專利名稱：一種新的(zsp)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基的制作方法
該發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體的講，發(fā)明屬植物生物技術(shù)的大豆生物技術(shù)研究領(lǐng)域。
無論在大豆細胞工程還是在基因操作研究中，建立原生質(zhì)體培養(yǎng)系一直為國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。栽培大豆(Glycine max L.)原生質(zhì)體研究方面，雖然由懸浮細胞、未成熟的莢果組織、幼苗根、葉肉組織、未成熟或成熟子葉和下胚軸及下胚軸發(fā)生的懸浮培養(yǎng)細胞游離的原生質(zhì)體可持續(xù)分裂獲得愈傷組織、甚至由愈傷分化只形成了根，直至1988年以后衛(wèi)志明、羅希明等人才從未成熟子葉游離原生質(zhì)體再生成植株。大豆野生種G.canescens、G.clandestina、G.argyrea和G.soia的原生質(zhì)體培養(yǎng)也已有再生植株或形成芽的報導(dǎo)。不過，他們均采用了非胚性愈傷組織，通過器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)植株再生。這種途徑重復(fù)性很差，不便于進行細胞工程和基因操作。大量試驗表明，若不建立胚性愈傷組織或胚性細胞系，很難使原生質(zhì)體形成再生植株。在誘發(fā)或保持胚性狀態(tài)中，選擇適宜的培養(yǎng)基是十分必要的。
在大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)中，國內(nèi)外多采用K8P培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還有Gamborg等人設(shè)計的B5培養(yǎng)基，以及用MS培養(yǎng)基無機成分加B5培養(yǎng)基有機成分為基本培養(yǎng)基的MSB培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基只能使大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)成非胚性愈傷組織，不能形成胚性愈傷組織或胚性細胞系。所以直至1990年，未見大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)成胚性愈傷組織，通過胚胎發(fā)生途徑誘導(dǎo)植株再生的報導(dǎo)。1990年我們根據(jù)大豆氮代謝的特點，以及大豆未成熟子葉的細胞分裂與生長期代謝機理，研制了一種新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基，使栽培大豆(Glycine max L.)的未成熟子葉游離的原生質(zhì)體，形成了胚性愈傷組織。該愈傷組織在體細胞胚分化培養(yǎng)基上，直接分化出體細胞胚，并進一步誘導(dǎo)出再生植株，進入正常發(fā)育而開花。
以大豆根瘤形成的酰尿等特異有機態(tài)氮化合為主要氮源，并使大豆原生質(zhì)體形成胚性愈傷組織的培養(yǎng)基迄今尚未見報導(dǎo)，確屬一種新的大原生質(zhì)體培養(yǎng)基。
建立胚性愈傷組織或胚性細胞系，可通過胚胎發(fā)生途徑，誘發(fā)再生植株，以建立有效而可靠的大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)系，可進行細胞雜交和基因工程，擴大大豆變異幅度，拓寬遺傳資源，改革大豆常規(guī)育種程序，快速選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗大豆品種。
在建立上述原生質(zhì)體培養(yǎng)系中，首先要建立胚性愈傷組織或胚性細胞系。在誘發(fā)或保持胚性狀態(tài)中，創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)基是十分必要。所以能使大豆原生質(zhì)體形成胚性愈傷組織的新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基的發(fā)明，不僅為建立有效而可靠的大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)系起重要作用，而且為大豆細胞工程和基因操作奠定重要基礎(chǔ)。它為開發(fā)與應(yīng)用大豆生物技術(shù)將起積極作用。
培養(yǎng)基成分應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)物的植物種、組織、器官和培養(yǎng)目的而決定。大豆的氮素營養(yǎng)主要是由根瘤固氮形成的酰尿和土壤中吸收的硝酸態(tài)氮、天冬酰胺分配到地上部而被利用。大豆根瘤固定的氮素先形成天冬酰胺和谷氨酰胺，進而形成尿囊素和尿囊酸(主要是后者)運輸?shù)蕉骨v和生長中的籽粒細胞，大部分由氨基酸代謝形成蛋白質(zhì)，所以大豆也稱為酰尿植物。酰尿的C/N比低，可高效率地使碳水化合物釋放出大量的還原態(tài)氮。
故一種新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基，大量元素為1/2MS(但硝酸銨為1/40)，以天冬酰胺、谷氨酰胺、尿囊素和尿囊酸等大豆根瘤形成的酰尿特異有機態(tài)化合物為主要氮源，調(diào)節(jié)NH+4.NO-3和PH，微量元素同MS，有機成分是在MS基礎(chǔ)上增加維生素B1和Casamino acid，附加2.4-D、BA等激素。適量的蔗糖為碳源并用甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓。培養(yǎng)基成分組成及其配方如下
(A)成分 含量(mg/l)NH4NO340KNO3950KH2PO485H3BO36.2MnSO4·4H2O 22.3ZnSO4·7H2O 8.6Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025MgSO47H2O 185CaCl2·2H2O 220KI0.83煙酸 0.5鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫銨素0.1甘氨酸 2肌醇 100Na2-EDTA 37.3FeSO4·7H2O 27.8庶糖 15，000甘露醇80；0002,4-D 0.1BA 1pH5.8 滲透壓 560～580mOSMOL/kg(B)成分 含量(mg/l)天冬酰胺 60谷氨酰胺 60尿囊素 60尿囊酸 60鹽酸硫銨素 0.6Casamino acid 125培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基成分中的A部分調(diào)制后，以0.01NKOH調(diào)PH為5.8，用甘露醇調(diào)整滲透壓為580mOSMOL/kg，在0、11mPa下滅菌15分鐘，冷卻后在無菌條件下，濾過滅菌(0.45μ)添加B部分，使培養(yǎng)基成分達到要求水平。
它與現(xiàn)有大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基K8P、MS、B5、MSB和1/2MSB等相比較具有以下優(yōu)點大豆根瘤產(chǎn)物-天冬酰胺、谷氨酰胺、尿囊素和尿囊酸等酰尿有機態(tài)氮化合物，不僅是大豆未成熟子葉原生質(zhì)體及其再生細胞的良好氮源;這些酰尿可高效率地釋放出大量的還原態(tài)氮，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的NH+4.NO-3比，PH和滲透壓等，有利于大豆原生質(zhì)體及其再生細胞的生化代謝，明顯提高分裂頻率，保持胚性、高頻率形成胚性愈傷組織。該愈傷組織在體細胞分化培養(yǎng)基上直接分化出體細胞胚，并進一步誘導(dǎo)出正常植株。
使用一種新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基，最好先用大豆未成熟子葉(開花后2-3周、未成熟種子大小為成熟種子1/4左右)進行組織培養(yǎng)，篩選出體細胞胚分化能力強的基因型。取用分化能力最佳，并其生育期和生理狀態(tài)好的未成熟豆莢，4℃低溫處理48小時。然后用洗潔精洗凈豆莢，再以70%酒精消毒15秒，滅菌水沖洗2次，在無菌條件下取其未成熟種子，剝皮去胚后切碎，懸浮于0、5%纖維素酶(Onozuka RS)、0.05%果膠酶Y-23、0.7M甘醇、0、3M山梨醇組成的酶液中(0.45μ濾過滅菌)，在26℃，40～50rpm條件下，振蕩處理4-5小時，酶解后用miracloth(USA CA92037)過濾，靜置30分鐘后，100×g離心收集原生質(zhì)體，再用洗液(0.7M甘露醇、0.3M山梨醇組成)在100×g離心洗凈原生質(zhì)體，密度調(diào)整為3×105cells/ml，加入3倍的無Ca2+、Mg2+和激素，含0.25%Gelrite的ZSP培養(yǎng)基，混勻后滴入盛有0.9%MgSO4·7H2O、0.4%Cacl2.2H2O和0.6M甘露醇溶液(PH5.8)的培養(yǎng)皿中(φ6cm培養(yǎng)皿中滴入30滴)，每滴立即形成φ3～4mm的包埋原生傳質(zhì)的珠狀體(稱Gelrite bead)，靜置1～2分鐘后除掉珠狀體以外的溶液，注入2-3mlZSP培養(yǎng)基，用石蠟?zāi)っ芊猓?5℃、黑暗下靜置培養(yǎng)，形成肉眼能見到的細胞團后，換新的ZSP培養(yǎng)基(滲透壓560mOSMOL/kg)，以80rpm振蕩培養(yǎng)，加速胚性愈傷組織的形成。
權(quán)利要求
一種新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基根據(jù)大豆氮代謝特點，以大豆根瘤產(chǎn)物為主要氮源制成。大豆根瘤產(chǎn)物中的天冬酰胺、谷氨酰胺、尿囊素和尿囊酸等酰尿有機態(tài)氮化合物為培養(yǎng)基的主要氮源。1、培養(yǎng)基成分組成及其配方；(1)培養(yǎng)基成分組成(A) 成分 含量(mg/l) NH4NO340 KNO3950 KH2PO485 H3BO36.2 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 MgSO47H2O 185 CaCl2·2H2O 220 KI 0.83 煙酸 0.5 鹽酸吡哆醇 0.5 鹽酸硫銨素 0.1 甘氨酸 2 肌醇 100 Na2-EDTA 37.3 FeSO4·7H2O 27.8 庶糖 15，000 甘露醇 80；000 2,4-D 0.1 BA 1pH 5.8滲透壓 560～580mOSMOL/kg(B) 成分 含量(mg/l)天冬酰胺 60 谷氨酰胺 60 尿囊素 60 尿囊酸 60 鹽酸硫銨素 0.6Casamino acid 125(2)培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基成分中的A部分調(diào)制后，以0、01NKOH調(diào)PH為5、8，用甘露醇調(diào)整滲透壓為580mOSMOL/kg，在0、11mPa下滅菌15分鐘，冷卻后在無菌條件下，濾過滅菌(0、45μ)添加B部分，使培養(yǎng)基成分達到要求水平。
2.一種新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基，特征還在于，1(2)所述的以濾過滅菌將大豆根瘤產(chǎn)物(天冬酰胺、谷氨酰胺、尿囊素和尿囊酸等)B部分添加于A部分后，還能逐漸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的NH+4.NO-3比、PH和滲透壓等。
全文摘要
一種新的(ZSP)大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)基屬生物技術(shù)領(lǐng)域。能解決大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)成胚性愈傷組織的技術(shù)問題。該培養(yǎng)基的特征是以大豆根瘤產(chǎn)物的酰尿為主要氮源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NH該培養(yǎng)基適于培養(yǎng)大豆等豆科植物未成熟子葉原生質(zhì)體，通過胚性愈傷組織，經(jīng)胚胎發(fā)生途徑誘導(dǎo)植株再生。是大豆細胞工程和基因操作的重要基礎(chǔ)技術(shù)。
文檔編號C12N5/04GK1083525SQ9211037
公開日1994年3月9日 申請日期1992年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月3日
發(fā)明者張賢澤 申請人:東北農(nóng)學(xué)院