專利名稱：一種草莓原生質體的提取及融合方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物品種改良技術領域，即一種草莓原生質體的提取及融合方法。
背景技術：
草莓屬薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)植物，多年生草本果樹，它的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值很高，栽種范圍廣。20世紀80年代以來草莓生產(chǎn)就有了迅速的發(fā)展，我國草莓生產(chǎn)上的多數(shù)品種引自國外，品種混雜，且普遍存在抗性差及品質下降等問題，真正適合我國不同氣候條件栽培的品種不多，這就迫切需要選育適宜我國栽培的優(yōu)良品種。目前，國內(nèi)外草莓育種主要集中在草莓的莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、體細胞突變體篩選、草莓基因工程、草莓的細胞懸浮培養(yǎng)、草莓的原生質體培養(yǎng)及細胞融合等，應用現(xiàn)代生物技術是草莓品種改良的重要手段。我國在草莓現(xiàn)代生物技術育種研究的某些方面(如單倍體植株的獲得，轉化植株的再生等)處于國際先進水平，而不少方面與國外同行相比存在較大差距，抗性體細胞突變體篩選、原生質體培養(yǎng)以及草莓的基因轉化研究尚屬空白。隨著草莓組織培養(yǎng)技術的進一步完善和生物技術的發(fā)展，解決氣候、凍害、蟲害的問題將更有希望。原生質體操作是現(xiàn)代生物技術領域中的重要組成部分，為草莓育種工作開辟了一條新的途徑。通過原生質體融合可以產(chǎn)生種、屬間的雜種，從而克服遠緣雜交障礙，另外，原生質體還可以用來分離和純化突變體。草莓遺傳上的高度雜合性、染色體多倍性和豐富的野生草莓資源，使得原生質體操作成為草莓育種的一種重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立高效的草莓原生質體分離、融合技術體系，以提高原生質體活力，融合效率，為草莓新品種培育提供技術支撐的草莓原生質體的提取及融合方法。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種草莓原生質體的提取及融合方法，其特征在于步驟如下(1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，或者暗培養(yǎng)一周；所述的MS培養(yǎng)基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. 0-1. 5mg/L,蔗糖 1-1. 5%和瓊脂 0. 7% ；(2)取步驟(1)預處理的葉片剪成細條并去除葉脈；所述細條為2. OmmX 2. 0mm。(3)將材料與酶液按照1 10體積比混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在恒溫、速度60r/min條件下進行暗酶解，時間ll_14h，并定時鏡下觀察酶解情況；所述的酶液組成為1. 0-2. 0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5-1. 0%果膠酶 Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的CaCl2的組合。(4)分別將酶解完全的綠葉東方草莓和盧比草莓的葉肉原生質體懸浮液分別經(jīng) 200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，離心、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在2ml0. 2mol/L的CaCl2中，用移液器向離心管底部緩緩注入質量濃度為20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用6ml 0. 2mol/L的CaCl2懸浮(去除雜質，純化)；所述定時鏡下觀察酶解情況為酶液消化7小時后，每隔一小時在倒置顯微鏡下觀察。所述取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體，是用移液器吸出管底的沉淀和蔗糖溶液及上部的CaCl2溶液。(5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)；原生質體濃度為0. 5 X IO5個/mL，六孔板滴加時每滴為0. lmL。(6)將兩種草莓的原生質體以1 1體積比混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，靜置lOmin，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；(7)吸取PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止lOmin，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率，向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；所述PEG 溶液組成為 30-45% PEG 6000+0. 3mM 葡萄糖 +8mM Cacl2+0. 7mMKH2P04, KOH 調(diào) pH 為 5. 8。所述高Ca2+，高 pH 洗液為 50mM CaCl2 · 2H20+0. 2M 甘氨酸，NaOH 調(diào) pH 為 9-10。本發(fā)的明優(yōu)點是本發(fā)明以草莓的葉片為研究材料，提供一種草莓原生質體分離及融合的最佳方法，通過前處理和酶解相結合的方式獲得高活力的原生質體，利用PEG結合高Ca2+，高pH法誘導兩者融合，提高了原生質體一對一相融合的概率。本方法作用溫和， 分離的原生質體活力在85%以上，一對一融合率最高可達到11.7%，操作簡便，具備了形成雜種細胞的可能，適合于克服遠源雜交障礙進行新品種的誘導及培育，在生物育種方面具有一定的意義。下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方式作進一步詳細描述。


圖1是初步得到雜質較多的原生質體圖。圖2是純化后得到的草莓原生質體圖。圖3是加PEG后聚集的原生質體圖。圖4是融合后的細胞形態(tài)圖。
具體實施例方式實施例1草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng) 10天，MS培養(yǎng)基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和瓊脂0. 7% ；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10體積比混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在恒溫，速度60r/min條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為1.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為14小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸浮；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1體積比混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置lOmin，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取30 % PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止lOmin，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率；向其中依次間隔 5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為90%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10.4%。參見圖1、2、3、4。實施例2草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng) 10天，MS培養(yǎng)基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. 5mg/L，蔗糖1. 5%和瓊脂0. 7% ；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為2.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+O. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為12小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸??；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取40 % PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為85%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10.7%。實施例3草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗在條件下暗培養(yǎng)一周；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為1.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為13小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸浮；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取45% PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為87%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為11.7%。實施例4草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗在條件下暗培養(yǎng)一周；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為2.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為11小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸??；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取45% PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為89%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10.8%。實施例5草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng) 10天，MS培養(yǎng)基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和瓊脂0. 7% ；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為1.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為13小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸??；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取30% PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為88%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10. 1%0實施例6草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng) 10天，MS培養(yǎng)基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和瓊脂0. 7% ；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為2.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為11小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸浮；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取40% PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為85%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10.9%。實施例7草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗在條件下暗培養(yǎng)一周；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為1.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為14小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸??；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取45% PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為91%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10%。實施例8草莓原生質體的提取及融合方法，步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗在條件下暗培養(yǎng)一周；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在^TC恒溫低速(60r/min)條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為2.0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為11小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/ min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸?。?)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5X105 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1的比例混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置IOmin左右，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取40% PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止IOmin左右，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率.向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為87%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為11.2%。
權利要求
1.一種草莓原生質體的提取及融合方法，其特征在于步驟如下(1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，或者暗培養(yǎng)一周；MS培養(yǎng)基為6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. 0-1. 5mg/L，蔗糖1-1. 5%和瓊脂0. 7% ；(2)取步驟(1)預處理的葉片剪成細條并去除葉脈；(3)將材料與酶液按照1 10體積比混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在恒溫、速度60r/min條件下進行暗酶解，時間ll_14h，并定時鏡下觀察酶解情況； 酶液組成為 1. 0-2. 0% 纖維素酶 Cellulase OnozukaR-lO+O. 5-1. 0 % 果膠酶 Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合；(4)分別將酶解完全的綠葉東方草莓和盧比草莓的葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，離心、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在anl 0. 2mol/L的CaCl2中，用移液器向離心管底部緩緩注入質量濃度為20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用6ml 0. 2mol/L的CaCl2懸浮；(5)原生質體的活力測定采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)；(6)將兩種草莓的原生質體以1 1體積比混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6 孔板內(nèi)，靜置lOmin，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；(7)吸取PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止 lOmin，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率，向其中依次間隔5min加入高 Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程。
2.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟( 所述細條為 2. OmmX 2. 0_。
3.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟C3)所述定時鏡下觀察酶解情況為酶液消化7小時后，每隔一小時在倒置顯微鏡下觀察。
4.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(4)所述取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體，是用移液器吸出管底的沉淀和蔗糖溶液及上部的 CaCl2溶液。
5.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(6)所用原生質體濃度為0. 5 X IO5個/mL，六孔板滴加時每滴為0. lmL。
6.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(7)所述 PEG 溶液組成為 30-45% PEG 6000+0. 3mM 葡萄糖+8mM Cacl2+0. 7mMKH2P04，KOH調(diào) pH 為 5. 8。
7.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(7)所述高 Ca2+，高 pH 洗液為 50mM CaCl2 · 2H20+0. 2M 甘氨酸，NaOH 調(diào) pH 為 9-10。
8.根據(jù)權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征在于酶液組成為 1. O %纖維素酶 Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果膠酶 PectolyaseY-23+O. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+O. 05mol/L 的 CaCl2 的組合。
9.根據(jù)權利要求1-8任一所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征步驟如下1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，MS培養(yǎng)基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和瓊脂0. 7% ；2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2.OmmX 2. Omm大小細碎的小條并去除葉脈；3)將材料與酶液按照體積比1 10混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在恒溫，速度60r/min條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為1. 0%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果膠酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的組合，酶消化時間為14小時；4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經(jīng)200目尼龍紗網(wǎng)過濾后，600R/min 的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在aiil 0. 2mol/L的 CaCl2中.用移液器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用3ml 0. 2mol/L的CaCl2懸浮；5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數(shù)，調(diào)整原生質體密度為 0. 5 X IO5 個/mL ；6)將兩種草莓的原生質體以1 1體積比混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6 孔板內(nèi)，每滴為0. lmL，靜置lOmin，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態(tài)；7)吸取30%PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止lOmin，觀察原生質體的聚集現(xiàn)象，并統(tǒng)計聚集體所占百分率；向其中依次間隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為90%，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10. 4%。
全文摘要
本發(fā)明是以草莓的葉片為研究材料，提供一種草莓原生質體分離及融合的最佳方法，通過前處理和酶解相結合的方式獲得高活力的原生質體，利用30-45％PEG 6000結合高Ca2+，高pH的方法誘導兩者融合，提高了原生質體一對一相融合的概率，本方法作用溫和，分離的原生質體活力在85％以上，一對一融合率最高可達到11.7％，操作簡便，具備了形成雜種細胞的可能，適合于克服遠源雜交障礙進行新品種的誘導及培育，在生物育種方面具有一定的意義。
文檔編號C12N5/04GK102505004SQ201110315610
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權日2011年10月18日
發(fā)明者馮穎, 朱俊義, 楊麗娟, 顧地周 申請人:通化師范學院