專利名稱：能夠在沙門氏疫苗菌株表面表達酸免疫瘧疾抗原的重組表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的重組表達載體，它能夠在沙門氏疫苗菌株表面表達瘧疾抗原HRPⅡ或SERP的致免疫肽。本發(fā)明還涉及含有該沙門氏菌并在通過口服接種后誘導(dǎo)哺乳動物體液免疫應(yīng)答的疫苗。
瘧疾抗原HRPⅡ和SEPR已在下列文獻中進行過特征鑒定EP-A2 0 315 085，Wellems and Howard，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 83(1986)，6065-6069，Knapp等人，Behring Res.Commun.82(1988)，349-359，EP-A1 0 283 882，Knapp等人，Mol.Biochem.Paras.32(1989)，73-84，以及Higgins等人，Nature 340(1989)，604。雖然部分上述文獻也公開過含有該抗原或其免疫活性部分的疫苗，但仍然需要提供一種適于誘發(fā)具有保護作用且可靠的體液免疫反應(yīng)以對付引起瘧疾的原生動物如惡性瘧原蟲(P.falciparum)的改良疫苗。
在DE-A38 28 666和EP-A0357208中公開了可作為活疫苗應(yīng)用的被轉(zhuǎn)化的細菌菌株。Hackett，Vaccine 8(1990)，5-11總結(jié)了有關(guān)沙門氏菌疫苗領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)狀況。
構(gòu)成本發(fā)明的技術(shù)問題是提供遺傳工程生產(chǎn)的沙門氏菌株，它適于在口服后通過誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答而產(chǎn)生對瘧疾的保護性和可靠的預(yù)防作用。
以上技術(shù)問題是通過提供權(quán)利要求書中所定義的實施方案而得以解決的。
因此，本發(fā)明提供了包括以下成分的重組表達載體(a)一個強誘導(dǎo)啟動子;
(b)一個編碼革蘭氏陰性細菌雜化的OmpA蛋白的雜化基因;
(c)一個定位于OmpA基因中相應(yīng)在OmpA蛋白的第三外環(huán)的克隆位點;和(d)一個DNA序列，即(da)被整體插入克隆位點(c)，(db)編碼能夠在哺乳動物中誘發(fā)體液免疫應(yīng)答的瘧疾抗原HRPⅡ或SERP或其一部分，該瘧疾抗原最好得自惡性瘧原蟲。
術(shù)語“強誘導(dǎo)啟動子”是指在轉(zhuǎn)錄水平上對位于其下游的序列所編碼的蛋白質(zhì)的表達具有高效控制作用的一個核苷酸序列，它可通過溫度轉(zhuǎn)移或加入化學(xué)物質(zhì)(如IPTG)而被誘發(fā)。該強誘導(dǎo)啟動子的一個優(yōu)選實例是受控于lac阻遏物的tac啟動子。
術(shù)語“克隆位點”是指含有限制性內(nèi)切酶切割位點、適于整合所需DNA片段的一個DNA序列。
術(shù)語“在哺乳動物中能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)的瘧疾抗原HRPⅡ或SERP的一部分”是指對生產(chǎn)疫苗有用的HRPⅡ或SERP的區(qū)域。這種區(qū)域本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員按照傳統(tǒng)方法可確定，例如應(yīng)用傳統(tǒng)的計算機程序(可通過實驗證實T-細胞抗原決定基)。對于SERP，這種區(qū)域最好是與SH蛋白酶同源的區(qū)域，或含有T-細胞抗原決定基。在本文中術(shù)語“SH蛋白酶”是指在其活性部位帶有必需的半胱氨酸殘基的蛋白酶。術(shù)語“T-細胞抗原決定基”是指刺激由T-淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答的一個氨基酸序列。
由本發(fā)明的重組表達型載體編碼的融合蛋白在表達后被轉(zhuǎn)運至細菌細胞壁，并按使瘧疾抗原HRPⅡ或SERP或其所說部分出現(xiàn)于外部環(huán)境的方式插入到細胞壁中。該表現(xiàn)方式通過使暴露于該轉(zhuǎn)化細菌宿主的哺乳動物免疫系統(tǒng)識別該瘧疾抗原并產(chǎn)物保護性免疫應(yīng)答而發(fā)揮作用。該瘧疾抗原最好以與其天然形式相似的構(gòu)象存在于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細菌宿主的表面。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，重組表達型載體還包括(ca)被插入到所說克隆位點(c)的一個編碼流感血凝素(HA)蛋白1-48氨基酸和279-515氨基酸的DNA序列，在編碼HA蛋白的第46個氨基酸處含有第一克隆位點，在編碼HA蛋白的第400氨基酸處含有第二克隆位點，其中該DNA序列(d)被插入到DNA序列(ca)的至少一個所說的克隆位點。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，所說的部分HRPⅡ由存在于重組表達載體pOmpA-6中的189個氨基酸組成，該載體的限制性內(nèi)切酶的酶切圖譜示于

圖1。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，重組表達型載體編碼由177個氨基酸組成的HRPⅡ的部分，它存在于具有圖1所示限制性酶切圖譜的重組表達型載體pOmpA-3中。
在本發(fā)明重組表達型載體的另一優(yōu)選實施方案中，所說的SERP的部分含有一個與SH蛋白酶同源的區(qū)域。
在一最佳實施方案中，與SH蛋白酶有同源區(qū)域含有SERP的442-892、573-595或745-787位氨基酸。
在本發(fā)明重組表達型載體的一更優(yōu)選實施方案中，所說的SERP的部分含有至少兩個T-細胞抗原決定基。
在其最佳實施方案中，含有T-細胞抗原決定基的該部分含有SERP的442-892或640-700位氨基酸。
本發(fā)明重組表達載體的更優(yōu)選實施方案已在權(quán)利要求書中進行了描述。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明任一重組表達型載體所轉(zhuǎn)化的沙門氏疫苗菌菌株。
在一優(yōu)選實施方案中，該沙門氏疫苗菌得自傷塞沙門氏菌或鼠傷塞沙門氏菌，在本文中已經(jīng)明確鼠傷塞沙門氏菌對小鼠的感染性最強，且其在小鼠中的接種性質(zhì)在現(xiàn)有技術(shù)中常常被用作傷塞沙門氏菌及其在人體中接種性質(zhì)的模型系統(tǒng)。
編碼瘧疾HRPⅡ抗原189個氨基酸和瘧疾SERP抗原451個氨基酸的核苷酸序列是與表達載體的多聚連接子克隆在一起，該表達型載體含有通過重組DNA技術(shù)從革蘭氏陰性細菌E.coli和痢疾志賀氏菌OmpA基因獲得的雜化OmpA基因。用這些重組載體轉(zhuǎn)化鼠傷塞疫苗菌并誘導(dǎo)表達后將使該瘧疾抗原或其部分在轉(zhuǎn)化細菌表面表達。用本發(fā)明被轉(zhuǎn)化的鼠傷塞沙門氏疫苗菌口服接種小鼠將導(dǎo)致顯著的抗相應(yīng)瘧疾抗原的體液免疫應(yīng)答。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及由本發(fā)明任一沙門氏疫苗菌所表達并能夠在哺乳動物中誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的重組融合蛋白。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明沙門氏疫苗菌株或本發(fā)明重組融合蛋白的預(yù)防瘧疾疫苗。本發(fā)明疫苗中的這些免疫活性化合物通常與可藥用載體和/或稀釋劑結(jié)合服用。
在一優(yōu)選實施方案中本發(fā)明的疫苗是通過口服應(yīng)用。因此，本發(fā)明的疫苗最好以不被胃酸破壞而能保護免疫活性成分的形式提供。
本發(fā)明再一方面是涉及預(yù)防瘧疾的方法，包括給需要治療的哺乳動物服用需要劑量的本發(fā)明沙門氏疫苗菌株或重組融合蛋白，該劑量適于誘導(dǎo)保護性體液免疫應(yīng)答。
圖表表示表1(A)質(zhì)粒pHS164-L的多聚連接子區(qū)。起始質(zhì)粒pHS164的序列用小字母表示。在ClaI和StuI位點間插入一寡核苷酸后形成pHS164-L。
(B)質(zhì)粒pinf4-49HA編碼區(qū)中的連接子Ⅰ和連接子Ⅱ。
圖1本發(fā)明OmpA融合質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。它顯示了OmpA、HA、HRPⅡ和SERP融合基因的編碼區(qū)和大小。標出了相關(guān)的限制性酶切位點，尤其是基因融合連接處的切點。
圖2小鼠的抗體應(yīng)答。通過口服鼠傷塞沙門氏菌SR-11菌株后在其表面表達的HRPⅡ和SERP Omp融合蛋白而被免疫。小鼠口服免疫0、7、14、21天(箭頭所示)。于第0、14、28和56天采集血樣保存，通過ELISA測定HRPⅡ和SERP特異性抗體的存在。為了Ig定型，使用與抗IgG(A)和抗IgM(B)特異性POD結(jié)合的山羊抗血清。星號＝pOmpA-3;圓圈＝pOmpA-6;三角＝pOmpA-5;實心圓＝pOmpA-7。滴度指試驗血清的A492與免疫前血清的A492之比大于2.0時試驗血液的最高稀釋度。
表2583bp HRPⅡ cDNA片段的核苷酸序列和由它所產(chǎn)生的氨基酸序列(大寫字母)。載體pUC8的序列用小寫字母表示。用于構(gòu)建pOmpA-3的代表Bal 31消化液5′端的C核苷酸用星號標明。其中還顯示了與載體pOmpA-3和pOmpA-6的構(gòu)建有關(guān)的限制性酶切位點。在pOmpA-6的構(gòu)建中用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸對應(yīng)于劃線的序列。
表3完整SERP基因的核苷酸序列及由其產(chǎn)生的氨基酸序列。
括弧中表示了通過KpnI和PstI消化(構(gòu)建pOmpA-5)分離或通過PCR擴增(擴增片段用于構(gòu)建pOmpA-7)的1.3kb DNA片段。圓點表示潛在的糖基化位點。箭頭表示內(nèi)含子。劃線區(qū)代表重復(fù)成分。
以下實施例進一步說明本發(fā)明。應(yīng)用重組DNA技術(shù)方面的其它情況請看Sambrook等人，“Molecular Clioing”，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Har-bour，2nd edition，1989。
實施例1攜帶編碼HRPⅡ和SERP基因片段的OmpA載體的構(gòu)建OmpA表達載體pHS164和pinf4-49已被S.Pistor和G.Hobom(S.Pistor和G.Hobom，Klin.Wochenschr.66(1988)，110-116，DE-A38 28 666)構(gòu)建。pHS164編碼由大腸桿菌OmpA蛋白的1-46位氨基酸和痢疾志賀氏菌OmpA蛋白的47-233位氨基酸組成的雜化OmpA蛋白。為了提供更多的克隆位點，將攜帶ClaI、NsiI、NdeI、SalI、NcoI、KpnI、SmaI和Stul特定限制性酶切位點的多聚連接子序列5′-ATCGATGCATATGTCGACCCATGGTACCCGGGGAGGCCT-3′插入到pHS164的特定ClaI和StuI位點之間，產(chǎn)生pHS164-L(表1a)。所有必需的克隆步驟均在大腸桿菌K12A490(recA、lac、met、thr、rk-、mk-)中完成。按常規(guī)方法(Sam-brook等，出處同前)分離質(zhì)粒DNA、制備DNA片段、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞。按照雙脫氧終止法使用USB方案(Cleveland，Ohio)完成雙鏈DNA上的核苷酸序列分析。由pHS164-L編碼的OmpA蛋白在其第三外環(huán)上攜帶有9個附加氨基酸。來自O(shè)mpA蛋白的與翻譯閱該框架相配的外源DNA插入到多聚連接子中后導(dǎo)致其在OmpA的第三外環(huán)中表達。質(zhì)粒pinf4-49編碼在OmpA的第三外環(huán)處的類莖(stem-like)結(jié)構(gòu)，它由流感HA蛋白的1-48位和279-514位氨基酸組成的疏水片段形成。兩個克隆位點的位置是連接子Ⅰ位于與HA基因的46密碼子相應(yīng)的位置，連接子Ⅱ位于與HA基因的400密碼子相對應(yīng)的位置(Tap.16，DE-A38 28 666)。在兩個連接子之間克隆DNA片段是為了改善表達抗原的暴露。
在OmpA載體中，OmpA基因的轉(zhuǎn)錄受tac-啟動子控制，其活性被lac-阻遏物控制。lacIQ等位基因本身存在于載體之上，因此lac-阻遏物將順式提供，而不管細菌菌株的實際遺傳背景。
利用載體pHS164和pinf4-49構(gòu)建了四個表達型質(zhì)粒(圖1)pOmpA-3來自翻譯終止密碼子缺失的攜帶0.55kb的小的SmaI-XhoI-cDNA片段(表2)的pSK-HRPⅡ用SmaI和XhoI消化。分離該片段并將其克隆至pinf4-49的相應(yīng)位點。更具體地說，是進行以下步驟1.用HindⅢ消化pUC8-HRPⅡ。
2.按照Sambrood等人的方法(出處同前)用Bal31進行消化。
3.用Klenow酶進行填充反應(yīng)(fill-inreaction)。
4.用T4DNA多聚酶進行填充反應(yīng)。
5.用EcoRI消化，導(dǎo)致插入子的釋放.
6.凝膠電泳DNA片段，并分離DNA片段，它比插入子DNA短30-80bp。
7.用HindⅡ和EcoRI消化Bluescript psk(+)載體DNA。
8.將Bal 31片段連接至HindⅡ/EcoRⅠ消化的psk(+)中。
9.用重組載體轉(zhuǎn)化XL1藍細胞。
10.用XhoI和EcoRI對DNA小劑量(minipreps)進行分析。
11.對來自20個不同克隆的小劑量(miniprep)DNA進行序列分析沒有一個DNA片段與載體pinf4-49nXhoI位點框架一致。
其中一個克隆在HRPⅡ的3′克隆位點具有以下序列
該構(gòu)建物的XhoI位點與pinf4-49載體中的XhoI位點不在同一框架中。通過這一克隆步驟產(chǎn)生一個新的HpaⅡ限制性切點。
12.用KpnI和EcoRI消化該克隆的DNA。
13.分離插入子DNA。
14.用HpaⅡ限制性消化插入子DNA。
15.通過凝膠電泳分離600bp EcoRI-HpaⅡ片段。
16.將插入子連接至用AccI和EcoRI消化的pSK(+)中。
以下流程概括了缺失HpaⅡ位點的5′c末端的設(shè)想a)用HpaⅡ消化重組載體
b)用AccI消化載體pSK(+)
c)將HRPⅡ的600bp EcoRI HpaⅡ片段連接至用AccI和EcoRI消化的pSK(+)中。
缺失HPRⅡ位點中的堿基C導(dǎo)致新的重組載體的產(chǎn)生，其中pSK-HRPⅡ質(zhì)粒的XhoI位點現(xiàn)在則與載體pinf4-49中的XhoI位點位于同一框架中。
17.通過序列分析構(gòu)成新序列(缺失HRPⅡ3′末端的堿基c)18.用SmaI和XhoI進行限制性消化，并分離600bp片段。
19.將該600bp片段克隆至用SmaI和XhoI消化的pinf4-49中，產(chǎn)生新的重組載體pOmpA-3。
pOmpA-5用KpnI和PstI消化攜帶有5.8kb XbaI片段上的完整SERP基因的pUC18-SERP(Knapp等人，Mol.Biochem，Para sitol，32(1989)，73-84)。分離出1.3kb的片段，并將其連接至psk載體的相應(yīng)位點(Stratagene)。將SERP片段亞克隆至pSK以在SERP編碼區(qū)3′末端產(chǎn)生正確的翻譯閱讀框架。所產(chǎn)生的質(zhì)粒pSK-SERP用SmaI和KpnI消化，分離1.3kb的片段，并克隆至pHS164-L的相應(yīng)位點。
pOmpA-6將寡核苷酸序列(1∶5′-CGACCTGCAGGAACATGTAGCCGATGCCC-3′和2∶5′-GCAGAGTTATTAAATAAATTTGGTACCATGGCGTAGGCAATGTGTGGCGGCTTC-3′)與質(zhì)粒pUC8-HRPⅡ(Knapp等，Behring Res.Commun.82(1988)349-359)一起使用，以按照公開方法(Saiki等，Science 230(1988)，1350-1354)通過PCR擴增0.6kb片段(表2)。將該片段克隆至用PstI和KpnI消化后的pHS164-L載體的NsiI和KpnI位點。
pOmpA-7將兩個寡脫氧核苷酸(1∶5′-AAGGGAACAAAATCTAGAGGTACCTTAGATAATTATGGG-3′和2∶5′-CTAGTGGATCCCGTCGACTGCAGATTCTAATGCAGTATTGCT-3′)與pSK-SERP一起用于PCR。所產(chǎn)生的1.3kb(表3)片段用XbaI和SalI消化，并克隆至pinf4-49的這些位點之間的框架中。
所產(chǎn)生的質(zhì)粒pOmpA-3和pOmpA-6分別編碼HRPⅡ抗原的177和189個氨基酸，pOmpA-5和pOmpA-7均編碼SERP抗原的451個氨基酸。在pOmpA-5和pOmpA-6中，SERP和HRPⅡ部分序列分別被插入到OmpA的第三外環(huán)中，而在pOmpA-3和pOmpA-7中這些抗原則被OmpA第三外環(huán)中的HA疏水部分另外“夾心”。
構(gòu)建重組載體之后，通過DNA序列分析發(fā)現(xiàn)瘧疾特異性片段分別位于OmpA和HA編碼序列的框架中。根據(jù)雙脫氧鏈終止法使用USB(Cleveland，Ohio)的方案完成雙鏈DNA的核苷酸序列分析。使用在MicrovaxⅡ上完成的UWGCG序列軟件(Devereaux等人，Nucl.Acids Res.12(1984)，387-395)分析序列數(shù)據(jù)并制作質(zhì)粒圖譜。表4分別列出了這些質(zhì)粒，并詳細介紹了OmpA融合蛋白的性質(zhì)以及預(yù)期的和通過SDS-PAGE觀察到的分子量。
實施例2HRPⅡ和SERP OmpA融合蛋白被有效地表達并暴露在鼠傷塞沙門氏菌表面。
使用BioRad Gene Pulser，通過電擊穿用大腸桿菌的OmpA表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化攜帶質(zhì)粒pY248(鼠傷寒沙門氏菌株phi4072(py248))的鼠傷塞沙門氏菌phi3730(LT2-Z，leu，hsdLT，galE，trpD2，rpsL120，delta asdAl，delta[zhf-4Tn10]，met E551，metA22，hsdsA，hsdSB，ilv)和SR-11(pstsR100，gyrA1816，delta cya-1，delta crp-1，delta asdAl，delta[delta[zja-4Tn10])(Nakajama等人，Biotechnology 6(1988)，693-697)用限制性缺失的易修飾(modification-proficient)的鼠傷塞沙門氏菌phi3730修飾pHS164-L和pinf4-49、OmpA-3、-5、-6和-7，并在再分離質(zhì)粒后，將它們轉(zhuǎn)化至熟練限制(restrictior-profi-cient)，熟練修飾(modification-pro-ficient)的鼠傷塞沙門氏菌phi4072(py 248)在預(yù)冷的小玻璃管中將1μgDNA與約2.5×108個細胞混合，并在約10KV/cm的電場強度中電擊穿9毫秒。電擊穿混合物稀釋至1mlSOC培養(yǎng)基(0.5%Bacto醇母浸膏、2%Bacto胰酶解胨、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖)中，并于37℃振蕩培養(yǎng)1小時。將等份試樣放至缺乏二氨基庚二酸(DAP)的LB-AMP中并于37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化株(ASD+/AMPr)含有兩種質(zhì)粒存在于質(zhì)粒pV248中的ASD標記物以及表4所示四個OmpA表達型質(zhì)粒之一。轉(zhuǎn)化效率為1×104/μg質(zhì)粒DNA(大腸桿菌菌株490A的對照轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1×108/μg質(zhì)粒DAN)。
將單個轉(zhuǎn)化菌落在5ml LB/AMP培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜。然后將100μg該培養(yǎng)物稀釋到上述培養(yǎng)基的5ml中，并且細胞生長至OD600為0.5-0.6。通過加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達，并將培養(yǎng)物再培養(yǎng)3小時。離心收集細胞，按所述方法(Amann等，Gene69(1988)，301-305)進行裂解。通過SDS-PAGE分析最終沉淀。對被表達型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的沙門氏菌培養(yǎng)物的膜成分所作的SDS-PAGE分析揭示和證實了IPTG誘導(dǎo)后具有預(yù)期分子量的新蛋白質(zhì)帶的存在。這些蛋白質(zhì)僅存在于膜部分，占全部細胞蛋白質(zhì)的10-15%。
分別使用抗OmpA的14C-末端氨基酸(作為半抗原與KLH偶聯(lián))的抗血清或使用單特異性抗SERP或抗-HRPⅡ免抗血清對同一樣品進行Western印跡分析后證明了表達產(chǎn)物的同一性。除主帶外，還觀察到部分降解成分。
使用免疫熒光技術(shù)研究鼠傷塞沙門氏菌的菌表面是否存在HRPⅡ和SERP抗原。為此，離心200μl被誘導(dǎo)的細菌培養(yǎng)物。用300μlPBS洗滌細菌兩次并懸浮于100μlPBS。以1/50的稀釋度加入抗HRPⅡ或抗-SERP抗血清，于4℃將混合物過夜培養(yǎng)。離心收集細胞，按前述方法洗滌后懸浮于100μlPBS中。以1/50的稀釋度加入取自山羊的FITC-標記的抗免IgG，并于黑暗條件下將該混合物于室溫下培養(yǎng)2小時。再次收集細胞，按前述方法洗滌后再懸浮于50μlPBS中。吸取10μl該樣品至顯微鏡蓋玻片上，于37℃干燥。用蒸餾水仔細洗滌蓋玻片，再次干燥，并用Moriol固定。于zeiss顯微鏡中于紫外光(300nm)下觀察細菌并將材料拍照，其照片顯示出被抗HRPⅡ抗血清探測的攜帶OmpA-3細胞的免疫熒光。當用相應(yīng)的抗血清探測時攜帶OmpA-5、-6和-7的重組細菌顯示出各個細胞的相似免疫熒光強度和相似的免疫熒光陽性細胞數(shù)(約90%)。當對攜帶載體質(zhì)粒pHs164-L或pinf4-49的細胞或當表達作為包含體存在于細胞內(nèi)的HRPⅡ或SERP抗原的大腸桿菌細胞進行測試時未觀察到熒光。這些研究說明了瘧疾抗原在被轉(zhuǎn)化的鼠傷塞沙門氏菌表面有效表達。
實施例3用重組沙門氏菌進行口服免疫后在小鼠中誘導(dǎo)抗-HRPⅡ和抗SERP抗體為了研究重組沙門氏菌SR-11菌株對抗在細菌表面表達的HRPⅡ和SERP抗原的體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)能力，分別于第0、7、14和21天給NMRⅠ小鼠口服被IPTG所誘導(dǎo)的攜帶質(zhì)粒OmpA-3、-5、-6或-7的細菌的約2×10g細胞。口服之前將小鼠饑餓5小時。在用細菌喂養(yǎng)之前給小鼠口服0.1ml碳酸氫鈉(5%)以中和胃pH值。于0、14、28和56天從眶后吸取100μl血樣，測定貯存血清中HRPⅡ和SERP特異性IgG和IgM的存在(圖2)將純化的重組大腸桿菌產(chǎn)生的SERP或HRPⅡ-MS2融合蛋白(5μg/ml，Knapp等人(1988)，出處同前;Knapp等，(1989)，出處同前)涂布的ELISA平板于室溫下過夜培養(yǎng)，然后洗滌。為了血清滴定，將系列稀釋的血清樣品加到ELISA平板上，并于37℃培養(yǎng)1小時，洗滌三次后于37℃與50μlPOD連接的抗鼠抗體一起培養(yǎng)1小時。洗滌之后用50μl鄰苯二胺/H2O2溶液觀測結(jié)合抗體。測定492nm處的光密度。
抗HRPⅡ的IgG應(yīng)答比抗SERP的IgG應(yīng)答快(圖2a)。毗鄰HRPⅡ和SERP抗原(存在于被pOmpA-3和pOmpA-7表達的相應(yīng)融合蛋白中)的HA疏水部分并未導(dǎo)致增高的IgG滴度。抗HRPⅡ和抗SERP的IgM應(yīng)答未顯示出明顯差別，并且在14天后開始下降(圖2b)。對用重組沙門氏菌口服免疫后獲得的抗-HRPⅡ和抗-SERP小鼠血清的惡性瘧原蟲多肽進行的Western印跡分析顯示出相應(yīng)的抗原。
這一實驗說明用在其表面表達瘧疾抗原的沙門氏疫苗菌口服接種小鼠后誘導(dǎo)出特異性血清IgG抗體。
表1
表2
表權(quán)利要求
1.一種制備包括以下成分在內(nèi)的重組表達型載體的方法(a)強誘導(dǎo)啟動子；(b)編碼革蘭氏陰性細菌雜化OmpA蛋白的雜化基因；(c)位于OmpA基因中相對于Ompa蛋白第三外環(huán)部分的克隆位點；它是通過將編碼能夠在哺乳動物中誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的瘧疾抗原HRPⅡ或SERP或其一部分的DNA序列(d)插入到克隆位點(c)，所說的瘧疾抗原最好得自惡性瘧原蟲。
2.如權(quán)利要求1所述的制備重組表達型載體的方法，它另外將編碼流感血凝素(HA)蛋白1-48位和279-515位氨基酸的DNA序列(e)插入到所說的克隆位點(c)，該DNA序列(e)在編碼HA蛋白的46位氨基酸處含有第一個克隆位點，在編碼HA蛋白的400位氨基酸處含有第二個克隆位點，其中所說的DNA序列(d)被插入到DNA序列(e)的至少一個所說克隆位點。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備重組表達型載體的方法，其中所說的HRPⅡ的部分由存在于具有表1所示限制性圖譜的重組表達載體pOmpA-6中的189個氨基酸組成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的制備重組表達型載體的方法，其中所說的HRPⅡ的一部分由存在于具有表1所示限制性圖譜的重組表達載體pOmpA-3中的177個氨基酸組成。
5.如權(quán)利要求1或2所述的制備重組表達型載體的方法，其中所說的SERP的一部分含有與SH蛋白酶同源的區(qū)域。
6.如權(quán)利要求5所述的制備重組表達型載體的方法，它含有SERP的氨基酸442-892、573-595或745-787。
7.如權(quán)利要求1或2所述的制備重組表達型載體的方法，其中所說的SERP的部分含有至少一個T-細胞表面抗原。
8.如權(quán)利要求7所述的制備重組表達型載體的方法，它含有SERP的442-892氨基酸或640-700氨基酸。
9.按權(quán)利要求1-8中所述的任一項制備重組表達型載體的方法，其中所說的啟動子是受控于存在于同一表達載體分子上游的lac-阻遏物的tac-啟動子。
10.按權(quán)利要求1-9中所述任一項制備重組表達型載體的方法，其中所說的雜化基因(b)編碼一雜化蛋白，其中(ba)編碼氨基酸1-233的DNA序列得自痢疾志賀氏菌OmpA基因;及(bb)編碼氨基酸234-325的DNA序列得自大腸桿菌OmpA基因。
11.按權(quán)利要求1-10中所述的任一項制備重組表達型載體的方法，其中所說的克隆位點是一個具有核苷酸序列5′-ATCGATGCATATGCTGACCCATGGTACCCGGGGAGGCCT-3′的多聚連接子。
12.通過用權(quán)利要求1-11中任一項的重組表達載體進行轉(zhuǎn)化而制備轉(zhuǎn)化的沙門氏疫苗菌株的方法。
13.按權(quán)利要求12所述的制備轉(zhuǎn)化沙門氏疫苗菌株的方法，它得自傷塞沙門氏菌或鼠傷塞沙門氏菌。
14.制備能夠在哺乳動物中誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的重組融合蛋白的方法，它是用權(quán)利要求1-11中所述的任一項重組表達型載體轉(zhuǎn)化沙門氏疫苗菌株。
15.按權(quán)利要求14所述的制備重組融合蛋白的方法，其中所說的沙門氏疫苗菌得自傷塞沙門氏菌或鼠傷塞沙門氏菌。
16.用于預(yù)防瘧疾的疫苗的制備方法，它是將權(quán)利要求12或13所述的沙門氏疫苗菌或權(quán)利要求12或13所述的重組融合蛋白或權(quán)利要求14的重組融合蛋白與任意結(jié)合的可藥用載體或稀釋劑結(jié)合使用。
17.按權(quán)利要求12或13的沙門氏疫苗菌株或按權(quán)利要求14或15的重組融合蛋白的劑量的使用方法，所說的劑量適于誘導(dǎo)保護性體液免疫應(yīng)答，適用于瘧疾的預(yù)防。
全文摘要
本發(fā)明敘述了能夠在可誘導(dǎo)哺乳動物體液免疫應(yīng)答的革蘭氏陰性菌表面表達瘧疾抗原HRPII或SERP或其一部分的重組表達載體。另外也敘述了相應(yīng)的沙門氏菌疫苗。
文檔編號C12N15/30GK1060498SQ91108728
公開日1992年4月22日 申請日期1991年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月8日
發(fā)明者約西母·失爾, 伯哈德·納浦, 艾理卡·亨特, 漢斯·庫浦, 艾岡·阿曼 申請人:柏林魏克股份公司