DNA下游尾端20bp的反意義鏈序列5'端之 前合成指示DNA3'端制備引物。以此對磷酸化的引物和用pfo酶擴(kuò)增生成平末端的指示 加首尾DNA，其首尾兩端包含部分待測模板保留序列，制備的指示PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠 電泳純化及柱純化。2. 待測模板一指示DNA雜交連接酶反應(yīng)指示加首尾DNA與純化的待測標(biāo)本雜交，如有陽性模板則通過其保留雜交序列與指示 加首尾DNA兩頭末端序列雜交，使指示DNA兩側(cè)5'末端和3'末端因結(jié)合待測模板雜交 序列而促使同一指示DNA首尾靠近契合(juxtaposed)，其首尾末端磷酸基與羥基間缺口經(jīng)耐 熱連接酶TaqLigase連接修復(fù)而生成環(huán)狀指示DNA。并且雜交鏈缺口兩側(cè)堿基要完全匹配 才能修復(fù)成環(huán)，因此，YMDD指示DNA只能與YMDD motif雜交成環(huán)；YIDD指示DNA只能 與YIDD motif雜交成環(huán)；YVDD指示DNA只能與YVDD motif雜交成環(huán);單堿基錯(cuò)誤匹配不能修復(fù)成環(huán)而不會(huì)相互之間錯(cuò)配。而未雜交的雙鏈同一指示模板鏈的首尾平末端不能連 接，雙鏈指示DNA分子之間平末端的連接效率較雙鏈中單鏈的缺口修復(fù)效率低太多，并因 加入過量的平端8-20bp無關(guān)序列的Oligo寡聚物雙鏈DNA而幾乎全被抑制。結(jié)果只有陽性 標(biāo)本模板有雜交序列幫助的指示DNA才能形成環(huán)狀指示DNA，而陰性標(biāo)本則只存在線性 指示DNA。調(diào)節(jié)指示DNA含量或與待測標(biāo)本模板比例,可以控制雜交成環(huán)效率從而控制最終反向 PCR的非特異性背景及檢測分析靈敏度。采用連接酶鏈反應(yīng)Ligase Chain Reaction (Barany R,PNAS 1991,88:pl89-193)熱循環(huán)連接催化,第一循環(huán)產(chǎn)生的指示DNA環(huán)可以作為第二輪循 環(huán)的雜交模板，從而進(jìn)一步提高最終PCR檢測的靈敏度。3. 環(huán)狀指示DNA反向PCR:環(huán)狀YMDD指示DNA分子1 ， YIDD指示DNA分子2, YVDD指示DNA分子3均采用 同一套DNA序列，只是從兩端逐漸縮短,用指示DNA正中間共同的序列作為工作指示PCR 引物，向首尾外側(cè)延伸反向擴(kuò)增環(huán)狀DNA，間接指示待測模板的存在與多少。而非環(huán)狀各 種指示DNA則反向PCR因中間斷開而無法指數(shù)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用Agarose凝膠檢測分析, YMDD指示DNA分子1將產(chǎn)生約300 bp的片段，YIDD指示DNA分子2將產(chǎn)生約200 bp 的片段,YVDD指示DNA分子3將產(chǎn)生約150 bp的片段。反向?qū)崟r(shí)熒光PCR將反向PCR系統(tǒng)中加入DNA結(jié)合染料SYBR Green,或與Molecular Beacon, Taqmen，LightCycler等熒光分子探針聯(lián)用可實(shí)時(shí)定量檢驗(yàn)待測標(biāo)本模板含量。 一種 新型UT-PCR采用將PCR —側(cè)引物5'末端接上一段通用序列,再與該通用序列互補(bǔ)的 Taqmen熒光分子探針聯(lián)用實(shí)時(shí)定量檢測(Zhang Y., Nucleic Acids Research，2003,31-20:e123), 通用Taqmen不僅減少了熒光分子探針對模板擴(kuò)增的干擾，而且本底更低。4. 指示DNA的變通線性指示DNA正中間可以斷開，換句話說，可以合成左、右分開獨(dú)立的兩條指示DNA， 一條首端加右半部分保留雜交區(qū)序列，另一條尾端加左半部分保留雜交序列。中間斷開端 的序列仍作為反向PCR引物序列。除了不便于指示加首尾DNA的制做，純化。其余與成 環(huán)指示DNA方法全部相同。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)(1) 待測PCR可以置換成許多指示PCR，避免僅一套工作系統(tǒng)擴(kuò)增產(chǎn)物的再污染。(2) 拓展了常規(guī)PCR靈敏范圍，即可降低靈敏度減少非特異性擴(kuò)增，又可進(jìn)一步增加 靈敏度檢測極微量基因。(3) 待測DNA與RNA均可雜交直接置換成指示DNA，無需RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，特 別適合大量RNA病毒的直接檢測。(4) 尤其適合待測基因的單堿基及多堿基變異分析。(5)實(shí)時(shí)熒光置換PCR，易設(shè)置指示對照，定量更準(zhǔn)確；與高通量熒光PCR儀聯(lián)用，適 合高通量大規(guī)模并行分析。


圖1:本發(fā)明置換PCR示意圖其中(l)待測模板示意圖左側(cè)長直線代表含YMDD motif模板，粗線為有意義鏈或RNA， 細(xì)線為反意義鏈。(2) 指示模板右圖上斷開的雙環(huán)代表一套指示加首尾模板DNA，包括環(huán)線代表的一段與待測基因無關(guān)的序列和兩端的與待測模板互補(bǔ)的保留雜交序列(短直線部分)。(3) 左側(cè)代表陽性反應(yīng)待測模板與指示加首尾DNA序列雜交后經(jīng)Taq連接酶修復(fù)缺口，形成環(huán)狀指示DNA，并被反向PCR擴(kuò)增。(4) 右側(cè)代表陰性反應(yīng)缺口指示加首尾DNA被過量平端雙鏈Oligo競爭抑制，不能被Taq 連接酶環(huán)化，沒有擴(kuò)增。圖2A:為慢性乙肝耐藥變異檢測電泳結(jié)果.其中M lane (列)為DNA Marker, 1為正常血清標(biāo)本，2-4為3例YMDD陽性，5為一例 YMDD和YIDD混合感染，6為一例YIDD陽性，7為 一例YVDD陽性感染，8為陰性pUC 19 對照，9為混合質(zhì)粒pYMDD,pYIDD和pYVDD陽性對照 圖2B:為乙型肝炎YIDD和YVDD陽性標(biāo)本基因商業(yè)測序結(jié)果。具體實(shí)施方法下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。所用試劑均為市售。 實(shí)施例步驟慢性乙型肝炎感染者長期拉米夫定治療的6例血清和1例正常人血清標(biāo)本。分別用等 量酚/氯仿及單獨(dú)氯仿抽提，天根Tiangen公司DNA純化柱純化。每份標(biāo)本分別加入混合的 指示DNA分子1 ，分子2，分子3以及雙鏈寡聚DNA抑制物，標(biāo)本指示DNA雜交連接酶 反應(yīng)，以該連接酶反應(yīng)液l一2ul作為模板，加入反向PCR引物Reverse F和Reverse R,反向 PCR擴(kuò)增。同時(shí)以pUCYMDD (531_582aa)， pUC YIDD和pUC YVDD質(zhì)?；旌献鳛殛?性對照，單獨(dú)的pUC19質(zhì)粒作為陰性對照。 (一)指示加首尾DNA及引物的準(zhǔn)備(1).合成指示PCR引物(采用固相亞磷酰胺三酯法或商業(yè)定購5'末端磷酸化的引物)YMDD 5，端引物MF:首先待測HBV P基因YMDD保留雜交序列右半部分有意義鏈 18base，再加指示DNA1的首(5')端最開始的22base有意義鏈序列。5，-tg gat gat etg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3,YMDD3'端引物MR:首先待測HBVP基因YMDD保留雜交序列左半部分反意義鏈 20base，再加指示DNA1的尾端最開始的20base反意義鏈序列。 5，-t ata act gaa age caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3，YIDD 5'端引物IF:首先待測HBV P基因YIDD保留雜交序列右半部分有意義鏈 17base，再加指示DNA2的首(5')端最開始的19base有意義鏈序列。 5，陽t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c隱3，YIDD 3，端引物IR:首先待測HBV P基因YIDD保留雜交序列左半部分反意義鏈 21base，再加指示DNA2的尾端最開始的18base反意義鏈序列。 5，-at ata act gaa age caR aca gtc tgc acg etc ttt tgg-3，YVDD 5'端引物VF:首先待測HBV P基因YVDD保留雜交序列右半部分有意義鏈 17base，再加指示DNA3的首(5')端最開始的19base有意義鏈序列。 5'-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3，YVDD 3'端引物VR:首先待測HBV P基因YVDD保留雜交序列左半部分反意義鏈 21base，再加指示DNA3的尾端最開始的17base反意義鏈序列。 5，-ac ata act gaa age caR aca gec acc caa cat gtt gtg-3， 分別PCR擴(kuò)增指示加首尾DNA并用商業(yè)PCR產(chǎn)物純化柱純化。無關(guān)序列指示DNA M 5' 端指示引物Primer(5uM) lul 3' 端指示引物Primer(5uM) lul 10 Xpfu buffer 5ul 10mMdNTP lul pfii lul 幽Q_50ul置95'C變性5分鐘，25個(gè)循環(huán)，94°C 30秒，52°C 30秒，72°C45秒。25個(gè)循環(huán) 后72"C10分鐘。指示PCR產(chǎn)物經(jīng)天根Tiangen公司的DNA凝膠純化試劑盒按說明書純化。 (2).合成平端雙鏈抑制Oligo寡聚物搜尋一段與待測模板和指示DNA都無關(guān)((定義4 base堿基或4堿基以上連續(xù)相同為相 關(guān)，反之無關(guān))的短序列，合成一段8-20 base單鏈01igo，再合成一段與之序列互補(bǔ)反意義鏈 的8-20 base單鏈Oligo,雙鏈Oligo (lOOuM)混合，95'C加熱5分鐘，快速冰浴冷卻，貯存。本實(shí)施例采用非常稀有的歸位內(nèi)切酶Homing Endonucleases I-Ceu I部分識(shí)別序列:5，-ggt cct aag gta gcg-3'禾口互補(bǔ)反意義鏈5，-cgc tac ctt agg acc-3，。 (3).合成反向PCR引物:取指示DNA正中間約40bp長的序列，右半部分約20 base長的有意義鏈序列作為5'端 反向PCR引物RevF: 5，-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3，；左半部分約20 base長的反意義鏈作為 3'端反向PCR弓I物RevR: 5 ， -ate aat ata ata agg aag att g-3 ，。(二) 待測標(biāo)本的純化臨床標(biāo)本核酸純化(1) HBV DNA樣本的純化等量酚-氯仿抽提，商業(yè)DNA純化柱純化(詳細(xì)步驟按Tiangen說明書進(jìn)行)1) :加100-200ul樣本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)抽提，漩渦振蕩，臺(tái)式離心機(jī)離心最高速5分鐘。2) :上清100-200ul轉(zhuǎn)移至新EP管中，加等量氯仿，振蕩，離心。3) :上清加4倍的Tiangen結(jié)合緩沖液移至純化柱，洗滌緩沖液洗柱兩次，加50ul dH20洗脫收集純化的樣本。(2) HBVRNA樣本的純化異硫氰酸胍一步法提取總RNA (Chomczynski， P. et， al. 1987 Anal. Biochem. Vol 162:pl56)。樣本于EP管中加1ml的Trizole(0.5ml 4M異硫氰酸胍,和0.5ml酚，加0.05ml 2M醋酸鈉PH4.0)變性液裂解，強(qiáng)烈漩渦振蕩或用針頭反復(fù)抽吸，再加200ul氯 仿振蕩，離心5分鐘，取上清加等量0.5ml異丙醇置-20'C2小時(shí)再離心沉淀，70% 乙醇洗滌一次，力卩50ul DEPC處理的dH20溶解。Oligo(dT)順磁珠純化mRNA: —般沒有必要純化mRNA，如需要更純的模板，按 Promega公司說明書進(jìn)行。(三) 待測標(biāo)本與指示加首尾DNA雜交連接酶反應(yīng)純化的待測樣本 lul 純化的指示加首尾DNA lul 10X Taq連接酶緩沖液 2ul 抑制OIigo(lOOuM) luldH20_1M20ul置95'C變性5分鐘，上述20ul雜交反應(yīng)液中再加耐熱連接酶(采用自制連接酶TaL)0.5-lul，置50。C (40°C-70°C)溫育10分鐘。如果此步驟(三)采用連接酶鏈反應(yīng)Ligase Chain Reaction熱循環(huán)連接催化，第一循環(huán) 產(chǎn)生的指示DNA環(huán)可以作為第二輪循環(huán)的雜交模板，從而進(jìn)一步提高最終PCR檢測的靈敏 度。(四)反向PCR:雜交連接酶反應(yīng)液 2ul 反向引物Primer Rev F lul 反向引物Primer Rev R lul lOmMdNTP lul 10 XTaq PCR buffer 5ul Taq polymerase luldH20_^150ul置94。C變性5分鐘，25-30個(gè)循環(huán)，94°C 30秒，54°C 30秒，72。C30秒。25-30個(gè)循 環(huán)后72。C10分鐘。(五)PCR產(chǎn)物分析1. 瓊酯糖凝膠1.5%- 2.0% agarose電泳分析或在反向PCR液中加lul熒光分子探針或SYBR Green染料，熒光PCR擴(kuò)增實(shí)時(shí)檢測。2. 電泳結(jié)果(見圖2A):乙型肝炎6例慢性感染血清標(biāo)本，其3例YMDD陽性(見電泳凝膠2-4 lanes),凝膠顯 示300bp大小片段;僅一例YIDD陽性(電泳凝膠lane 6)，顯示200bp片段;一例YVDD陽性(電 泳凝膠lane 7)，顯示150bp片段;還有一例為YMDD和YIDD混合感染(電泳凝膠lane 5)， 同時(shí)顯示300bp和200bp大小兩條帶。正常血清標(biāo)本沒有擴(kuò)增(電泳凝膠lane l);陽性對照 pUCYMDD/YIDD/YVDD混合質(zhì)粒組(電泳凝膠lane 9)同時(shí)顯示300bp、 200 bp和150 bp三 條帶。陰性pUC19對照沒有擴(kuò)增(電泳凝膠lane 8)，不顯示任何DNA條帶。乙型肝炎YIDD禾BYVDD陽性標(biāo)本基因經(jīng)克隆，商業(yè)測序檢測(見圖2B)，其基因序 列為YIDD和YVDD突變。 -實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的檢測結(jié)果與商業(yè)測序相符合。
權(quán)利要求
1、一種檢測乙型肝炎病毒P基因YMDD motif及變異的置換擴(kuò)增法，其特征在于將待測P基因RT區(qū)DNA/RNA作為保留雜交序列與包括一套以上的指示DNA首尾互補(bǔ)序列雜交，連接酶反應(yīng)，指示加首尾DNA的首尾共價(jià)連接，形成置換指示DNA環(huán)，再反向PCR擴(kuò)增；所述待測P基因RT區(qū)包括YMDD、及變異YIDD和YVDD基因的DNA和RNA樣本，所述保留雜交序列為待測基因中P基因RT區(qū)含變異序列長度為20-100bp序列；從變異基因開始斷開形成左、右半部分序列，鏈長10-50base；所述指示DNA的序列是與HBV基因包括P基因RT區(qū)序列無關(guān)的基因序列，序列長度為80-1000bp；所述首尾互補(bǔ)雜交序列是指保留雜交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述指示DNA所述連接酶反應(yīng)包括0℃-20℃連接反應(yīng)和熱循環(huán)連接反應(yīng)；所述反向PCR擴(kuò)增是采用指示DNA正中間序列的右半部分作為反向引物Rev F，左半部分以互補(bǔ)反義序列作為反向引物Rev R，反向擴(kuò)增置換指示DNA環(huán)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述保留雜交序列為P基因RT 區(qū)一段長30-60base序列片段。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述指示DNA序列長度為150-500bp。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述連接酶反應(yīng)中的連接酶指DNAligase。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于:DNAligase為T4 ligase或Taq ligase。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述置換擴(kuò)增體系中還包括有熒 光分子信標(biāo)或熒光染料。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述熒光分子信標(biāo)為Molecular Beacon, Taqmen或LightCycler，熒光分子信標(biāo)序列與待測模板保留序列雜交或與指示模板 序列雜交。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述熒光染料為DNA熒光染料。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的置換擴(kuò)增法，其特征在于所述DNA熒光染料為SYBR Green。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述置換方法制備的檢測乙型肝炎病毒P基因YMDD變異 的試劑盒，包括DNA/RNA純化試劑，Taq連接酶及緩沖液、抑制Olligo、 dNTP、 Taq Polymerase及緩沖液，DNA熒光染料或分子信標(biāo)，凝膠電泳試劑，其特征在于還包括指 示加首尾DNA和反向引物Rev F和Rev R。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種檢測乙型肝炎病毒P基因YMDD變異的置換擴(kuò)增法”，其特征在于待測HBV P基因YMDD motif及變異YIDD，YVDD序列通過雜交-連接酶反應(yīng)置換成指示DNA，再反向擴(kuò)增指示系統(tǒng)。所述YMDD雜交序列分成左右兩半分別加在一段指示DNA首尾兩端，加了首尾指示DNA與P基因YMDD區(qū)序列雜交，使其首尾靠近契合，雜交鏈缺口連接酶連接。所述反向擴(kuò)增指示DNA，采用指示DNA正中間序列作為引物，反向擴(kuò)增首尾共價(jià)相連指示DNA。其缺口兩側(cè)堿基匹配依賴性連接使其適合單堿基變異基因分析。一個(gè)檢測可置換成許多指示PCR，避免僅一套系統(tǒng)擴(kuò)增產(chǎn)物的再污染。待測RNA也可以雜交-連接反應(yīng)置換成指示DNA而直接檢測?；蚺cSYBR Green染料或熒光分子探針聯(lián)用還適用于待測基因的實(shí)時(shí)定量分析。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101250581SQ200710176760
公開日2008年8月27日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者廖同兵, 洪 江 申請人:北京萬達(dá)因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司